专利名称：座囊霉菌区域选择性催化桦木醇制备桦木酮醇的方法
技术领域：
本发明属于天然产物及生物催化应用领域，具体涉及一种利用座囊霉菌催化桦木醇区域选择性氧化制备桦木酮醇的方法。
背景技术：
桦木醇是一种羽扇烷类五环三萜类化合物，具有抗炎及抗病毒等活性，并且显示出与以往药物不同的作用机制，对肿瘤细胞具有一定的细胞毒性(林产化学与工业， 2009，29(1) : 87-90)。尽管如此，较低的生物活性及选择性等阻碍了其在临床上的应用。为此，以桦木醇为先导化合物，对其进行结构修饰以提高其生物活性成为了近年来的研究热点(Natural Product Reports, 2006, 23, 394 - 411)。样木酮醇是样木醇中的3-轻基经氧化后得到的衍生物。大量研究表明，桦木酮醇的生物活性远高于桦木醇。例如，桦木酮醇对肺癌NSCLC-N6细胞的毒性远高于桦木醇(Phytochemistry, 2004, 65: 1159 - 1164)；桦木醇的3-羟基经氧化修饰后，明显增强了其诱导小鼠黑素瘤细胞分化活性(J. Nat.Prod. 2002, 65，645-648)。同时桦木酮醇也是制备具有重要应用价值的异构桦木酮醇(allobetulone)的关键合成砲块(Molecules, 2011, 16: 2443-2466)。尽管许多植物如大柄冬青(/7macropoda )及红树林植物瓶花木
等中含有桦木酮醇(热带亚热带植物学报，2007，15(3): 249-252;Archives of Pharmacal Research, 2002, 25: 617-620),但其含量甚低，极大地限制了该化合物的研究与应用。因此，必须开发简便的大规模制备桦木酮醇的新技术及新工艺。桦木醇是桦木酮醇的生物合成前提物，在植物中含量较高，尤其是在白桦树皮中其含量高达25%。故以廉价、易得的桦木醇为原料，通过化学/生物催化法制备桦木酮醇是一条具有巨大应用潜力的合成路线。在桦木醇分子中有三个活性官能团(3-羟基，28-羟基及C2tl-C29双键)，由于化学法的选择性较差，故如想对其中的3-羟基进行选择性氧化修饰时，通常需要繁琐的保护及脱保护步骤，并且通常需要使用化学计量的、环境不友好的氧化剂CrO3和KMnO4等。尽管利用生物催化与生物转化手段能有效避免化学法的上述缺点，但28-羟基为伯羟基，而3-羟基为仲羟基，前者空间位阻相对较小，故前者通常比后者活泼，更易被修饰；事实上，目前已报道的生物催化剂也只能催化28-羟基氧化及环上其他位点的羟基化反应(Process Biochemistry 2011, 46: 1-15; Enzyme and Microbial Technology, 2009,45: 175-180; Journal of Applied Microbiology, 2011, 110: 90-97),仍无法实现低活性的3-羟基的区域选择性氧化。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种利用座囊霉菌为催化剂，催化桦木醇区域选择性氧化合成桦木酮醇的方法。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种利用座囊霉菌区域选择性催化桦木醇制备桦木酮醇的方法，具体步骤如下
(I )座囊霉菌经活化后，接种至含有3 g/L氯化钠的土豆培养基中，在28°C、160 r/min下培养3天；
(2)加入桦木醇和二甲基亚砜，在23 43 0C ,160 r/min下；反应I 7天，过滤除去菌体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，在真空下旋转蒸发除去溶剂，得到产物桦木酮醇。
所述座囊霉菌优选sp. HQ 316564,该生物材料已被文献丛生盔形珊瑚共附生可培养真菌多样性分析，微生物学通报，2011，38(8): 1193 1198报道。步骤(I )所述土豆培养基的初始pH优选为4. O 7. O。所述二甲基亚砜的浓度优选为O. 2 I. 0% v/v。所述等体积是指与滤液体积相等。所述接种至含有3 g/L氯化钠的土豆培养基中，优选在生理盐水中配置浓度为IX IO7个孢子/mL的种子液，随后将I mL种子液加入100 mL含有3 g/L氯化钠的土豆培
养基中。本发明与现有的技术相比具有如下的优点
I)利用座囊霉菌sp. HQ 316564细胞作为催化剂能高区域选择性地催化桦木醇中空间位阻较高、活性较低的3-位仲羟基氧化，而不催化空间位阻较低、活性较高的28-位伯羟基发生氧化反应。2)本生物催化工艺避免了化学法选择性不高、需费时耗力的保护与脱保护步骤等缺点。3)本生物催化工艺具有反应条件温和、环境友好等特点。
图I桦木醇转化为桦木酮醇的反应式。
具体实施例方式通过实施例进一步说明本发明。实施例I
座曩舅MDothideomycete sp. HQ 316564在含3g/L氯化钠的土豆葡萄糖琼脂培养基上(pH 7. O)于28 ° C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液(I X IO7个孢子/mL)，随后将I mL种子液加入100 mL含有3 g/L氯化钠的pH 6. 5的土豆培养基中，在28 ° C、160 r/min下培养3天；随后加入10 mg桦木醇和O. 4%(v/v)二甲基亚砜作为助溶剂,在28° C、160 r/min下反应；反应6天后，过滤除去菌体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，在真空条件下旋转蒸发除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入一定量的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为12. 7%，桦木醇转化为桦木酮醇的反应式如图I所示。实施例2
座曩舅MDothideomycete sp. HQ 316564在含3g/L氯化钠的土豆葡萄糖琼脂培养基上(pH 7. O)于28 ° C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液(I X IO7个孢子/mL)，随后将I mL种子液加入100 mL含有3 g/L氯化钠的pH 6. O的土豆培养基中，在28 ° C、160 r/min下培养3天；随后加入10 mg桦木醇和O. 4%(v/v)二甲基亚砜作为助溶剂,在28° C、160 r/min下反应；反应6天后，过滤除去菌体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，在真空条件下旋转蒸发除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入一定量的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正 曲线计算得到产率为15. 1%。实施例3
座曩舅MDothideomycete sp. HQ 316564在含3g/L氯化钠的土豆葡萄糖琼脂培养基上(pH 7. O)于28 ° C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液(I X IO7个孢子/mL)，随后将I mL种子液加入100 mL含有3 g/L氯化钠的pH 6. O的土豆培养基中，在28 ° C、160 r/min下培养3天；随后加入10 mg桦木醇和O. 6%(v/v)二甲基亚砜作为助溶剂,在33° C、160 r/min下反应；反应6天后，过滤除去菌体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相、旋干除去溶剂，再用一定量的甲醇溶解残余固体，离心后利用液相色谱测定产物浓度，计算得到产率为16. 1%。实施例4
座曩舅MDothideomycete sp. HQ 316564在含3g/L氯化钠的土豆葡萄糖琼脂培养基上(pH 7. O)于28 ° C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液(I X IO7个孢子/mL)，随后将I mL种子液加入100 mL含有3 g/L氯化钠的pH 6. O的土豆培养基中，在28 ° C、160 r/min下培养3天；随后加入10 mg桦木醇和O. 4%(v/v)二甲基亚砜作为助溶剂,在33° C、160 r/min下反应；反应4天后，过滤除去菌体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，在真空条件下旋转蒸发除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入一定量的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为22. 5%。实施例5
座曩舅MDothideomycete sp. HQ 316564在含3g/L氯化钠的土豆葡萄糖琼脂培养基上(pH 7. O)于28 ° C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液(I X IO7个孢子/mL)，随后将I mL种子液加入100 mL含有3 g/L氯化钠的pH 6. O的土豆培养基中，在28 ° C、160 r/min下培养3天；随后加入10 mg桦木醇和O. 4%(v/v)二甲基亚砜作为助溶剂,在33° C、160 r/min下反应；反应6天后，过滤除去菌体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，在真空条件下旋转蒸发除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入一定量的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为24. 9%。产物桦木酮醇经过核磁共振检测的NMR数据
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.94 (s, 3H, H25), 1.00 (s, 3H, H27), 1.03 (s, 3H,H24), 1.07 (s, 3H, H26), 1.08-1.12 (s, 3H, H23; m, 1H, H22a, overlap), I. 19-1.46(m, 13H, Hla +H5 +H6a, b +H7a, b +H9 +Hlla, b +H12a + H15a +H16a +H21a), I. 58-1. 76 (s, 3H,H30; m, 4H, H12b + H13 +H 15b +H18, overlap) 1.85-1.95 (m, 4H, Hlb + H16b +H21b+H22b), 2. 37-2. 54 (m, 3H, H2 + H19), 3. 36 (d, 1H, J = 10. 8 Hz, H28a), 3. 81 (d, 1H,J = 10. 8 Hz, H28b), 4. 60 (br s, 1H, H29a), 4. 69 (d, 1H, / = I. 6 Hz, H29b) ; 13C NMR(100 MHz, CDCl3) : δ 14.89 (C27), 16 . 00 (C26), 16.14 (C25), 19.30 (C30), 19.87(C6), 21.23 (C24), 21. 58 (C11), 25. 45 (C12), 26. 85 (C23), 27. 26 (C15), 29. 35 (C16),29.97 (C21), 33. 74 (C7), 34. 17 (C22), 34. 32 (C2), 37.08 (C10), 37.64 (C13), 39.81(C1), 41.08 (C8), 42.99 (C14), 47. 53 (C4), 47.98 (C17, C19), 48.92 (C18), 49.96(C9), 55.14 (C5), 60.70 (C28), 109.94 (C29), 150.59 (C20), 218.30 (C3)。对比桦木醇与桦木酮醇的1H及13C数据可以清晰地发现3-羟基上发生了氧化反 应，而28-0H仍保留。例如，反应后，产物的3-羟基氢的化学位移消失，28-羟基氢的化学位移未发生变化(3. 34 F5. 3. 35 ppm);而反应后，C3的化学位移由79. 22升高至218. 30ppm,而C28的化学位移几乎未发生变化(60. 70 vs. 60. 80 ppm)。
权利要求
1.一种利用座囊霉菌区域选择性催化桦木醇制备桦木酮醇的方法，其特征在于，具体步骤如下 (I )座囊霉菌经活化后，接种至含有3 g/L氯化钠的土豆培养基中，在28°C、160 r/min下培养3天； (2)加入桦木醇和二甲基亚砜，在23 43 0C ,160 r/min下；反应I 7天，过滤除去菌体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，在真空下旋转蒸发除去溶剂，得到产物桦木酮醇。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述座囊霉菌为sp.HQ316564。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述土豆培养基的初始pH为4.0 7. O。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述二甲基亚砜的浓度为0.2 1.0%v/Vo
全文摘要
一种利用座囊霉菌区域选择性催化桦木醇制备桦木酮醇的方法。具体包括如下步骤(１)座囊霉菌经活化后，接种至含有3g/L氯化钠的土豆培养基中，在28℃、160r/min下培养3天；(２)加入桦木醇和二甲基亚砜，在23~43℃、160r/min下；反应1~7天，过滤除去菌体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，在真空下旋转蒸发除去溶剂，得到产物桦木酮醇。本发明具有区域选择性高、反应条件温和、环境友好等优点。
文档编号C12P33/00GK102634560SQ20121010512
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者刘欢, 宗敏华, 李宁 申请人:华南理工大学