专利名称：一种空化气泡介导的细胞激光转染方法
技术领域：
本发明属于外源物的细胞转染技术领域，涉及一种空化气泡介导的细胞激光转染方法。
背景技术：
基因工程技术广泛地应用于食品、医药卫生、农业、工业、环境保护与治理等领域，给人类带来了一定的社会和经济利益。尤其是采用基因技术，把正常的功能基因导入靶细胞来修复有缺陷的组织的基因治疗为人类社会带来了福音。90年代初期，随着世界首例腺苷脱氨酶缺乏性重症免疫缺陷病的治疗取得成功，基因治疗开始进入临床应用阶段，它在肿瘤，遗传疾病以及传染病等治疗中存在的潜力也越来越受到人们关注。把外源基因转导入体外培养的细胞中并实现表达的基因转染技术是基因工程的核心技术，也是制约基因治疗发展的瓶颈之一，安全高效并且能应用于各类细胞的基因转染方法将有力促进基因治疗 的发展。现存在很多基因转染方法，比如病毒介导法、物理方法、化学方法、融合法等，但这些方法由于存在安全性、转染效率、操作复杂等问题而在基因治疗中受到局限(Ning-SunYang, “Gene transfer into mammalian somatic cel Is，，· Critical Reviews inBiotechnology. Vol. 12(4) :335-356, 1992)。科学家们在探索一种普遍适用、安全高效、稳定表达的基因转染方法时把关注的目光投向了激光技术，由于激光能量的空间分布能够精确控制以及它的非接触性，无污染性，无细胞毒性，能够通过光纤导入体内等优点，以光纤为辅助手段的激光转染技术将有可能应用于在体基因治疗。二十世纪八十年代，以激光为基本手段的基因转染方法(激光转染法)开始受到人们的关注，早期的研究只局限于微光束注射法(MiciOinjection)，或者其它改进的方法(Kurata S，Tsukakoshi M, Kasuya T, Ikawa Y, “The laser method for efficientintroduction of foreign DNA into cultured cells，，.Exp Cell Res. Vol. 162 (2)372-378,1986 ；Tirlapur UK, Konig !(,“Targeted transfection by femtosecondlaser”. Nature Vol. 418(6895) :290-291, 2002)。然而，由于这种方法一次只能处理一个细胞，效率很低，且细胞的死亡率较高，所以这种方法不适合对大量的细胞进行基因转染。另一方面，在此方法的操作过程中，需要用到诸如显微镜，光镊等精密仪器，有的方法中也用到了非常昂贵的飞秒激光器。因此这种方法至今还没有得到广泛的应用。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种空化气泡介导的细胞激光转染方法，利用激光照射光吸收性纳米金粒子，在粒子周围产生空化气泡，从而使细胞膜通透性增加，这样方法对细胞类型无特殊要求，且进行大面积、无污染性、无细胞毒性的外源物的细胞转染。本发明是通过以下技术方案来实现一种空化气泡介导的细胞激光转染方法，包括以下步骤
I)光吸收性纳米颗粒与能吸附宿主细胞的抗体的结合在低或高于抗体等电点O. 5 I的条件下，将抗体和光吸收性纳米颗粒混合，充分震荡后离心，然后将去掉上清液和最底部的剩余部分重悬，经过2 3次离心与重悬的操作后，收集最后一次离心所得絮状物得到光吸收性纳米颗粒与抗体的结合物；2)通过抗体对细胞的识别，将光吸收性纳米颗粒吸附在宿主细胞上将光吸收性纳米颗粒与抗体的结合物和待转染的外源物加入到宿主细胞的悬浮溶液中，充分混匀，其中宿主细胞和光吸收性纳米颗粒的个数比为I : IXlO2 IXlO5;3)空化气泡介导的转染 将步骤2)得到的混合物在搅拌条件下，用激光下进行照射，光吸收性纳米颗粒在激光的照射下产生空化气泡，介导外源物质转染到宿主细胞中；4)转染后培养转染完成后，将宿主细胞取出，放入到相应的培养基中在细胞培养箱中培养。所述的光吸收性纳米颗粒为纳米金微粒。所述的纳米金微粒采用以下方法制备柠檬酸钠法、硼氢化钠法、EDTA法、Schiffrin法或气相沉积法。所述的激光的脉宽为2 10ns，光斑的直径为2 5mm，激光脉冲的频率可调。所述的激光脉冲的频率包括IOmW功率的5个脉冲和15mW功率两个脉冲。所述的光吸收性纳米颗粒的粒径为30nm ;所述的激光的波长为532nm。所述的激光由Q-开关双倍频Nd: YAG激光器发出。所述的低或高于抗体等电点O. 5 I的条件是用浓度O. lmol/L K2CO3和/或O. lmol/L HCl进行调节而得到的。所述的待转染的外源物为具有活性的化合物、染料、蛋白质、多糖、寡居核苷酸链、质粒载体中的一种或几种。所述的抗体和纳米金混合时，其混合比例的确定为是将光吸收性纳米颗粒与系列梯度浓度的抗体溶液混合，然后加入质量浓度为10%的NaCl溶液，根据颜色的变化来确定。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的空化气泡介导的激光转染方法，采用激光照射光吸收性纳米粒子，使纳米粒子周围产生空化气泡，导致细胞膜产生暂时通透性，从而将外源物转染到细胞内。由于激光具有非接触、无污染、无细胞毒性，实现安全的基因转染方法，并且是通过空化气泡产生从而导致细胞膜通透性，是一种物理方法，所以能够实现任何类型细胞的转染，而且能够大面积处理，而且不需要使用特殊的、昂贵的、精密的仪器。本发明提供的空化气泡介导的激光转染方法，采用激光照射光吸收性微粒诱导空化气泡，其特点在于具有靶向性，只有特异性结合了纳米金的细胞被激光照射后才能产生空化气泡，进而实现转染成功；而没有结合纳米金的细胞不会被转染成功，因此不需要特异性的筛选。本发明提供的空化气泡介导的激光转染方法，其外源物可以是各种大于IOKD的分子，包括药物、化合物、染料、蛋白质、多糖、寡居核苷酸链、质粒载体、DNA质粒等。本发明提供的空化气泡的激光转染方法，转染效率高的物理转染方法，在空化气泡产生后直接使细胞膜的通透性暂时性提高，从而使外源物质没有细胞膜的阻挡直接进入细胞。对不同质量的分子进行的细胞内转染结果表明均有高的转染率比如，IOKDol的荧光葡聚糖转入率达68%以上，150KDol抗体转入率达到75%以上，增强型绿色荧光蛋白DNA质粒的转入率达到20%以上。其中细胞的死亡率最高为20%。
图I为Karpas299细胞与30nmACTl金微粒结合体经IOmW能量不激光照射后转染率，其中图1-1为未照射对照组，图1-2为5次脉冲照射； 图2为Au30_BerH2标记的Karpas 299细胞在不同功率的纳秒脉冲照射后MIBl-Alexa 488的转入效率和细胞死亡率统计结果；图3为对细胞(Karpas299)进行EGFP质粒载体转染后的细胞表达了绿色荧光蛋白后的荧光照片。
具体实施例方式本发明提供的空化气泡介导的激光转染方法，利用激光照射光吸收性特别强的纳米粒子，把纳米粒子通过特异性配体和受体结合到特定细胞上，在被激光照射后，纳米粒子周围就会产生空化气泡。空化气泡的产生就会导致细胞膜的暂时通透，从而将外源物质转入。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。I、选择合适的纳米粒子主要是选择激光照射光吸收性强的纳米粒子，具体选择纳米金微粒。纳米金微粒以其独特的光学性质，易控的表面化学能力，在基于生物成像和诊断的分子生物学和医学领域中引起越来越广泛的关注。尤其是金纳米微粒的表面等离子体共振(SPR)等强吸收和发光特性，在生物组织成像，癌症的诊断和治疗中存在着巨大的应用前景。因此选用纳米金微粒为光吸收性微粒，用于诱导空化气泡的产生。目前合成纳米金的方法有制备胶体金的方法有柠檬酸钠法、硼氢化钠法、EDTA法、Schiff rin法和气相沉积法等，制备几个纳米的胶体金宜用硼氢化钠法、EDTA法和Schiff rin法,制备几十个纳米的胶体金可采用朽1檬酸钠法。当然也可以商购现有的纳米金颗粒，具体的在实施例中采用的纳米金是从英国BBI公司购买的商用纳米金，这样能保证纳米金的质量和减小其他杂质对其的影响。2、纳米金与特异性抗体结合由于抗体是一种蛋白质，胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，当蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面后会形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态。pH值是胶体金与抗体结合的关键。如果胶体金的pH等于或低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。如果PH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合。一般认为，在蛋白质的等电点(PI)、略低或略高于等电点(O. 5 I)的条件下，二者易形成牢固的复合物。蛋白质的等电点可用浓度O. lmol/LK2C03、0. lmol/L HCl进行调节。由于胶体金可能会损害pH值测定计的电极,一般用精密的pH试纸测定pH值,也可用玻璃探头的PH测定计进行测定。蛋白质等电点的测定方法有滴定法和等电聚焦电泳法。由于等电点聚焦(IEF)方法消耗抗体最少，且较精确，因此为较为常用。等电点聚焦法是在稳定的PH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。利用各种蛋白质的等电点不同，在电泳支持物中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在PH梯度凝胶中泳动，当迁移至其PI的pH处，则不再泳动，而浓缩成狭窄的条带。通过确定狭带处的PH值，便可知蛋白质的等电点。 通过完成等电聚焦电泳法的一系列实验步骤，可得到显色胶条。显色后条带宽度O. 4cm，条带为靠近右端的两黑点中间。而实施例具体采用ACTl抗体，采用上述方法检测后确定抗体等电点为7. 875，因此其与纳米金颗粒的结合选择8. 4左右为最佳结合pH。2. IACTl抗体与纳米金的结合将从BBI公司购买的30nm的纳米金稀释100倍，取IOOml纳米金加入浓度为IOOmM的K2CO3溶液10 μ 1，振荡10分钟测试PH值为8. 4左右。然后取PH值为8. 4的纳米金溶液50 μ I中加入5 μ I (2mg/ml)购买的ACTl抗体，混合振荡15到20分钟。2. I. I抗体与纳米金的比例的确定具体的操作为如下，首先做以下设定Al :50 μ I PH值为8. 4的纳米金溶液(Au)Α2 :Α1+5 μ I (2mg/ml)的 ACTl 抗体给Al和A2分别加入5 μ I浓度为质量浓度为10%的NaCl溶液，可以观察到Al为蓝色，Α2保持红色。红色说明加入了过量的抗体。配备一定的浓度梯度可以确定最佳的抗体、蛋白质结合率。设定:G1* 100 μ I Au+10 μ IACTl ;G2_G6 :90 μ I Au ；取10 μ I Gl*+G2 — G2*、取 10 μ I G2*+G3 — G3*、取10 μ I G3*+G4 — G4*、取 10 μ I G4*+G5 — G5*、取10 μ I G5*+G6 — G6*给Gl*—G6*分别加入10 μ I 10%的NaCl，观察发现G2*呈现红色，G3*呈现蓝色，说明G2*中的抗体过量而G3*中的抗体量不足，继续在G2*、G3*之间做浓度梯度，进行确定设定H1*:99 μ I Au+1 μ I ACTl ;Η2—Η4 :50 μ I Au取50 μ I Η1*+Η2 — Η2*、取 50 μ I Η2*+Η3 — G3*、取50 μ I Η3*+Η4 — G4*给Hl*—Η4*分别加入10 μ I 10%的NaCl，观察发现Η2*保持红色，H3*呈现蓝色。则基本确定100 μ I Au中加入O. 5 μ I的抗体是最合适的蛋白量。2. I. 2抗体与纳米金的结合操作按照最佳的蛋白量和纳米金混合震荡后，分装在6个不同的指形管中称重，精确到O. OOOlg，然后在4°C下采用2000转/秒的速度离心60分钟。离心后，去掉上清液，去除最底部的物质，加入相同量的缓冲液搅拌均匀，然后将缓冲液加到1ml，分配均匀，在4°C下采用4000转/秒的速度离心60分钟。去掉上清液和固体部分，取出絮状物放入另一个指形管，加入相同量的缓冲液。然后再次加入缓冲液到lml，再次离心，采用与第二次离心的相同条件。同样取出絮状物，加入相同量的缓冲液，放入冰箱中，等使用前最后一次离心后，得到纳米金颗粒和抗体的结合物，测量OD值，就可以进行实验使用。其中的缓冲液为22. 9ml O. 2M Tris (三羟甲基氨基甲烷)+0. IN HC1+52. Iml蒸馏水 +Ig BSA03、通过抗原抗体把纳米金固定在细胞上将结合有抗体的纳米金微粒、待转染的外源物加入到作为宿主的细胞悬浮溶液中混匀；抗体与细胞表面的抗原通过抗原抗体反应而结合，从而将纳米金固定在细胞上。具体选用的是白血病细胞系Karpas 299，这是一种悬浮细胞，通常的转染方法对悬浮细胞的转染效果都不是很好。具体的选用了三种外源物质异硫氰酸突光素葡聚糖(FITC-dextran), MIBl细胞核抗体以及增强型绿色荧光蛋白质粒载体。这些物质在通常情况下是不会进入细胞的。选用的细胞浓度为4X106cells/ml，细胞和纳米金微粒的比例为I :1X104。通常情况下外源物质的加入量每4 μ I细胞溶液加入I μ I浓度为I μ M的外源物质。4、激光照射通过空化气泡的产生进行细胞转染将上述待转染的外源物和结合有纳米金微粒的细胞的混合物转移到样品池中，样品池的玻璃上有18个小孔,每个小孔的容量为4 μ I,小孔的直径为2_。选择合适波长的激光进行照射由于采用的是30nm的纳米金作为光吸收性微粒用来诱导空化气泡，因此选用了波长为532nm的Q-开关双倍频Nd: YAG激光器。脉宽为6ns，脉冲的频率可以人为控制，光斑为直径为2mm。在室温下分别采用IOmW功率的5个脉冲和15mW功率两个脉冲就可以诱导空化气泡的产生，从而使外源物质转入，在激光照射过程 中不需要搅拌。如图I所示的Karpas299细胞与30nmACTl金微粒结合体经激光照射后的转染率，其中1-1为未照射对照组，1-2为IOmW能量5脉冲激光照射后的转染率，可以看到经激光照射诱导后，转染率具有明显的提升。如图2所示的Au30_BerH2标记的Karpas 299细胞在不同功率的纳秒脉冲照射后MIBl-Alexa 488的转入效率和细胞死亡率统计结果；可以看到在10 20mW范围内照射均能够得到较好的转染率。5、转染后培养激光照射之后,将细胞从样品池中取出再次放入培养基中在细胞培养箱中培养。对于一般的外源物质，比如染料、抗体只需培养10分钟就可以进行测量。但是对于质粒载体，由于需要蛋白质的表达，需要培养24小时后进行观察。在此过程中，不需要选择性筛选。30nm纳米金结合ACTl抗体结合到Karpas 299细胞上,用激光对结合有纳米金的细胞进行照射。首先把异硫氰酸荧光素葡聚糖转染进细胞，最高效率达到68%左右。然后对分子量更大的抗体进行细胞转染，对转染效果进行测量；
最后，对Karpas 299细胞进行了增强型绿色荧光蛋白质粒载体的转染，并进行了 蛋白质表达，转染后的细胞发出绿色荧光，其结果如图3所示。
权利要求
1.一种空化气泡介导的细胞激光转染方法，其特征在于，包括以下步骤 1)光吸收性纳米颗粒与能吸附宿主细胞的抗体的结合 在低或高于抗体等电点O. 5 I的条件下，将抗体和光吸收性纳米颗粒混合，充分震荡后离心，然后将去掉上清液和最底部的剩余部分重悬，经过2 3次离心与重悬的操作后，收集最后一次离心所得絮状物得到光吸收性纳米颗粒与抗体的结合物； 2)通过抗体对细胞的识别，将光吸收性纳米颗粒吸附在宿主细胞上 将光吸收性纳米颗粒与抗体的结合物和待转染的外源物加入到宿主细胞的悬浮溶液中，充分混匀，其中宿主细胞和光吸收性纳米颗粒的个数比为I =IXlO2 IXlO5 ； 3)空化气泡介导的转染 将步骤2)得到的混合物在搅拌条件下，用激光下进行照射，光吸收性纳米颗粒在激光的照射下产生空化气泡，介导外源物质转染到宿主细胞中； 4)转染后培养 转染完成后，将宿主细胞取出，放入到相应的培养基中在细胞培养箱中培养。
2.如权利要求I所述的诱导空化气泡产生的激光转染方法，其特征在于，所述的光吸收性纳米颗粒为纳米金微粒。
3.如权利要求2所述的诱导空化气泡产生的激光转染方法，其特征在于，所述的纳米金微粒采用以下方法制备柠檬酸钠法、硼氢化钠法、EDTA法、Schiffrin法或气相沉积法。
4.如权利要求I所述的诱导空化气泡产生的激光转染方法，其特征在于，所述的激光的脉宽为2 IOns,光斑的直径为2 5mm,激光脉冲的频率可调。
5.如权利要求4所述的诱导空化气泡产生的激光转染方法，其特征在于，所述的激光脉冲的频率包括IOmW功率的5个脉冲和15mW功率两个脉冲。
6.如权利要求I 5任何一项所述的诱导空化气泡产生的激光转染方法，其特征在于，所述的光吸收性纳米颗粒的粒径为30nm ;所述的激光的波长为532nm。
7.如权利要求4所述的诱导空化气泡产生的激光转染方法，其特征在于，所述的激光由Q-开关双倍频Nd = YAG激光器发出。
8.如权利要求I所述的诱导空化气泡产生的激光转染方法，其特征在于，所述的低或高于抗体等电点O. 5 I的条件是用浓度O. lmol/L K2CO3和/或O. lmol/L HCl进行调节而得到的。
9.如权利要求I所述的诱导空化气泡产生的激光转染方法，其特征在于，所述的待转染的外源物为具有活性的化合物、染料、蛋白质、多糖、寡居核苷酸链、质粒载体中的一种或几种。
10.如权利要求I所述的诱导空化气泡产生的激光转染方法，其特征在于，所述的抗体和纳米金混合时，其混合比例的确定为是将光吸收性纳米颗粒与系列梯度浓度的抗体溶液混合，然后加入质量浓度为10%的NaCl溶液，根据颜色的变化来确定。
全文摘要
本发明公开了空化气泡介导的激光转染方法，利用激光照射光吸收性特别强的纳米粒子，把纳米粒子通过特异性配体和受体结合到特定细胞上，在被的激光照射后，纳米粒子周围就会产生空化气泡。空化气泡的产生就会导致细胞膜的暂时通透，从而将外源物质转入。由于激光具有非接触、无污染、无细胞毒性，实现安全的基因转染方法，并且是通过空化气泡产生从而导致细胞膜通透性，是一种物理方法，所以能够实现任何类型细胞的转染，而且能够大面积处理，而且不需要使用特殊的、昂贵的、精密的仪器。
文档编号C12N15/87GK102776237SQ20121019309
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者姚翠萍, 张镇西, 梅建生, 王晶 申请人:西安交通大学