专利名称：一种解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物保护领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) B293及其在防治草莓灰霉病、抑制草莓炭疽菌生长、抑制可可球二孢生长、抑制聚生小穴壳生长、抑制杨拟茎点霉菌生长、抑制不高双孢菌生长中的应用。
背景技术：
近年来，随着公众对食品和环境中化学农药安全性的普遍关注，以及一些危险性化学农药的禁用，促使人们寻求安全有效的植物病害控制新途径，利用有益微生物防治植物病害日趋受到重视。它是向被打破了的植物自然生态系中引入对植物有益的外源拮抗菌、或通过调节环境促使自然的有益微生物群体增长，并表现出生防活性，通过微生物之间的相互作用达到防病目的。目前，植物病害的生防已成为各国研究重点。 自然界潜在的微生物资源种类丰富，在微生物农药的产品开发方面有明显优势，因此世界各国都投入大量的人力和财力，研究、开发具有自主知识产权的新型微生物农药，并以此带动其他高科技产业的全面发展。我国也把微生物农药的研制和开发列为国家重点科技攻关和高新技术发展计划，江苏省政府也把微生物农药创制作为生物农业的一个重要组成部分。生物农药(biopesticides),按照Copping和Menn的定义包含了活体微生物(真菌、细菌和病毒)，昆虫植病线虫，植物源农药，微生物农药，微生物次生代谢物(抗生素)等，用于防治各种昆虫和病害，生物农药(特别是微生物农药)具有独特的优点是对人类健康威胁小，对环境安全，这正是全社会最关心的问题之一。因此，进入21世纪以来，各国政府和民众更加重视生物农药的开发和应用，已成为研究热点。微生物农药的特性赋予了农业可持续发展战略，为保护农业生态环境，保障食品安全提供物质基础和技术支撑；同时微生物农药产业也是未来经济中具有发展潜力的新增长点之一。研究微生物农药产业发展对于政府部门科学制定促进微生物农药产业发展的政策体系，实现农药产业结构调整，促进循环经济和可持续社会发展战略，保障我省经济建设和农业生态环境的协调发展，以及建设我省农产品安全体系等都将具有十分重要的理论意义和实践意义。草莓(Fragaria ananassa Duchesne)是一种集栽培和观赏于一体的宿根性、多年生草本资源植物。在草莓栽培区，灰霉病、炭疽病和黄萎病是阻碍草莓产业发展瓶颈。其中草莓灰霉病(Botrytis cinerea Pers. ex Fr.)的危害最严重,在每年的草莓生长期危害茎、叶柄、叶片，托叶，在后期危害花和果实，直接影响到草莓产量，造成很大经济损失。对该病害的传统防治大多采用化学药剂喷洒植株表面，造成土壤不同程度的农药残留和污染问题，影响产品质量和人们的身体健康。从保护生态环境和食品安全的角度出发，草莓生产需要有低毒、污染少，对人体安全的微生物制剂来控制草莓病害，已达到草莓安全食用的目的。也符合生物农业发展和政府、社会与生物农药产业的发展。
发明内容
发明目的为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种对草莓灰霉菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌。本发明的第二目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌在防治草莓灰霉病、抑制草莓炭疽菌生长、抑制可可球二孢生长、抑制聚生小穴壳生长、抑制杨拟茎点霉菌生长、抑制不高双孢菌生长中的应用。技术方案为了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案为一种多解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B293,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为CGMCC No. 6081，保藏日期为2012年04月28日。为了解决上述的第二目的，本发明所采用的技术方案为 所述的解淀粉芽孢杆菌在防治草莓灰霉病中的应用。所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制草莓炭疽菌生长中的应用。所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制可可球二孢生长中的应用。所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制聚生小穴壳生长中的应用。所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制杨拟茎点霉菌生长中的应用。所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制不高双孢菌生长中的应用。具体应用为将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B293接种于发酵培养基中，在28°C _35°C下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为菌剂。本发明中所述发酵培养基的配方为1000mL蒸馏水，牛肉膏2_5g，蛋白胨5-10g，氯化钠 4-5g，pH6. 5-7.5。本发明中所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B293的生理活性特征如下所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B293在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较大，乳白色，直径一般4-6_，表面隆起，干燥，有皱褶，边缘较规则，菌体杆状，两端钝圆，具周生鞭毛，大小为I. 59-4. 25X0. 60-0. 72 y m，平均2. 77X0. 67 iim ;芽孢两端生，椭圆形，大小为 0. 59-1. 01X0. 40-0. 61 u m，平均 0. 84X0. 50 u m0革兰氏染色表现为阳性；酪蛋白水解、淀粉水解、明胶液化为阳性，V. P反应可变，吲哚反应阴性；糖类产酸发酵。解淀粉芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID No. I所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定其为多解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。有益效果与现有技术相比，本发明的优点是(I)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B293对多种植物病原菌具有抑制作用，在拮抗细菌对植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的草莓灰霉病的防治具有重要意义；也是保证鲜食水果安全重要手段。(2)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B293培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
图Ia为本发明中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B293的形态图；图Ib为本发明中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293芽孢形态图(在一端或两端折光体)图2a为本发明中解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293对草莓灰霉菌 Botrytis cinera Pers. ex Fr.)的抑制作用(10 天)；图2b为本发明中解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293对草莓炭疽菌 Colletotrichum fragariae A. N. Brooks 的抑制作用(10 天)；图2c为本发明中解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293对可可球 二抱[Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & MaubI.的抑制作用(10 天);图2d为本发明中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293对聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)的抑制作用(10 天)；图2e为本发明中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293对杨拟莖点霉菌(Phomopsis sp.)的抑制作用(10天)；图2f为本发明中解淀粉芽抱杆菌Bacillus amyloliquefaciens B293对不高双抱菌[Apiocarpella macrospore (Speg.) H. &P. Syd]的抑制作用(10 天)；图3a为本发明中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293的防治试验(注两边的4株是用B289处理草莓；中间4株是对照处理)；图3b为本发明中解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293菌液处理
草莓植株。
具体实施例方式下面结合实验例详细阐述本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) B293 的应用。实验例I :解淀粉芽抱杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B293对草莓灰霉菌(Botrytis cinera Pers. ex Fr.)、草莓炭疽菌(Colletotrichum fragariaeA. N. Brooks)、可可球二抱[Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon&Maubl.]、聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)、杨拟莖点霉菌(Phomopsis sp.)和不高双抱菌[Apiocarpella macrospore (Speg.)H. &P. Syd]的平板抑菌作用。将用LB斜面活化的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293菌株划线接种于PDA平板一侧，再将草莓灰霉菌、炭疽菌和4种导致杨树溃疡的病菌(4种导致杨树溃疡的病菌为可可球二孢、聚生小穴壳、杨拟茎点霉菌和不高双孢菌)PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于平板另一侧。28土 1°C培养10天观察抑菌能力，并记录其宽度(如表1)，实验效果如图2a至图2f所示。试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293对6种病原菌均有拮抗作用，以占据培养皿的直径判断拟制效果，用无菌的PDA圆块作为对照。
表I B293对6种草莓和杨树病原菌10天的抑制作用
权利要求
1.一种解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) B293,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为=CGMCCNo. 6081，保藏日期为2012年04月28日。
2.权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌在防治草莓灰霉病中的应用。
3.权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制草莓炭疽菌生长中的应用。
4.权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制可可球ニ孢生长中的应用。
5.权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制聚生小穴壳生长中的应用。
6.权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制杨拟茎点霉菌生长中的应用。
7.权利要求I所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制不高双孢菌生长中的应用。
8.根据权利要求2至7中任ー项所述的应用，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) B293接种于发酵培养基中，在28 °C -35 °C下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为菌剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为=IOOOmL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6. 5-7. 5。
全文摘要
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B293，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6081，保藏日期为2012年04月28日。所述的解淀粉芽孢杆菌主要用于草莓灰霉病的生物防治。本发明解淀粉芽孢杆菌B293对草莓和杨树上的多种病原真菌具有抑制作用，该拮抗细菌对其他植物病害也有很好的防治效果；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的草莓灰霉病的防治具有重要意义；培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
文档编号C12R1/07GK102816713SQ201210192469
公开日2012年12月12日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者赵桂华, 徐超, 席刚俊, 史俊, 杨鹤同 申请人:江苏农林职业技术学院