专利名称：用于胃癌检测的标记物的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症的检测。具体而言，本发明涉及用于癌症检测的遗传标记物和/或蛋白质标记物的用途，并且更加具体而言涉及到遗传标记物和/或蛋白质标记物用于胃 癌检测的用途。
背景技术：
癌症的早期检测和治疗能显著提高癌症患者的存活。以胃癌为例，诊断为疾病早期的患者5年存活率为90%，而诊断为疾病晚期的患者5年存活率约为10%。然而，绝大多数胃癌患者通常处于疾病晚期。因此，开发胃癌早期诊断方法能够改善患者的预后。在包括体液如血液、尿液、腹膜灌洗液和粪便提取物在内的生物标本中的特异性癌症相关标记物的鉴定能提供有价值的癌症早期诊断方法，以便早期治疗并改善预后。特异性癌症标记物还能提供用于监测疾病进展的方法，从而能跟踪外科手术、放射治疗和化学治疗的功效。然而，对于许多主要癌症，可利用的标记物缺乏足够的敏感性和特异性。例如，用于胃癌的最常用标记物cal9_9、ca72_4和癌胚抗原(CEA)仅检测到大约15-50%的任何阶段的胃肿瘤，对于疾病早期的检测则降至大约2-11%。因此，出现假阴性检测的频率非常高，这导致患者和健康护理工作者认为不存在疾病，而事实上，患者可能患有严重的需要立即注意的癌症。而且，使用这些标记物可能对高达1/3的患有良性胃疾病个体给出假阳性信号。发明简述因此，迫切需要更好的检测癌症存在的方法。本发明方面提供了能够检测早期癌症和降低假阳性和假阴性测试结果频率的方法、成分和装置。在某些实施方案中，可以使用分子分析来鉴定与非恶性胃组织相比在胃肿瘤组织中过表达的基因。此分析包括微阵列和定量聚合酶链反应(qPCR)方法。癌基因和由那些基因编码的蛋白质在本文中称作胃肿瘤标记物(GTM)。需要理解的是术语GTM并不要求标记物仅仅对于胃肿瘤是特异的。而是应当解释为GTM可以在包括恶性或非恶性肿瘤在内的其他类型肿瘤中表达增加，其中所述肿瘤除此之外包括胃癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、肝癌、食道癌、子宫内膜癌和脑癌。无论如何应当这样理解，即术语GTM不包括在先技术标记物cal9-9、ca72_4和CEA。一些GTM的过表达足以高度可靠地诊断胃癌，而且在其它情况下，两种或多种GTM的过表达能提供胃癌的可靠诊断。
在某些实施方案中，可以用微阵列方法来检测一种或多种癌相关基因的过表达模式。在其它实施方案中，可以用定量聚合酶链反应(qPCR)来鉴定肿瘤或其它生物样品中过表达标记物的存在。在本文公开的一些GTM检测的实施方案中，GTM在肿瘤细胞内以高度选择方式过表达而在非肿瘤细胞即使表达也是很少，从而能够只检测一种过表达的GTM来对癌症进行敏感和精确检测。在其它实施方案中，可以在样品中检测两种、三种或更多GTM的过表达并从而能提供更大的诊断确定性。所选择基因编码的蛋白质能够被细胞分泌出来或从细胞中穿透出来。这些蛋白质可以单独或彼此联合用作诊断胃癌的血清或体液标记物或者作为监测所确定疾病进展的标记物。可以使用本领域已知的方法开展蛋白质标记物的检测，并且所述方法包括单克隆抗体、多克隆抗血清等的使用。·附图简述关于其特定实施方案和图在本发明中进行了描述，其中图I描述了本发明的胃癌标记物及其寡核苷酸序列列表。图2描述了用微阵列方法进行研究获得的结果列表。图3描述了用定量PCR进行研究获得的结果列表。图4a_4d描述了用微阵列方法和qPCR方法获得的倍数的log2数值结果之间的关系，其中对于四种胃癌标记物数据集中于中间的正常值。灰色方块对应非恶性肿瘤(“正常”)样品，而黑色三角对应肿瘤样品。图4a =ASPN0图4b =SPPl0图4c :SPARC。图4d MMP12。图5a_5w描述了显示从定量PCR研究获得的多种肿瘤标志物的相对频率对变化倍数的 log2 数值的柱状图。图 5a =ASPN ;图 5b :CST1、2 和 4 ;图 5c CSPG2 ;图 5d IGFBP7 ;图5e :INHBA ;图 5f L0XL2 ;图 5g :LUM ;图 5h SFRP4 ;图 5i :SPARC ;图 5j SPP1 ;图 5k THBS2 ；图 51 TIMP1 ;图 5m adlican ;图 5n PRS11 ;图 5o ASAH1 ;图 5p SFRP2 ;图 5q :GGH ;图 5r MMP12 ;图 5s KLK10 ;图 5t =LEPREl ;图 5u :TG ;图 5v EFEMP2 和图 5w TGFBL·图6是显示表达高于中间正常表达的第95百分位数的肿瘤标记物数量的柱状图。结果以qPCR数据为基础并分别显示了每一份肿瘤样品的结果。图7a_7c描述了与肿瘤标记物CEA基因表述相比，在单个肿瘤样品和非恶性肿瘤样品中标记物的相对的log2表达图。CEA是当前最常用的用于监测胃癌进展的血清标记物。图8显示的是图3的补充列表。图8总结了用qPCR检测候选肿瘤标记物的表达水平，但是使用的是配对数据(即肿瘤(“T”)和非恶性肿瘤(“N”)样品来自同一个体)从而提供T : N比。图8还包括了图3中未包括的其它标记物，即丽 2，061 11，丁6 81，？051(5，SERPINB5, SERPINH1。为了比较，也显示了已经建立的血清标记物基因CEACAM5 (CEA)的表达水平。在29个标记物中有27个具有高于或等于CEA的T N差异中值。此外，与CEA相比，全部29个标记物在配对样品中具有较高的百分比，其中在肿瘤样品中标记物的表达超过在正常样品中的表达。CST1，2，4、ASPN和SFRP4三种标记物在配对的肿瘤样品和正常样品之间的表达显示出100%的差异。本文显示了这三种标记物的基因序列以及用来检测它们的引物和探针位置。图9a_9d描述了 29种胃癌标记物在40位患者的配对样品中的单个的及中值的T N变化倍数数据。图IOa-IOad描述了 CEA和本发明中其它GTM表达在肿瘤分期和变化倍数的log2数值间的关系图。图 IOa adlican ;图 IOb :ASPN ;图 IOc CSPG2 ;图 IOd :CST1，2，4 ;图 IOe EFEMP2 ;图 IOf :GGF ;图 IOg :INHBA ;图 IOh IGFBP7 ;图 IOi =KLKlO ;图 IOj =LEPREl ;图 IOk :LUM ；图 101 L0XL2 ；图 IOm =MMPl2 ；图 IOn ；TIMP1 ；图 IOo =ASAHl ；图 IOp =SPPl ;图 IOq :SFRP2 ；图 IOr SFRP4 ；图 IOs =SPARC ；图 IOt =PRSSll ；图 IOu THBS2 图 IOv TG ;图 IOw :TGFBI ;图 IOx =CGRll ;图 IOy SERPINH1 ;图 IOz MMP2 ;图 IOaa PCSK5 ;图 IOab SERPINB5 ；图 IOac : TGFBI 和图 IOad CEA (CEACAM5)。图I la-1 Iad描述了本发明的29种GTM和CEA表达在肿瘤类型(扩散型⑶和肠型(I))和变化倍数的log2数值间的关系图。图Ila adlican ;图lib :ASPN ;图lie CSPG2 ;图lid :CST1，2，4 ;图 lie EFEMP2 ;图 Ilf :GGH ;图 Ilg :INHBA ;图 Ilh IGFBP7 ;图 Ili =KLKlO ；·图 Ilj =LEPREl :图 Ilk :LUM ;图 111 L0XL2 ;图 Ilm =MMPl2 ;图 Iln =TIMPl ;图 Ilo =ASAHl ；图 lip =SPPl ;图 Ilq SFRP2 ;图 Ilr SFRP4 :图 Ils ；SPARC ;图 lit =PRSSll :图 Ilu THBS2 ；图 Ilv :TG ;图 Ilw :TGFBI ;图 Ilx =CGRll ;图 Ily SERPINH1 ;图 Ilz MMP2 ;图 Ilaa PCSK5 ；图 Ilab SERPINB5 ;图 Ilac =TGFBl 和图 Ilad CEA(CEACAM5)。
图12描述了显示三种标记物SERPINH1、CST1，2，4和INHBA在一系列胃肿瘤样品和非恶性肿瘤胃样品中表达的三维图。图13描述了显示多重标记物对精确区分肿瘤组织和非恶性肿瘤组织能力的影响的表。此表来自qPCR数据的正态分布。图14是来源于肿瘤和非肿瘤组织的4种肿瘤标记物的Western印迹。图15是胃癌组织和血清中肿瘤标志物SPARC的Western印迹。图16是胃细胞系AGS上清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的免疫印迹。发明详述定义在详细描述本发明的实施方案之前，提供本文使用的一些术语的定义是有用的。术语“GTM”或“胃肿瘤标记物”或“GTM家族成员”指与胃癌有关的基因、基因片段、RNA、RNA片段、蛋白质或相关蛋白质片段或者其它鉴别分子，其中不包括在先技术已知的与胃癌相关的分子cal9-9、ca72-4和CEA。下文包括了 GTM实例。述语“标记物”指在数量和质量上与生物现象的存在相关的分子。“标记物”的实例为GTM，然而，“标记物”还包括与不良状况形成机制直接相关或者间接相关的代谢产物、副产物。术语“qPCR”指定量聚合酶链式反应。术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如Western印迹上斑点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。
术语“CPN2”指人羧肽酶N多肽2 (83kDa的链)和羧肽酶N。术语“HAPLN4”指人透明质酸糖蛋白连接蛋白4。术语“MMP12”指人基质金属蛋白酶12。术语“INHBA”指人抑制素β A(还包括激活蛋白A、激活蛋白AB或α多肽)。术语“IGFBP7”指人胰岛素样生长因子结合蛋白7。术语“GGH”指人Y谷氨酰水解酶(也称作结合酶、叶酰聚Y谷氨酰水解酶)。术语“LEPRE1”指人富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖(也称作I印recanl)。术语“CST4”指人半胱氨酸蛋白酶抑制剂S。 术语“SFRP4”指人分泌型frizzled相关蛋白4。术语“ASPN” 指人 asporin (也称作 I 类 LRR)。术语“CGREF1”或“CGR11”指具有EF手型结构域I的人细胞生长调节因子。除非另外说明，术语“KLK”指人激肽释放酶10变体I、或者人激肽释放酶10变体2、或者两者。术语“TIMP1”指人金属蛋白酶组织抑制剂I (也称作促红细胞活性剂(erythroidpotentiating activity)或胶原酶抑制剂)。术语“SPARC”指富含半胱氨酸的人分泌型酸性蛋白质(也称作骨粘连蛋白)。术语“TGFBI”指68kDa的人转化生长因子β诱导蛋白(transforming growthfactor, beta-induced,68kDa)。术语“EFEMP2”指包含EGF的纤蛋白样细胞外基质蛋白质2。术语“LUM”指人光亮蛋白聚糖。术语“SNN” 指人 stannin。术语“SPP1”指人分泌型磷蛋白I (也称作骨桥蛋白或骨唾液酸蛋白I或早期T-淋巴细胞活化剂I)。术语“CSPG2”指人硫酸软骨素蛋白聚糖2(也称作多功能蛋白聚糖)。术语“ASAHl ”指人N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶变体I，或者N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶变体2，或者N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶变体I和2 (也称作酸性神经酰胺酶I变体I和2)。术语“PRSS11”指人丝氨酸蛋白酶11 (也称作IGF结合丝氨酸蛋白酶)。术语“SFRP2”指人分泌型frizzled相关蛋白2。术语“PLA2G12B”指人XIIB组磷脂酶A2。术语“SP0N2”指人细胞外基质蛋白质spondin 2。术语“0LFM1 ”指人嗅介蛋白I。术语“TSRC1 ”指人包含重复的血小板反应蛋白I (thrombospondin repeatcontaining I)。术语“THBS2”指人血小板反应蛋白2。术语“adlican，，指DKFZp564I1922。术语“CST2”指人半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA。术语“CST1”指人半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。术语“L0XL2”指人赖氨酰氧化酶样酶2。
术语“TG”指人甲状腺球蛋白。术语“TGFB1”指人转化生长因子，β I。术语“SERPINH1”指人丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝Η(也称作热休克蛋白47成员I或胶原结合蛋白I)。术语“SERPINB5”指人丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝B (也称作卵清蛋白成员5)。术语“CEACAM5”或“CEA”指人癌胚抗原相关细胞黏附分子5。术语“ΜΜΡ2”指人基质金属蛋白酶2 (也称作明胶酶A或72kDa明胶酶或72kDa IV型胶原酶)。 术语“PCSK5”指人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型5 (proproteinconvertase subtilisin/kexin type 5)。应当理解，上述术语可以指蛋白质、DNA序列和/或RNA序列。还应当理解，上述术语还可以指具有与本文所述相同序列的非人类蛋白质、DNA和/或RNA。本发明实施方案详述本发明提供了在检测胃癌方面比在先技术的标记物可靠性更高的用于检测和评价肿瘤(包括胃癌)的标记物。术语“可靠性”包括不存在假阳性和/或假阴性。因此，标记物的可靠性越高，与使用此标记物所作出的诊断相关的假阳性和/或假阴性就越少。所以，在某些实施方案中，提供了允许胃癌检测可靠性比为50 %左右的先技术标记物可靠性更高的标记物。在其它实施方案中，提供了可靠性大于70%左右的标记物；在其它实施方案中，提供了可靠性大于73%左右的标记物；还是在其它实施方案中，提供了可靠性大于80%左右的标记物；在更进一步的实施方案中，提供了可靠性大于90%左右的标记物；还是在其它实施方案中，提供了可靠性大于95 %左右的标记物；在更进一步的实施方案中，提供了可靠性大于98%左右的标记物并且在某些实施方案中，提供了可靠性为大约100%的标记物。因此，我们已经意外发现了许多其存在与胃肿瘤相关的基因和蛋白质。因此，对基因产物(例如寡核苷酸诸如mRNA)以及从该寡核苷酸翻译而来的蛋白质和肽的检测能用来诊断肿瘤，如胃肿瘤。对来自胃肿瘤患者的肿瘤组织和同一受试者非恶性肿瘤组织的样品进行阵列分析，意外地发现在很多胃肿瘤中某些基因过表达的特定模式与疾病相关。还可以使用抗癌标记物的抗体检测癌标记物。通过分析多个癌标记物的存在和表达量从而能提高诊断敏感性同时降低假阳性和/或假阴性结果的频率。癌症检测的一般方法以下方法是使用GTM家族成员检测包括胃癌在内的癌症的非限定性方法。·使用对GTM基因产物具有选择性的寡核苷酸探针的微阵列方法。 使用标记物特异性引物和探针对肿瘤样品和正常样品进行实时定量PCR(qPCR)。·酶联免疫吸附测定法(ELISA)。·使用抗标记物的抗体对胃肿瘤和淋巴结转移进行免疫组织化学分析。·使用抗标记物的抗体对其它肿瘤进行免疫组织化学分析，其中所述的其它肿瘤包括但不限于结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、膀胱癌、子宫内膜癌和脑癌。 对胃癌患者手术切除肿瘤之前和之后留取血清中的标记物家族成员进行免疫检测。·对健康个体和患有非恶性肿瘤疾病(例如胃炎、溃疡、胃上皮化生和发育异常)个体血清中的标记物家族成 员进行免疫检测。·对其它癌症患者中的标记物家族成员进行免疫检测，其中所述的其它癌症包括但不限于结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、膀胱癌、子宫内膜癌和脑癌。·对体液中的标记物进行检测，其中所述的体液包括血清、淋巴液、腹膜液、脑脊液、滑液等。·对胃癌患者胃液、腹膜灌洗液、尿液和粪便中的标记物家族成员进行免疫检测。使用阵列方法和/或qPCR。 使用计算机对阵列数据或qPCR数据进行分析。收集原始数据并通过比较胃肿瘤基因表达水平和同一基因在非肿瘤组织中的表达水平进行变化倍数分析。提供用于断定表达增加的阈值(例如，I. 5倍增加、2倍增加，并且在备选的实施方案中为3倍增加、4倍增加或5倍增加)。应该意识到，用于断定已发生表达增加的其它阈值可以在不脱离本发明的范围内选择。对肿瘤基因表达的进一步分析包括将呈现出表达增加的那些基因与已知胃肿瘤表达谱相匹配以便诊断肿瘤。在某些方面，本发明提供了检测癌症的方法，其包括(a)准备生物学样品；和(b)检测GTM豕族成员在所述样品中的过表达。在其它方面，本发明包括检测GTM mRNA过表达的步骤。在其他方面，本发明包括检测GTM蛋白质过表达的步骤。在更进一步的方面，本发明包括检测GTM肽过表达的步骤。在仍然进一步的方面，本发明包括检测GTM的装置，其包括其上具有GTM捕获试剂的基质；和与所述基质关联的检测器，所述检测器能够检测与所述捕获试剂相关的GTM，其中捕获试剂包括寡核苷酸或抗体。另外的方面包括用于检测癌症的试剂盒，其包含基质；GTM捕获试剂，其包含一种或更多GTM特异性寡核苷酸和GTM特异性抗体；和使用说明书。本发明更进一步的方面包括使用qPCR检测GTM的方法，其包括对所述GTM特异的正向引物；对所述GTM特异的反向引物；PCR 试剂；反应小管；和使用说明书。本发明的另外方面包括检测GTM蛋白质或肽存在的试剂盒，其包含
具有针对所述GTM蛋白质或妝的捕获试剂的基质；对所述GTM蛋白质或肽特异的抗体；能够对针对所述GTM蛋白质或肽的结合抗体进行标记的试剂；和使用说明书。在更进一步的方面，本发明包括检测胃癌的方法，其包括步骤
从怀疑患有胃癌的患者准备样品；用ELISA方法测定GTM蛋白质的存在。如本文所描述，肿瘤检测可以通过测定一种或更多肿瘤特异性标记物的表达来完成。我们已经意外发现GTM的增强表达与所诊断胃癌存在之间的相关性非常高。检测到的最小显著相关性的P值约1.6X10'许多相关性在P值小于10_2°时具有意义。由于具有如此高的显著性，就不必检测一种以上GTM的增强表达。然而，本发明过多的GTM能够提高胃癌检测的可靠性。本文提供的方法还包括高敏感性的测定法。qPCR非常灵敏从而能用来检测样品中拷贝数非常低(例如，1-100)的基因产物。这样的敏感性使得对胃癌相关事件的极早检测成为可能。方法下面的普通方法用来评价用于胃癌相关标记物分子鉴定的多种方法的适宜性。肿瘤收集从韩国的首尔大学医院和新西兰的Dunedin医院手术切除样品中收集胃肿瘤样品和非恶性胃组织。胃癌诊断是基于症状、体检发现和对组织的组织学检查做出的。RNA 提取在一些实施方案中，通过测定肿瘤样品中RNA的变化分析胃癌相关基因的表达。将冰冻的手术样品包埋入OCT介质中。使用切片机从组织块中切出60 μ M厚的切片，放入TriReagent :水(3 I)混合物中勻衆,再用氯仿抽提。然后用Rneasy 方法(Qiagen)从水相中纯化总RNA。同样也从16种癌细胞系中提取RNA并且合并后作为参考RNA。微阵列玻片制备环氧树脂包被的玻片从MWG Biotech AG (Ebersberg,德国)获得，并且使用GeneMachines微阵列机器人并根据厂商提供的方法在上面印上 30，000条50mer寡核苷酸。图2显不了相关募核昔酸的参考号(MWG oligo#)以及NCBI mRNA和蛋白质参考序列。下文还显示了本发明GTM的全部DNA序列。RNA标记和杂交用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)在包含5_(3_氨烧基)_2’ _脱氧尿苷-5’ -三磷酸的反应中将10 μ g总RNA转录为cDNA。反应产物经Microcon柱去离子之后，与Cy3或Cy5在碳酸氢缓冲液中室温孵育I小时。经Qiaquick柱(Qiagen)去除未结合的染料，并在SpeedVac中浓缩样品至15 μ L。然后，Cy3和Cy5标记的cDNA与AmbionULTRAhyb缓冲液混合，100°C变性2分钟，在杂交盒中与微阵列玻片于42°C杂交16小时。然后洗涤玻片并用Axon 4000A扫描仪在两种功率设置下进行两次扫描产生基因表达的初步荧光数据。
归一化方法为比较肿瘤组织和非癌组织中癌基因的表达，应用Genepix软件检测的平均荧光强度通过减去局部背景荧光强度得以校正。背景校正强度少于零的点被排除。为了易于归一化，将强度比和总体点强度进行对数(log)转换。对数转换后的强度比通过用L0CFIT 软件包进行局部回归来校正着色误差(dye bias)和空间误差(spatial bias)。对数转换的强度比同时对总体点强度和位置回归。局部回归残差提供了经校正的变化倍数对数值。对于质量控制，每个归一化微阵列的比率对于点强度和位置进行了绘图。随后肉眼检测图中可能的残余假象。另外，应用方差分析(ANOVA)模型来检测针尖误差(pin-tip bias)。将所有归一化结果和参数插入Postgres数据库进行统计学分析。统计学分析
在肿瘤样品对正常组织中基因表达中的统计学意义变化可通过测定阵列之间的变化倍数进行鉴定。为实现此鉴定，将log2(比率)按比例调整至每个阵列具有相同的总体标准差。此标准化步骤减少了平均的组织种类内变异性。对于每一个寡核苷酸，将log2( t匕率)进一步转换至中位数值为零的结果从而易于肉眼检察。然后应用以变化倍数为基础的秩检验改善噪音鲁棒性。此检验由两个步骤组成(i)计算阵列内变化倍数的等级(rankof fold change) (Rfc),和(ii)将肿瘤组织的中值(Rfc)减去正常组织的中值(Rfc)。两个中值等级的差异限定了图2中给出的变化倍数等级的范围。另外两个统计学检验也根据此标准化数据进行I)进行和不进行Bonferroni调整的两组样品student' s t_检验；和2)ffilcoxon 检验。标记物组合的统计学分析为了确定使用两种或三种标记物组合区分肿瘤和非恶性肿瘤样品的数值，对来自40份配对样品(来自同一患者的肿瘤样品和非恶性肿瘤样品)的qPCR数据进行下面的分析。使用样品平均值和标准差得到非恶性肿瘤样品和肿瘤样品的正态分布。然后确定来自肿瘤表达数据的值可能超过非恶性肿瘤分布中所规定阈值(例如，大于50%、70%、73%、80%、90%、95%、98%、99%或100% )的可能性(即敏感性)。对于标记物组合，确定了至少一种标记物表达超过阈值的可能性。
权利要求
1.用于检测胃癌的方法，其包括 (a)准备生物学样品；和 (b)检测上述样品中GTM家族成员的过表达。
2.权利要求I的方法，其中所述GTM家族成员选自羧肽酶N，多肽2，83kDa链(CPN2)、基质金属蛋白酶12(MMP12)、抑制素(“INHBA”)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(“IGFBP7”)、￥-谷氨酰水解酶(“66!1”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白多糖(“1^ 1 1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂 S (“CST4”)、分泌型 frizzled 相关蛋白 4 (“SFRP4”)、asporin (“ASPN”)、具有 EF 手型结构域I的细胞生长调节因子(“CGREF1”)、激肽释放酶10(KLK10)、金属蛋白酶组织抑制剂I (“ ΜΡ1”)、富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白质(“SPARC”)、转化生长因子β诱导蛋白(“TGFBI”)、包含EGF的纤蛋白样细胞外基质蛋白质2 (“EFEMP2”)，光亮蛋白聚糖(“LUM”)，stannin (“SNN”)、分泌型磷蛋白I (“SPP1 ”)、硫酸软骨素蛋白聚糖2 (“CSPG2”)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶(“ASAH1”)、丝氨酸蛋白酶11 (“PRSS11”)、分泌型frizzled相关蛋白2(“SFRP2”)、XIIB 组磷脂酶 A2(“PLA2G12B”)、细胞外基质蛋白质 spondin 2(“SP0N2”)、嗅介蛋白1(“0LFM1”)、包含重复的血小板反应蛋白1(“TSRC1”)、血小板反应蛋白2(“THBS2”)、adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA (“CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN (“CST1”)、赖氨酰氧化酶样酶2 (“L0XL2”)、甲状腺球蛋白(“TG”)、转化生长因子β I (“TGFBI”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝H (“SERPINH1”)、丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂进化枝B(“SERPINB5”)、基质金属蛋白酶2 (“ΜΜΡ2”)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型5(“PCSK5”)和透明质酸糖蛋白连接蛋白4 (“HAPLN4”)。
3.权利要求I或2的方法，其中所述检测步骤通过检测GTMmRNA的过表达实现。
4.权利要求I或2的方法，其中所述检测步骤通过检测GTMcDNA的过表达实现。
5.权利要求4的方法，其中所述检测步骤使用与所述GMTcDNA的至少一部分互补的寡核苷酸实现。
6.权利要求4的方法，其中所述检测步骤使用利用正向引物和反向引物的qPCR方法实现。
7.权利要求I或2的方法，其中所述检测步骤通过检测GTM蛋白质的过表达实现。
8.权利要求I或2的方法，其中所述检测步骤通过检测GTM肽的过表达实现。
9.权利要求7或8的方法，其中所述检测步骤使用抗所述GTM的抗体实现。
10.权利要求7-9中任意一项的方法，其中所述检测步骤使用夹心型免疫测定法实现。
11.权利要求7-10中任意一项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
12.权利要求7-10中任意一项的方法，其中所述抗体是多克隆抗血清。
13.检测GTM的装置，其包括 在其上具有GTM捕获试剂的基质；和 与所述基质关联的检测器，所述检测器能够检测与所述捕获试剂有关的GTM。
14.权利要求13的装置，其中所述GTM捕获试剂是寡核苷酸。
15.权利要求13的装置，其中所述GTM捕获试剂是对GTM寡核苷酸、GTM蛋白质或者GTM肽特异性的抗体。
16.检测癌症的试剂盒，其包括 在其上具有GTM捕获试剂的基质；用于显现所述GTM捕获试剂和GTM的复合物的装置； 试剂；和 使用说明书。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述GTM捕获试剂是GTM特异性寡核苷酸。
18.权利要求16的试剂盒，其中所述GTM捕获试剂是对GTM寡核苷酸、GTM蛋白质或者GTM肽具有选择性的GTM特异性抗体。
19.检测胃癌的方法，其包括步骤 从怀疑患有胃癌的患者制备测试样品； 测定所述测试样品中GTM蛋白质的存在；和 将所述测试样品中存在的GTM数量与来自未患有胃癌的受试者的对照样品中的数值相比较。
20.筛选胃癌的方法，其包括步骤 从测试受试者制备测试样品； 测定所述测试样品中GTM的存在；和 将所述测试样品中存在的GTM数量与来自未患有胃癌的受试者的对照样品中的数值相比较。
21.权利要求19的方法，其中所述GTM是GTM蛋白质或肽。
22.权利要求19的方法，其中所述GTM是对GTM特异性的寡核苷酸。
23.权利要求22的方法，其中所述寡核苷酸是DNA。
24.权利要求22的方法，其中所述寡核苷酸是RNA。
25.权利要求18-24中任意一项的方法，其中所述测定步骤使用ELISA测定法。
26.权利要求19-21中任意一项的方法，其中所述测试样品从血浆中获得。
27.权利要求19-21中任意一项的方法，其中所述测试样品从组织、尿液、胃液、血清和粪便中获得。
全文摘要
肿瘤的早期检测是患有肿瘤(包括胃肿瘤)的患者存活的主要决定因素。GTM基因家族成员在胃肿瘤组织和其它肿瘤组织中过表达，因此其可以用作胃癌和其它类型癌症的标记物。GTM蛋白质可以从癌细胞中释放出来，并在血清和/或其它体液中达到足够高的浓度从而得以检测它们。因此，用于GTM检测和定量的方法和检测试剂盒能够提供胃癌诊断的有价值的工具。
文档编号C12M1/34GK102899398SQ201210297560
公开日2013年1月30日 申请日期2004年7月16日 优先权日2003年7月17日
发明者P·J·吉尔福德, A·J·霍利约克 申请人:环太平洋生物技术有限公司