专利名称：一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的方法
技术领域：
本发明涉及一种用分子生物学的技术(SRAP)鉴定杂交鱼种的方法，更具体的说，本发明涉及一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢( )]的方法。
背景技术：
乌體(Channaargus)和斑體(Channa maculate)同属于S卢形目(Perciformes)體科(Channidae)鳢属。通过斑鳢和乌鳢杂交所获得的杂交鳢系的子一代，具有生长快、产量高、病害少、安全质量高等优势，人工养殖过程可采用人工饲料喂养，大大改善原乌鳢养殖中因采用冰鲜投喂而造成饲料浪费及水源污染等问题，在珠江三角洲地区已成为鳢科鱼类中最重要的养殖品种。其中，以斑鳢为母本和乌鳢为父本的杂交鳢，因为苗种 孵化率高、成活率高等优势，在中国鳢科鱼类养殖中所占的比重越来越大。相关序列扩增多态性(SRAP)是近年来发展起来的一种新型分子标记系统，它独特的引物设计原则，上游引物可以特异性结合在基因的外显子或启动子区域，下游引物可特异地与基因的内含子配对，针对基因组的ORF进行扩增，由于个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性扩增产物。SRAP技术具有简便、高共显性、重复性高、成本低等特点。此技术在植物方面已经大量应用于植物遗传图谱构建、作物遗传多样性分析、基因定位及比较基因组学等方面。在水产动物方面，SRAP在日本沼虾、梭子蟹及草鱼等方面有所报道。常规使用鉴定杂交鱼类的方面，主要从形态学方面进行鉴定。然而，形态学鉴定有时并不一定准确，存在很强的主观因素，并且形态学鉴定在苗种期不能鉴定乌鳢、斑鳢与杂交鳢[斑鳢(早)x乌鳢U)]。例如，乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)x乌鳢U)]在形态学上，乌鳢易区别于其它两种鱼，而斑鳢与杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢U)]在形态学上很容易混淆，两者的头部花纹都呈现“一八八”。本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪去少量鳍条或其它鱼体组织部分，利用SRAP技术便很容易区别乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢U)]的方法
发明内容
本发明的目的是提供一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢(古)]的方法，以克服现有从形态学上鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢( )]，存在主观性强且不能有效地鉴定三种鱼苗种的缺陷，本发明的鉴定方法更精确，快速。为实现本发明的目的，本发明的技术方案是一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)Χ乌鳢U )]的方法，该方法包括步骤I)引物合成步骤根据2001年由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一种基于PCR的新型分子标记技术-相关序列扩增多态性，合成引物；2)乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)Χ乌鳢U ) ]DNA的提取步骤剪取三种鱼的胸鳍，用苯酚法提取组织的DNA，把DNA浓度稀释到20ng/ μ 1，放入-20°C以下保存；3) SRAP-PCR反应步骤，其中SRAP-PCR反应采用复性变温法；具体是指扩增程序94°C预变性3min ;94°C预变性45s，35°C退火45s，72。。延伸lmin，共5个循环；94°C预变性45s，50°C退火45s，72。。延伸lmin，共35个循环;72°C延伸IOmin ;4°C保存；4)电泳检测步骤用I. 5%琼脂糖检测扩增产物，筛选能用于鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢(￠)]的引物组合，并在其它采样的群体中验证；5)用Gelpix)32软件处理条带，并根据扩增出的特异性条带来鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢。能够扩增出694，268两条带的样本为乌鳢，只扩增出500 —条带的样本为斑鳢，而同时能够扩增出以上三条带的为杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢U )]。在本发明的一优选实施例中，所述步骤I)中所用引物为5个Me与6个Em组合，共30对引物。
在本发明的一优选实施例中，所述步骤I)中引物的使用浓度为20μΜ。在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢U )]中DNA的提取包括步骤I)取样本的少量胸鳍，用眼科剪剪碎，放入I. 5ml离心管中；2)加入裂解液，裂解液包括 Tris-HCl 25 μ I, SDS 50 μ I, EDTA ΙΟΟμΙ，无菌水320 μ 1，蛋白酶K 6-10 μ I ;放入55°C水浴中裂解2-4小时，变澄清即可；3)加入与裂解液体积相等的饱和苯酹,摇勻lOmin, 12000rpm时，4°C离心20min ；4)提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的饱和苯酹，摇勻lOmin, 12000rpm时，4°C离心20min ；5)提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的苯酚、氯仿及异戊醇混合物，其中苯酚、氯仿及异戊醇的比例为25 24 :1，摇勻 lOmin, 12000rpm 时，4°C离心 20min ；6)提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的氯仿与异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的比例2 4 :1，摇匀lOmin, 12000rpm 时，4°C离心 20min ；7)提取上清液，加入双倍体积的冰冻无水酒精，有絮状沉淀生成，如暂无絮状沉淀时，置 _20°C 中存放 30min, 7000rpm 时,4°C离心 8min ；8)缓缓倒掉酒精，切勿倒出DNA，用70%冰冻酒精洗一次，7000rpm时，4°C离心8min ；9)缓缓倒掉70%冰冻酒精，自然干燥1-2小时后，用100 μ I无菌水溶解，_20°C备用。在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)中，Tris-HCl水溶液的摩尔浓度为1M，pH值为8.0。在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)中，SDS的浓度为10%。在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)中，EDTA水溶液的摩尔浓度为O. 5M。本发明与传统的形态学鉴定相比，提供一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢(￠)]的方法，以克服现有从形态学上鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢( )]，存在主观性强且不能有效地鉴定三种鱼苗种的缺陷，本发明的鉴定方法更精确，客观。
图I为用Gelpro32软件处理条带扩增出的特异性条带图。其中A为引物Me3_Em5的组合，B为引物Me4-Em5的组合；1_5杂交鳢，6-10斑鳢，11-15乌鳢，M-D2000。
具体实施例方式 下面结合具体实施例，进一步说明本发明。实施例I.引物合成根据2001年由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一种基于PCR的新型分子标记技术-相关序列扩增多态性，合成引物序列编号为附表I ;
附表I
权利要求
1.一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的方法，其特征在于，包括步骤 O引物合成步骤根据2001年由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一种基于PCR的新型分子标记技术-相关序列扩增多态性，合成引物； 2)乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢( ) ]DNA的提取步骤剪取三种鱼的胸鳍，用苯酚法提取组织的DNA，把DNA浓度稀释到20ng/ μ 1，放入-20°C以下保存； 3 ) SRAP-PCR反应步骤，其中SRAP-PCR反应采用复性变温法；具体是指扩增程序:94°C预变性3min ;94°C预变性45s，35°C退火45s，72°C延伸lmin，共5个循环；94°C预变性45s，50° C退火45s，72。。延伸lmin，共35个循环;72°C延伸IOmin ;4°C保存； 4)电泳检测步骤用I.5%琼脂糖检测扩增产物，筛选能用于鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢( )]的引物组合，并在其它采样的群体中验证； 5)用Gelpro32软件处理条带，并根据扩增出的特异性条带来鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢。能够扩增出694，268两条带的样本为乌鳢，只扩增出500 —条带的样本为斑鳢，而同时能够扩增出以上三条带的为杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢U )]。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤I)中所用引物为5个Me与6个Em组合，共30对引物。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤I)中引物的使用浓度为20μΜ。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(早)X乌鳢U )]中DNA的提取包括步骤 1)取样本的少量胸鳍，用眼科剪剪碎，放入I.5ml离心管中； 2)加入裂解液，裂解液包括Tris-HCl25 μ I, SDS 50 μ I, EDTA ΙΟΟμΙ，无菌水320 μ 1，蛋白酶K 6-10 μ I ;放入55°C水浴中裂解2-4小时，变澄清即可； 3)加入与裂解液体积相等的饱和苯酹,摇勻IOmin,12000rpm时，4°C离心20min ； 4)提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的饱和苯酹，摇勻IOmin, 12000rpm时，4°C离心20min ； 5)提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的苯酚、氯仿及异戊醇混合物，其中苯酚、氯仿及异戊醇的比例为25 24 I，摇勻 IOmin, 12000rpm 时，4°C离心 20min ； 6)提取上清液，向提取的上清液中补充无菌水至体积与裂解液体积相等，接着加入与裂解液体积相等的氯仿与异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的比例为24 :1，摇匀lOmin，12000rpm 时，4°C 离心 20min ； 7)提取上清液，加入双倍体积的冰冻无水酒精，有絮状沉淀生成，如暂无絮状沉淀时，置 _20°C 中存放 30min, 7000rpm 时，4°C 离心 8min ； 8)缓缓倒掉酒精，切勿倒出DNA，用70%冰冻酒精洗一次，7000rpm时，4°C离心8min； 9)缓缓倒掉70%冰冻酒精，自然干燥1-2小时后，用100μ I无菌水溶解，-20°C备用。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在本发明的一优选实施例中，所述步骤2)中，Tris-HCl水溶液的摩尔浓度为1M，pH值为8. O。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，SDS的浓度为10%。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，EDTA水溶液的摩尔浓度为O.5M。
全文摘要
本发明涉及一种快速准确鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢的方法，该方法包括步骤1)引物合成；2)乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(♀)╳乌鳢(♂)]DNA的提取；3)SRAP-PCR反应采用复性变温法；4)电泳检测；5)对能用于鉴定乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(♀)╳乌鳢(♂)]的引物组合，用Gelpro32软件处理条带，标出条带的大小，并在其它采样的群体中验证。本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪去少量鳍条或其它鱼体组织部分，利用SRAP技术便很容易区别乌鳢、斑鳢及杂交鳢[斑鳢(♀)╳乌鳢(♂)]的方法。
文档编号C12Q1/68GK102912017SQ20121037990
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者朱树人, 李家乐, 王群, 邢智珺, 谢楠, 王宇希, 潘彬斌 申请人:华东师范大学, 上海海洋大学, 杭州市农业科学研究院