专利名称：检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-22及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体而言涉及一种卵巢癌肿瘤的生物标记物——血清micix)RNA-22 (miR-22)，及其筛选方法和在辅助个体卵巢肿瘤筛查与临床诊断及病情发展中的应用。
背景技术：
卵巢癌(ovarian carcinoma)是女性生埴器官常见的肿瘤之一,大多数是由于卵巢上皮细胞和包涵囊肿组织上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增生失控。卵巢癌是死亡率极高的妇科恶性肿瘤，其组织学形态多种多祥，是ー类高度异质性的肿瘤，具有发病率高、但病程进展缓慢、早期症状不易察觉；且侵袭转移能力较强、自然生存期长等特点。在临床检查中，多采用CA-125水平检测、超声检查、以及联合CA-125动 态监测和盆腔超声检查及彩色多普勒血流显像等检测方法尽可能的提高卵巢检出率。但目前80%的卵巣癌病人发现时已是中晩期(II -IV)，采取肿瘤细胞减灭术以及化疗患者的5年存活率仅为20%左右，且治疗比较复杂，预后效果比较差。虽然早期诊断及辅助化疗和激素治疗使得卵巣癌的死亡率有所降低，但在导致女性死亡的恶性肿瘤中卵巢癌仍居世界前列。MicroRNA(miRNA)是ー类生物体内自然形成的小分子非编码RNA，在组织和时间上具有特异性，參与调节其特异靶基因的表达，从而控制蛋白的产生，具有调节发育时序，细胞増殖，分化，代谢，凋亡与应激以及參与脊椎动物心脏、肌肉以及神经系统的形成，同时调控肿瘤发生的功能。约50%的已知人类miRA基因定位于和肿瘤相关的染色体区域，而不断累积的研究成果也已充分证实在肿瘤发生与发展过程中呈现出不同的表达水平，具有筛查和诊断卵巣肿瘤并对治疗方案的选择和预后分析具有潜在的指示作用。高通量测序是基于传统的Sanger测序的基础上发展而来的分子生物学的分析方法之ー是，虽然此技术建立时间不长，但其发展速度相当快。该技术能够对数百万个分子进行同时测序。这使得对ー个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。高通量测序的具有传统测序法达不到的优点，首先，它是利用芯片技术进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序，把利用平行处理的方略读取结果，通量较高；其次，高通量测序具有精确地样本定量功能，其原理为样本的DNA或者RNA被测序的次数反应了在样品中的丰度；同时高通量测序的成本相对较为低廉。对于miRNA序列较短、同源性高，利用芯片检测非常困难。而利用高通量技术不仅能够解决此问题，而且能够发现新的miRNA。利用此技术对卵巢肿瘤患者血清与健康血清样本分别进行测序，并对比其序列组成以及表达谱特征，对于发现生物标记物用于卵巢疾病的早期诊断有重要的意义。生物标记物是指能将机体的生理和病理状态区分开来的生物分子。筛选到可用于肿瘤早期发现、早期诊断的生物标记物可大大提高肿瘤患者的临床治疗效果。最新数据显示肿瘤组织普遍具有特征性的miRNA表达谱，即指肿瘤细胞某几种miRNA的表达水平常与同一组织中的正常细胞存在显著差异，而特征性的miRNA异常表达可望成为用于肿瘤的诊断、病理分级、临床分期、疗效与预后的生物标记物，显示了良好的临床应用前景。近年来研究人员发现在血浆和血清中也存在独立于细胞之外并且即使在严酷环境下也能明显保持稳定的miRNA分子，而作为生物检测样本，血清具有取材方便、无创伤性、并可连续的体外检测的优点，使得基于miRNA定性和定量检测技术寻找癌症特异性的血清miRNA作为分子标记的方法比传统的蛋白分子标记方法将更加有效，进而可以克服分子标记在抗体制备和定量分析上发展所遇到的瓶颈。因此，开发一种可辅助卵巢癌筛查和诊断的血清miRNA作为生物标记物，具有广泛的科研价值和临床应用前景。目前已有实验证实，microRNA在血液中被有效地保护，使其免受在血液中大量存在的RNase的降解,表现出高度的稳定性。对于血液microRNA能否作为一种无创性检测手段，目前的研究主要集中在癌症的早期诊断方面。然而，目前还没有将血清/血浆microRNA应用于卵巢疾病的辅助判断、危险度评价等方面的报道，若能筛选与卵巢组织病理状态有关的特异或异常表达的血清/血浆microRNA作为疾病检测的生物标志物，并研制相应的检测试剂盒，将会大大提升卵巢肿瘤疾病的检测水平。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有较高靶向性、稳定性及高效率检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物及其用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测卵巢肿瘤的血清学的生物标记物microRNA-22 (miR-22)，其 miRNA 序列为miR-22 aagcugccaguugaagaacugu ；本发明还同时提供了上述血清学生物标记物的用途制备用于筛查卵巢肿瘤或辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。作为本发明的血清学生物标记物的用途的改进试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统(即，引物系统、引物探针系统任选其一)；反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；引物系统由miR-22的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物以及miR_16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成；引物探针系统由miR-22的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物和探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物和探针组成。作为本发明的血清学生物标记物的用途的进一步改进试剂盒还包括扩增系统；扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。备注说明该扩增系统仅在引物探针系统中被用到。作为本发明的血清学生物标记物的用途的进一步改进检测该标志物(标记物)的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。作为本发明的血清学生物标记物的用途的进一步改进茎环是指反转录过程中使用的茎环结构反转录引物，其由以下核苷酸序列组成miR-22 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT ；作为本发明的血清学生物标记物的用途的进一步改进荧光定量PCR技术为DNA染料法或TaqMan探针法。
作为本发明的血清学生物标记物的用途的进ー步改进基于DNA染料法的荧光定量PCR检测方法，其中所使用的miR-22cDNA扩增引物为PCR正向引物miR-22 CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA ；PCR反向引物miR-22 :CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。作为本发明的血清学生物标记物的用途的进ー步改进:miR-22的探针由以下核苷酸序列组成(6-FAM)TTCAGTTGAGTCAACATC(MGB)。备注说明以上括号内的内容代表探针合成方式。作为本发明的血清学生物标记物的用途的进ー步改进在荧光定量PCR检测方法中，使用保守性miRNA(miR-16)作为内參照基因，茎环结构反转录引物、扩增引物和探针为序列uauugcacuugucccggccugu ；茎环引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA； PCR 正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA ；PCR 反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG ；探针(6-FAM)TTCAGTTGAGCGCCAATA (MGB)。本发明的标志物可単独用于卵巢肿瘤的筛查，也可辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断。本发明对卵巢癌血清及正常血清进行solexa/illumina高通量测序，根据其表达谱特征进行筛选和鉴定；从而获得本发明所述的血清学生物标记物miR-22。本发明所述的miRNA能在血清中稳定存在，该miRNA在卵巢正常血清，卵巢良性病变患者血清和卵巣恶性肿瘤患者血清中表达具有差异性，因此，能用于卵巢肿瘤筛查及辅助卵巢肿瘤病理鉴定及临床诊断。本发明主要是以miRNA为中心，基于实时荧光定量PCR技术检测和分析血清miRNA的差异性表达，主要通过以下步骤实现(a)制备卵巢肿瘤血清样本；(b)酸性酚/氯仿法抽提血清总RNA ；(c)反转录反应合成cDNA ；(d)实时荧光定量PCR检测miRNA在不同样本中的表达变化量。本发明是针对现有卵巣肿瘤标志物敏感性和特异性不能满足临床诊断的需要，在研究miRNA在卵巢肿瘤血清中的差异性表达及与临床病理指数的相关性的基础上所获得的。本发明所述的肿瘤血清标志物为miR-22 ;其应用主要表现在目标miR-22在卵巣癌患者与正常人群血清中显示出差异性表达,在良性肿瘤血清样本和恶性肿瘤血清样本中表达具有显著性差异，可単独用来对卵巢癌患者进行无创性筛查，用于辅助卵巢肿瘤病理鉴定及临床诊断。本发明的用于筛查卵巢肿瘤患者和鉴定卵巢肿瘤病理特征的试剂盒，其由反转录系统，扩增系统和引物探针系统(或引物系统)组成，其中，反转录系统由反转录酶，反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；扩增系统由含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液组成；引物探针系统由miR-16，miR-22的茎环结构反转录引物和PCR扩增引物及探针组成(引物系统由miR-16，miR-22的茎环结构反转录引物和PCR扩增引物组成)。本发明通过实验得出以下结论，确定了 miR-22目标miRNA可单独作为卵巢肿瘤筛查的血清学生物标记物，其组合可辅助卵巢肿瘤临床病理鉴定及诊断。I. miRNA-22在血清中的特异性表达目标miRNA-22通过illumina/Solexa测序筛查，在测序报告中表达差异进行分析，采用Log2-ratio (normal/patient)方法获得fold-change值即差异倍数值，其中fold-change < -I或fold-change > I表不表达具有显著差异；miRNA_22的fold-change=-1. 94342充分说明了目标miRNA在卵巢癌患者血清中呈现特异性表达。2. miRNA-22在良性肿瘤患者血清和正常血清中表达的差异性分析
本发明运用SPSS 17. O软件中单样本T检验和独立样本T检验，分析了目标miRNA在收集到的23例卵巢良性肿瘤患者的血清和8例正常血清样本等中表达的差异性，结果表明目标miRNA在卵巢肿瘤血清和正常血清中的表达水平具有显著的差异性(RQ=L 63，P=O. 047)。结果表明miRNA在血清中的表达水平可反映卵巢的病理特点，进而确定了 miRNA在血清学水平上可作为卵巢肿瘤的生物标记物来指示肿瘤的临床病理情况。3. miRNA-22在卵巢恶性肿瘤血清与正常血清中表达的差异性分析目标miRNA在31例卵巢恶性肿瘤患者血清样本及其8例正常血清样本等对照中表达的差异性分析，表明miR-22 (RQ=2. 00，P=0. 001)，在卵巢癌血清中显著表达，且已达到了极显著水平。因此根据miRNA在卵巢血清中的表达情况可明显区分癌血清和正常血清，也具有较好的参考价值。结果表明，miR-22在血清水平上来区分卵巢良、恶性病变肿瘤，进而无创伤性地筛查良性肿瘤患者以得到积极的早期诊断，进而积极采取适合的诊疗措施。因此在血清中检测这些miRNA的表达变化量对卵巢肿瘤快速筛查，临床诊断和治疗具有重要作用，有望作为卵巢诊断和治疗的生物标记物。4.在不同病理指标下，miRNA-22在卵巢肿瘤患者的血清和卵巢正常血清中表达的相关性分析。在不同年龄组、病理分期以及CA-125水平上对miR-22的表达相关性的分析(如图2、图3)可用于早期卵巢肿瘤的诊断。对低年龄组的24例样本和高年龄组的29例样本进行统计学分析，发现miR-22在低年龄组的相对表达量(RQ=2)中要比高年龄组的相对表达量(RQ=L 67)要高，但未达到显著水平(P=0. 46)。对卵巢癌血清病理分期I和II (7例)，
III和IV (24例)样本进行miR-22表达量的分析，miR-22在卵巢癌晚期(II^PIV)中表达比癌症早中期(I和II )表达要高；在0么-125-/+水平上，miR-22在CA-125+( > 35 U/ml)的相对表达量(RQ=2. 85)要比CA-125-( ( 35U/ml)中的相对表达量(RQ=L 92)要高。这对于癌症病人分期诊断有重要的指导意义。5.用Log2 scale法反映卵巢肿瘤血清中miRNA的变化Log2 scale是目标miRNA相对于内参基因而言产生的变化以对数反映出来的一种分析方法，用于揭示目标miRNA是否可作为区分患者和正常人血清的生物标记物。Log2scale法即Log2 (CtmiRNA/Ctmean (miR-16)},用于反映miRNA在卵巢肿瘤血清相对于正常血清中产生的差异变化。其中C miRNA代表荧光定量检测到的目标miRNA在卵巢血清样本中的Ct值，而Ctmean(miR-16)代表内参基因miR-16在卵巢血清样本中的平均Ct值。用Log2 scale法分析可得miR-22在恶性(Ρ=(λ 001)和良性(Ρ=(λ 047)肿瘤血清相对于正常血清的表达均有显著性差异，且在恶性肿瘤与正常血清中达到了极显著水平。本发明人经过广泛而深入的研究，首次鉴别和分离了与卵巢肿瘤相关的血清miRNA，在此基础上完成了本发明；首次通过miRNA实时定量PCR技术在卵巢癌血清中对miR-22的表达水平进行检测,进一步验证这些血清miRNA与卵巢肿瘤各临床病理指标的关联性，所提供的试剂盒专门针对于血清miRNA的检测优化，结果准确可靠。本发明的优点为⑴本发明确定的miRNA与卵巢肿瘤临床病例指标的密切相关性，能够作为生物标记物对卵巢肿瘤病人进行筛查和诊断，为临床个体化干预治疗提供有效依据。(2)由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续体外检测的优点，因此从血清中寻找生物标记物可以将卵巢肿瘤的筛查和诊断提高至一个新的水平，进而提高治愈率和降低死亡率。(3)通过实时荧光定量PCR技术对卵巢肿瘤病人的血清水平miRNA的检测，定量准确。相对于芯片技术或者分子杂交，该方法简便快速且经济实用。(4)可与其他分子指标相 结合，为卵巢肿瘤筛查，诊断，治疗与预后提供新的综合性试剂盒，方便临床应用。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图I :miR-22在卵巢良性肿瘤、恶性肿瘤血清样本中与正常血清相比表达差异倍数。左侧代表恶性肿瘤血清与正常血清相比的平均差异倍数，右侧代表良性肿瘤血清与正常血清相比的平均差异倍数。图2 miR-22在卵巢良性肿瘤、恶性肿瘤以及正常对照的血清样本中差异性表达的相关性。(相关性分析在p=0. 01水平上，SPSS17. O软件，以及origin7. 5软件)。左侧代表恶性肿瘤血清样本与正常对照血清样本的表达差异相关性以及显著性差异水平(P值)，右代表良性肿瘤血清样本与正常对照血清样本的表达差异相关性以及显著性差异水平(P值)。图3 :各病理指标上，miR-22在卵巢肿瘤患者的血清中的表达与病理指标的的相关性及差异性水平。其中年龄彡51/ < 51 :miRNA在卵巢肿瘤血清中的差异性表达与患病年龄的相关性分析；即miR-22在年龄小于51和年龄大于或等于51的卵巢肿瘤患者血清中的表达差异性分析。左代表miR-22在年龄组> 51卵巢肿瘤患者血清中的表达差异倍数，右代表年龄< 51卵巢肿瘤患者血清中的表达差异倍数。其中病理分期(Grade) I - II / III - IV :miRNA在卵巢肿瘤血清中的差异性表达与卵巢肿瘤病理分级的相关性分析，即miR-22在卵巢肿瘤血清在I和II与III和IV之间的表达差异相关性。左代表在卵巢肿瘤血清在I和II表达差异相关性，右代表在卵巢肿瘤血清在III和IV之间表达差异相关性。其中CA-125-/+ :miR_22在卵巢肿瘤血清中的差异性表达与CA-125水平的相关性分析，即miR-22在卵巢肿瘤血清CA-125-(彡35U/ml)和CA_125+( > 35U/ml)上表达差异相关性。左代表miR-22在卵巢肿瘤血清CA-125-( ( 35U/ml)，右代表miR-22在卵巢肿瘤血清 CA-125+( > 35U/ml)。
具体实施例方式本发明所提供的血清miRNA标记物在制备检测卵巢肿瘤的临床诊断试剂盒中应用的具体方法如下一、实验样本本发明所使用的肿瘤血清样本来自2007年11月 2008年12月间在浙江省肿瘤医院接受治疗的卵巢肿瘤患者的全血。入住患者要求有明确的细胞学诊断，手术前未经任何放疗、化疗及内分泌治疗，手术后有完整的临床及病理资料。本发明所采用的正常血清对照样本来自健康志愿者。入组志愿者均经问卷调查和严格体检无卵巢肿瘤及其相关妇科肿瘤家族病理史且无卵巢肿瘤患病风险。 根据国际妇产科联盟(FIGO)临床分期、分化程度、CA-125水平对卵巢恶性肿瘤与良性肿瘤患者的样本信息分类汇总如表I所示。肿瘤患者年龄21-76岁，中位年龄为51岁，小于51岁的患者24例，大于和等于51岁的患者29例，年龄不清的I例。在31例恶性肿瘤病例中卵巢浆液性腺癌为17例，卵巢浆液性乳头状腺癌为8例，卵巢黏液性腺癌为4例，卵巢子宫内膜样腺癌为2例；病理分级I级者3例，病理分级II级者4例，III级者20例，病理IV级患者4例；低分化为9例，中低分化为10例，中分化I例，高分化为I例，分化程度不明者为10例；在CA-125水平上，低于35U/ml为2例，高于35U/ml为29例。在23例良性肿瘤患者中，浆液性肿瘤为5例，黏液性为4例，子宮内膜样肿瘤为10例，卵巢冠囊肿为2例，卵巢卵泡细胞瘤为I例，卵巢乳头性肿瘤为I例。在CA-125水平上，低于35U/ml为11例，高于35U/ml为12例。表I卵巢肿瘤病人的临床病理信息
权利要求
1.一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-22，其特征是miRNA序列为 miR-22 :aagcugccaguugaagaacugu。
2.如权利要求I所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-22的用途，其特征是制备用于筛查卵巢肿瘤或辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物的用途，其特征是所述试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统； 所述反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂； 所述引物系统由miR-22的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成； 所述引物探针系统由miR-22的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物和探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物和探针组成。
4.根据权利要求3所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物的用途，其特征是所述试剂盒还包括扩增系统；所述扩增系统包括含Taq酶的miRNA表达定量检测混合液。
5.根据权利要求3或4所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物的用途，其特征是检测该标志物的技术为基于茎环的反转录-荧光定量PCR技术。
6.根据权利要求5所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物的用途，其特征是miR-22的茎环结构反转录引物由以下核苷酸序列组成GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT。
7.根据权利要求6所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物的用途，其特征是所述荧光定量PCR为DNA染料法或TaqMan探针法。
8.根据权利要求7所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物的用途，其特征是miR-22的cDNA扩增引物为 miR-22 PCR 正向引物CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA ； miR-22 PCR 反向引物CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
9.根据权利要求8所述的检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物的用途，其特征是miR-22的探针由以下核苷酸序列组成(6-FAM)TTCAGTTGAGTCAACATC(MGB)。
10.根据权利要求9所述的血清学生物标记物的用途，其特征在于在荧光定量PCR检测方法中，使用保守性miRNA的miR-16作为内参照基因，其茎环结构反转录引物、扩增引物和探针为序列uauugcacuugucccggccugu ； 茎环引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA ； PCR 正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA ； PCR 反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG ；探针(6-FAM) TTCAGTTGAGCGCCAATA (MGB)。
全文摘要
本发明公开了一种检测卵巢肿瘤的血清学生物标记物miR-22，该miRNA序列为miR-22aagcugccaguugaagaacugu。本发明还同时公开了miR-22的用途制备用于筛查卵巢肿瘤或辅助卵巢肿瘤病理鉴定和临床诊断的试剂盒。试剂盒包括反转录系统和引物系统/引物探针系统；反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂；引物系统由miR-22的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物组成；引物探针系统由miR-22的茎环结构反转录引物、cDNA扩增引物和探针以及miR-16的茎环结构反转录引物、扩增引物和探针组成。
文档编号C12Q1/68GK102864237SQ20121037989
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年10月9日
发明者丁先锋, 纪婷, 唐文杲, 蒋理想, 李彩霞 申请人:浙江理工大学