专利名称：一种可供细胞无源生长的细胞培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种可供多种细胞长期无源生长的细胞培养基的配制，属于生物技术领域，确保多种细胞长时间抵御外界环境中的不利因素，适度增长，降低死亡率，从而为细胞领域的研究提供必需的条件。
背景技术：
随着科学技术的进步、人类认识的深化以及对微观领域研究的增多，医学相关领域的实验需要从人体、组织、细胞以及动物实验等全方位进行。细胞培养作为一项基本技术，已渐渐呈模式化，总体来看，实验室中细胞培养的条件较为苛刻，目前公认的细胞培养方法仍然比较保守，需严格遵守无菌原则，24或48小时更换一次新鲜的细胞培养基，保持一定的细胞密度以及选择适宜细胞生存的环境(37°C、5% C02的细胞培养箱)等。如果不能及时更换新鲜的细胞培养基，细胞通常在7 9天内死亡。目前，多种慢性疾病严重威胁着人类的健康和生活质量，对其致病机制的研究在细胞领域广泛开展，但由于现有细胞培养基需要定期更换，且更换间隔时间多为24 48小时，这限制了对长时间细胞损伤的研究。例如按现有技术手段，研究缺氧15天对血管内皮细胞的影响，在研究过程中为保证细胞的生存，需要每间隔24 48小时更换一次新鲜细胞培养基，在每次更换培养基时必然带入一定浓度的氧气，这从一定程度上将影响了研究结果。另外，一些空间细胞搭载的研究中，不具备定期更换培养基的条件，现有培养基也不能保证细胞可长时间生存，这为空间医学细胞领域的研究带来很多障碍。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种具有适应多种细胞长时间无源生长的细胞培养基，可以为细胞领域的研究提供必需的研究条件。
本发明中将下列物质按一定百分比配制成可供细胞无源生长的细胞培养基55% 65%的DMEM基础培养基，4% 5%的3g/L L-谷氨酰胺，0. 01% 0. 015%的1.5mg/L氢化可的松，30% 40%的胎牛血清，I % 2%的青、链霉素。如配制可供细胞无源生长的细胞培养基的基本步骤为①向DMEM基础培养基中依次加入浓度为3g/L的L-谷氨酰胺及1. 5mg/L氢化可的松，配制为无血清的该培养基；②按上述该培养基的比例，再取胎牛血清及青、链霉素加入到无血清该培养基中，充分混合均匀；③上述过程均在超净工作台上完成，严格遵守无菌操作原则，配制好的培养基放4°C储存备用。培养基配制成功后，将细胞接种于该细胞培养基中首先取出保存在液氮中的细胞，在37°C水浴箱中迅速融化，然后利用水平转子离心机以1000r/min的速度离心5min后，去除上层冻存液，其次用该细胞培养基重悬细胞，血细胞计数板计数细胞数量，按IO6个/mL的细胞密度接种到T25的细胞培养瓶中，最后放入37°C、5% CO2细胞培养箱中培养18 20天。培养结束后，再次利用血细胞计数板计数此时细胞个数，计算存活率。本发明中DMEM培养基为细胞生长提供基本的生长环境，通过提高培养基中胎牛血清的比例，使血清浓度达到30% 40%，可大大提高细胞的存活时间，有利于细胞在长时间的不更换培养基的条件下，仍能拥有充足的营养，保持增殖与凋亡之间的平衡。
图1为可供细胞无源生长的细胞培养基的配制方法流程图；图2为利用本发明培养不同类型的细胞，无源密闭生长18天后细胞存活率。
具体实施例方式本发明中按一定百分比配制成可供细胞无源生长的细胞培养基55 % 65 %的DMEM基础培养基，4% 5%的3g/L L-谷氨酰胺，0. 01 % 0. 015%的1. 5mg/L氢化可的松，30 % 40 %的胎牛血清，I % 2 %的青、链霉素。可供细胞无源生长的细胞培养基中DM EM基础培养基作为细胞生长发育的基本微环境，确保细胞生长所必需的营养物质；L-谷氨酰胺是细胞生长过程中合成核酸、蛋白质的原材料；氢化可的松可促进细胞的生长发育；胎牛血清是细胞培养的重要因子，血清不仅含有丰富的营养成份，其中的各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等也起着协调细胞生长平衡的作用。通常细胞培基选择的血清浓度为10% -20%，本发明中考虑到在长时间无源环境中，细胞生长会消耗掉大量的营养物质，故将血清浓度调整为30% 40%。例如配制500mL可供细胞无源生长的细胞培养基的基本步骤为①按所述自Gibco公司购买DMEM培养基，按65%的比例取325mL的DMEM培养基，25mL的3g/L L-谷氨酰胺，0. 075mL的1. 5mg/L氢化可的松(按0. 015%比例)，配制为该培养基共计350. 075mL ；②按所述30%的比例再取150mL胎牛血清及青、链霉素ImL (按1%比例)加入到无血清的该培养基中，充分混合均匀；③上述过程均在超净工作台上完成，严格遵守无菌操作原则，配制好的培养基放4 °C储存备用。可供细胞无源生长的细胞培养基配制成功后，将细胞接种于培养基中首先取出保存在液氮中的细胞，在37°C水浴箱中迅速融化，然后利用水平转子离心机以lOOOr/min的速度离心5min后，去除上层冻存液，其次用该细胞培养基重悬细胞，血细胞计数板计数细胞数量，按IO6个/mL的细胞密度接种到T25的细胞培养瓶中，最后放入37°C、5% CO2细胞培养箱中培养18 20天。培养结束后，再次利用血细胞计数板计数此时细胞个数，计算存活率，如图2所示利用本发明培养的不同类型的细胞在培养18天后，其生存率分别为人单核巨噬细胞(THP-1)200% ;人肺微血管内皮细胞(HPMECs) 37. 5 % ;人小细胞肺癌细胞(H446) 16. 25% ;人肺鳞状 上皮细胞癌细胞(H520)40% ;大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 25 %。本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
权利要求
1.一种可供细胞无源生长的细胞培养基，其特征在于培养基由下列物质按一定百分比组成55% 65%的DMEM基础培养基，4% 5%的3g/LL_谷氨酰胺，0. 01% 0. 015%的1. 5mg/L氢化可的松，30% 40%的胎牛血清，1 2%的青、链霉素。
2.配制500mL权利要求1所述的可供细胞无源生长的细胞培养基，其特征在于所需上述物质分别为325mL的DMEM基础培养基，25mL的3g/L L-谷氨酰胺，0. 075mL的1. 5mg/L氢化可的松，150mL的胎牛血清，ImL的青、链霉素。
3.可供细胞无源生长的细胞培养基的制备方法，其特征在于具体配置过程为 ①向DMEM基础培养基中依次加入3g/L的L-谷氨酰胺及1.5mg/L氢化可的松,配制为无血清的该培养基； ②按权利要求1所述比例，再取胎牛血清及青、链霉素加入到无血清该培养基中，充分混合均勻； ③上述过程均在超净工作台上完成，严格遵守无菌操作原则，配制好的培养基放4°C储存备用。
4.利用权利要求1和2所述，可供细胞无源生长的细胞培养基，其特征在于培养细胞的具体步骤为首先取出保存在液氮中的细胞，在37°C水浴箱中迅速融化，然后利用水平转子离心机以1000r/min的速度离心5min后,去除上层冻存液,其次利用血细胞计数板计数细胞数量，按106个/mL的细胞密度接种到细胞培养基中，最后放入37°C、5% CO2细胞培养箱中培养18 20天。
全文摘要
本发明涉及一种生物技术领域，尤其是涉及一种适应细胞无源生长的细胞培养基的制备。包括将DMEM基础培养基，3g/L L-谷氨酰胺，1.5mg/L氢化可的松，胎牛血清及青、链霉素按一定比例配制成可供细胞无源生长的细胞培养基。本发明保障了多种细胞在密闭环境下长时间的无源生长，并不需要对现有的培养基原料进行大量变动，保证细胞可以长时间抵御低氧、低温及微重力等恶劣环境，确保多种细胞保持适度生长、减少凋亡率，这为研究细胞长期慢性缺氧损伤、长期慢性低温损伤及长时间暴露于微重力环境的研究提供了必需的条件。
文档编号C12N5/00GK103060257SQ20121037963
公开日2013年4月24日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者刘长庭, 郭英华, 郭娜, 方向群, 王俊峰, 李天志, 常德, 苏龙翔, 王雅娟, 徐国纲 申请人:中国人民解放军总医院