专利名称：一种高密度检测拷贝数变异的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用荧光通用引物、限制性内切酶消化样本和PCR法制备内对照模板的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，应用于生物科学研究与临床分子诊断。
背景技术：
拷贝数变异(copy number variations, CNVs)是近年来发现的基因组多样性的新形式，它是指与参考序列相比，基因组中lkb 3Mb的DNA片段的结构变异现象。CNVs广泛存于基因组中，与一些遗传性疾病的发生相关，对人类抗病性和易感性表型等变异有重要影响。这就要求建立一种快速、准确和低成本的CNVs分型检测技术。随着生物技术的发展，不同的研究小组相继开发了许多的检测方法，主要包括 以杂交为基础和以PCR为基础的检测技术。前者可以在全基因组水平上对CNVs进行检测，代表技术有微阵列比较基因杂交(SolinasToldo, Lampel et al Genes ChromosomesCancer. 1997Dec; 20 (4) : 399-407)、全基因组 SNP 芯片(Irving, Bloodworth et al. CancerRes. 2005Aprl5; 65 (8) :3053-8),代表性寡核昔酸微阵列技术(Lucito, Healy etal. Genome Res. 20030ct; 13 (10) : 2291-305. Epub 2003 Sep 15.)等，其优点是通量高且易于实现自动化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期长的缺点。后者主要是针对具体的目标位点进行检测，代表性的技术有实时荧光定量PCR、多重连接探针扩增技术(MLPA)(Schouten, McElgunn et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15; 30 (12) : e57)和多重可扩增探针杂交(MAPH) (Armour, Sismani et al. Nucleic Acids Res. 2000Jan 15; 28 (2) :605-9.)等。实时荧光定量技术有操作简单、重复性好、实验周期短等优点，但是检测通量较小；与实时荧光定量PCR相比，MLPA和MAPH的检测通量有了很大提高，不过PCR微环境的变化会导致不同位点不能完全同步扩增，而且PCR的平台效应也会影响检测结果。以PCR为基础的检测技术存在一个共同的缺陷就是待测样本和对照样本是分开检测的，这样两者PCR效率的差异会引起检测结果的偏差。竞争性PCR克服了这个缺陷，实现CNVs的快速、准确、经济的检测。在PCR扩增过程中，PCR产物的量可以用公式Y=A (1+R) n来表示，其Y表示PCR产物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的扩增效率，η表示PCR的循环数，当PCR扩增效率相同时，PCR产物的量与初始模板的量成正比。竞争性PCR利用了这一原理，在同一 PCR反应体系中涉及两组模板，一组是待测样本，另一组是合成的一段核酸序列，用作内对照，两组模板仅在目标序列长度上(存在一些碱基的插入或缺失)存在一些差异，其他反应条件一致，因此两者扩增效率接近一致，两种扩增产物量的比直观的反映了初始模板(待测样本和内对照不存在拷贝数差异)量的比，可以根据内对照的初始模板的量来计算样本的浓度。在检测拷贝数变异时，当两模板具有相同的浓度或削除了浓度差异带来的影响时，PCR产物量的比值就反映模板拷贝数的差异。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour, Palla et al. Nucleic AcidsRes. 2007; 35 (3) :el9. Epub 2006 Decl4)是基于竞争性 PCR 的一种检测 CVNs 的一种方法，此方法的优点是待测位点和内对照共存于基因组序列中，但是缺点也是很明显的，只能针对有限的基因位点进行检测，而且针对不同检测位点都要设计一对荧光引物，加大了实验成本。与MLPA技术相比，常规的竞争性PCR方案因为同一区段中PCR间距小而会相互干扰，所以PCR间的间距要足够远。一般PCR间距为5千个碱基时，相互之间没有影响，即5000个碱基中只能有一个PCR反应进行检测。所以当需要精细检测这个核酸区段中的拷贝数变化时，在需要用高密度的检测位点将整个检测区段全部覆盖时，比如在IOOOkb中放置3个检测位点，常规竞争性PCR法是无法进行检测的，而MLPA则可以完成。与此同时，由于内对照模板一般构建在质粒载体上，一般长度为2-4kb，而线性化的基因组长度为20k，在检测过程中，这种模板的长度差异，使得实际PCR效率不完全一致，这种差异在很多时候是不可以忽视的，尤其是在拷贝数变异的定量检测中，这种差异无法避免造成定量结果不准确，因此许多检测区段无法用竞争性PCR进行检测。对于GC较高的检测片段，这种差异现象更加突出。最后，由于常规的内对照模板需要全基因合成及克隆在质粒上，因此制备时间在I周到I个月，用PCR法直接制备则在一天内可以内对照的制备，快速进入后续的实验。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的空白，提供一种新的成本低、通量高、适用性好、方案建立时间短、实现和MLPA —样高密度覆盖的CNVs检测方法。在总结现有技术中各种检测方法的优缺点基础上，发明人经过自主创新研发，令人惊奇地发现通过如下设计，可以成功解决上述技术问题，并且成功应用于生物科学研究与临床分子诊断等领域。本发明的目的通过以下技术方案实现简而言之，是通过利用一种或多种限制性内切酶消化样本，将大的目标区段消化成一个个独立的小片段，同时用一个引物方案简单制备和酶切产物类似的内对照模板，使得目标模板和内对照模板从起始开始的状态基本一致，从而使基于荧光通用引物的多重竞争性PCR的检测方案构建时间更快，方案适用性更广及使检测区段实现高密度检测位点覆盖。本发明的技术方案之一是提供一种多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤(I)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和至少一对位于参照区段的嵌合特异引物组成；所述通用荧光引物长度范围为l(T25bp，5’端用荧光标记，TM值彡57°C值，且对待测基因组具有特异性；所述嵌合特异引物针对待测区段和参照区段设计，TM值>62°C，长度范围为28 50bp，3’端为18 25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3，端和5，端的两个序列之间插入两个碱基的固定组合；所有嵌合特异引物之间的TM值的差异不超过3°C ;当有两对或两对以上时，所述参照引物设计在相同或不同的参照区段上，且与待测基因无特异性匹配；所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；(2)提供至少一对内对照的嵌合特异引物，针对待测区段或参照区段设计，其扩增产物比多重竞争性PCR产物中待测区段或参照区段所对应的产物长或短l 6bp，且由三部分组成与(I)中所述的嵌合特异引物的3’端特异引物序列完全相同的5’端多重PCR引物区；与(1)中所述的嵌合特异引物下游18 25bp的序列相同，并且TM值>62°C、引物间TM值的差异不超过3°C的3’端序列；所述5’端多重PCR引物区和所述3’端序列之间是Hbp的长度调节序列，即在5’端和3’端两序列间分别插入Ilbp任意碱基、或在5’和3’端序列间的靠3’端 分别删除Ilbp碱基，使所述的内对照的嵌合特异引物的扩增产物即内对照比多重竞争性PCR产物中待测区段或参照区段所对应的产物长或短l-6bp ；(3)用所述内对照的嵌合特异引物对待测区段或参照区段模板进行PCR扩增制备内对照稀释液，将PCR产物DNA定量、稀释，直接作为内对照模板使用；(4)用一至五种限制性内切酶对目标区段进行消化；(5)多重竞争性PCR反应(a)将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本与内对照稀释液及多重竞争性PCR反应试剂混合在一起，进行PCR，在前3 16个循环中，退火温度高于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述嵌合特异弓I物引导的扩增，在后17 20个循环中，退火温度低于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述通用引物引导的扩增，且两组退火温度的差距^ 5 0C ；(b)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测样本中待测区段和参照区段以及内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息；(6)数据分析i.计算每个待测区段和参照区段的样本峰高和/或峰面积(S)和相应内对照的峰高和/或峰面积(I)，得到每个待测区段和参照区段的比值(S/I);ii以一个参照区段的比值为标准，将所有待测区段和参照区段的比值同其作比，进行数据内部标化；iii.按照i和ii的步骤将对照样本进行数据内部标化；iv.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数上述技术方案的优选方式之一为，所述通用突光引物长度范围为18 20bp。上述技术方案的优选方式之二为，所述嵌合特异引物和所述参照引物长度范围分别为38 45bp。上述技术方案的优选方式之三为，所述多重PCR引物对应的扩增产物的长度范围为12(T2000bp，且所述的可检出的长度差异为8 50bp。上述技术方案的优选方式之四为，所述样本的DNA分子数与所述内对照稀释液的DNA分子数相差10倍范围内。优选地，所述的内对照稀释液为浓度IOng/ μ L的所述内对照PCR产物DNA稀释一百万倍。上述技术方案的优选方式之五为，所述限制性内切酶的用量为每种内切酶
O.5U/5ng总DNA量/I μ L反应体系。上述技术方案的优选方式之六为，所述的多重竞争性PCR引物含一对通用突光引物、或者本领域的技术人员通过现有的四色荧光标记技术和ABI测序仪(如3130/3730)等的四色荧光检测系统，可以非常容易地将本发明的蓝色荧光标记通用荧光引物的实施例扩展至两色、三色或者四色标记的两对、三对或四对通用荧光引物；在多重PCR技术领域，多至几十对的在序列上无同源性的引物对在同一 PCR反应体系中分别实现独立的扩增反应也是常规技术。作为另一种具体实施方式
，所述的多重竞争性PCR引物由一对通用荧光引物、一对到二十对针对相同或不同待测基因的嵌合特异引物和一对到六对参照引物组成。与上述有关多重PCR技术领域的描述相同，现有技术提供了多于二十对、三十对、乃至更多对引物在同一 PCR反应体系中分别实现独立的扩增反应的原理、方案、和具体操作指导；本发明的具体实施方式
在这样的技术背景下，不应被视为对其他实施方式的限制，即现有技术完整地提供了实现其他实施方式的充分和必要条件。本发明的技术方案之二是提供一种基于上述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异方法的试剂盒，包括至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少一对参照引物、至少一对内对照的嵌合特异引物或者定量稀释后的内对照稀释液、和至少一种限制性内切酶、和/或多重竞争性PCR的反应试剂。有益.效果 本发明提供了现有技术文献中所缺乏的成本低、通量高、适用性好、方案建立时间短、实现和MLPA —样高密度覆盖的CNVs检测方法。本发明令人惊奇地发现具有以下优点I、成本低。针对所有的检测位点，应用了通用荧光引物，并采用同一的参照区段，这些措施都大大降低了实验成本。2、内对照制备时间短，省去了克隆，扩增等等一系列制备过程，只要一次PCR就可制备完成。3、通过一种或多种内切酶消化，使得目的片段消化成独立的小片段，因为这些独立片段相互不干扰，因此可实现在检测片段上高密度覆盖。4、数据更准确。因为PCR产物内对照和限制性内切酶消化的检测片段都是小片段，使得PCR扩增效率更为一致。另外对于高GC的片段，也因为模板都是小片段，这个因素的影响也不存在。实验周期短。相对于MLPA技术(需要两天)来讲，一天内就可以得到实验结果。可对少量样本多个基因进行同时检测，大大缩短了实验周期，提高了实验效率。
图I为一个参照区段和三个目标区段的多重PCR的试验结果。图2为图I的多重PCR的试验的原理示意图(分析过程中涉及两组引物一组是多重上下游嵌合特异引物；另一组是荧光通用引物)。图3为实施例I中样本检测结果示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例I利用本发明所述的方法对VIPR2基因区段(GeneBank序列号NT_007741)和10号，5号染色体上参照区段(GeneBank序列号NT_030059、NT_006576)进行了拷贝数的检测，其中选择限制性内切酶BamHI和Hindlll，并VIPR2基因区段上连续设计3个PCR进行检测。实验步骤I、通用荧光引物、位于待测基因上下游的嵌合特异引物的设计通用荧光引物的设计设计原则保证上下游引物的TM值彡57°C，且差距不超过3°C，针对小鼠和人基因组特异，引物相互作用小，上游通用引5’端用Fam荧光标记。通用引物序列为上游5’ -TTCATCCGTTCGTCCTAC-3’ ；下游5’ -ACAGCGTCAATCTCGTTC-3’。嵌合特异引物的设计我们选择了 I个目标基因VIPR2和2个参基因区段，共设计 了 5对特异引物，并与通用引物组合成特异引物，且在通用引物的3’端插入ct两个碱基，要求TM值彡62°C，扩增产物的长度在12(T400bp之间。所有的引物均经过Blast和Oligomask软件的分析，从而减少非特异扩增和引物二聚体。含待测区段的VIPR2的序列如下，限制性内切酶TaqI和BamHI进行双酶切，序列中酶切位点用斜体下划线表示。多重PCR嵌合特异引物的特异性序列区用双划线表示。
>VIPR2 序列(5，-3，) CAGGGCAGGGCCGGGTGGTCGGGCCCCAGCACACGGCTCGGGGAGCCTCCCACACTTGGTGATCCCGAGCCCTCAGTCTGCTGGTGGTGGTGCTCGAGAACTGTGGCTTACAGTGCGGGTGGGC AAGCGGAGAGGAGCAGCT GTGGAGGGCAAGGACTGGGGCCATTGCTCCTTGATACACTGTGGATGAAACCCTTTACTCAGTGAAGACCTAAGACTCCCCCAGGCCTGAAAGCTGGTCTTGGCAGGAAGAGGACACAGACGGGAAGACCTTGG ACAGGGAGAC i GAT CCCT' GGCTGGCTTATCTGCTTCAGGATCTGACTGCAGCAGGTGAGACCCCAAATAAAGGCCCAGACCATGGCCACGGCTGGTGCGGCCCCTTGGGCTCCAGGTCCAGATGAGATGCAGCTGCTCAGCAGTGCCCAGGGCTGCCCTAGAGCCCTCTGGTCCGCAGAGCCCTTCTCCTCCCAGGGGCTCCCACACCCACATCTCTGCTGATTCCCTCACACATGTAGCCAAGTCTGTGGCTTCTGTGGAGGCTAATTTTTTTTCTCGAATTTAATTAATTTCGAAAACAATAAACAATAATGATTGCACACACAACACCCAGGGCAGACTTTGGCCCTGTGCAAGCAGGAAACACAACTAAAAATGTG AATCTGGGAAGCAAGTGG' GCCTGATGGGACGAAGCGTGAGCTCCGGGCAGGAGAAACTCTGTTCAGTTCAGCTCCCAGGCAGCCCTGCGCTCGCCGGTGGGCAGAGCCGGCCCAGGACCGTGCATGTCCACCCCGTGGCTGCCTGGGGCCTGTTCTGGTGCTTGCAGCCTCCAGAGCCGCCTGTGCTATGTGCTGTT GCTTCGTCTTGGAAGCGAGT CCCTMACCAACCAAGTATTCAAAGTATTCAACGAGCAGMACTGCMCAGGAAGAAAAATTATTCATTTTGGTTTTGTGCCATCCTTTTCTTTGCTTTCTCACTTTAAAATATTTTGACTTTCTAATCCCTTAGCAGTGAATATGCACTTATAATATTTGCAGAATCTCTGAAATGTTTAATTAAGAAGAAAAATAGTTCTTCAGACTAAACAGCAAAGCATCAGGGGATCACAGAGCCACTATGCTCACGCAGGCAGGGTTTACTTACAGGCCTCGATGAAGGACCAGTGGACCC AGAAGAGCTTGCCACGTGTC CCTGGGATGCCTCACAGGGTGTGCCCAGGAGGAGACAGGAGATAAGGAGCTTGGGCATGACTCTGTGGGCTGACATTGCCACAGCAGGCGGCGGCTGTCACTGCCTCCCAGATCCACATCACTCTTTATAACCCAGGCTGGGGCTCAGAAAGGAGGTTCCCAGGGAATGCTTATTGAATAAAGGAAGGAGAGAATGAACGACGGAGCCT GCACATACGGGGCTC TGG GTGACGCTGCTGGGGGCCTTGGTCTCTGCTCTTCACCAGCACCTCTGTCCTAATGTCTCCCAGGCACAGTTGCCGGCTAGGTGCAGACGAAGATGAAGACTCAGAGGTGGTGCCTCCAACACACCGGGGATCCCACCTGGACCTTGAAATCCCCCCCAGGCCACAGAAGCCCCTGAGACCCCTGG
>10号染色体序列(5，-3’ )TCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGAAATACAGGCATGTGCCACCATGCCCAGCTAATTTTGTATTTTTAGTAAAGATGGAGTTTCTTCATGTTGGCCAGGTTGGTCTCAAA.TTCCTGACCTCAGGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAMGTGCTCGGATTACAGGCATGAGTCACTGCACCTGGCATATAGATACCATTTTAAATGAGACATTTAAATAMTTACAGACACCATCACACTTCATCCCT CAATACTTCGGCATGGGTCT CCTATACGTMGGGCATTTTCCTGTGAAACAATAATACCATTATCATACCTAAGAAAATTAATGTTAAGTCACCATTGTTACCTAATATGTGCAGTCCATAGTAACATTTCCCCAATTTTCCCAATGGTGTCTCTTGTAACTCTTTTTGT>5号染色体序列(5’ -3’ )AGTCACCCAGGACAAAGCTGAGGATTCTTTATTTTTTATAAGTTTCAAAAATTTAAAGTCTAGATGAAAACTTCTCTGAAACATCCTAGATTTCTTGAATAGATATGCTCACGTTATGCTAAGGTTTGTAATATATTGTGCTAAAGTAGATGCAAAATGAAGCAAACACTATAG TGATCCT ACTACACGGCAGA CACTGCTGTACTAGGATTGTCTTATTCAATTTACTTAAGGTCTATGGTTATCTGATTCTACCGTTTAAGAAGCAGAAGCTAAGGAGACAACAAGTCAAACATACAGTTCTGGAAAATAAGTTATTAAACATATTTCTGATGTTCTATATGGGTACTGTCACCAGAGAAAGACTAGAAAAGGTTCTCTGGGATTTAGGTTTTACCACTGTGTATTAGATAGGCCATAATAATATATTGCATTATAACCTTCTTATCACTGTAGAAAGAACTGTCATCTTCAAAATAGGTTCTGCCTGACCTTTCCTCCTATTGCCACACTCTAAAGCTG CTCTTGGCCTTACAGGGTTATCATTCTGAGCTAAAGATAGTCATCTGTACCTAAGCAGTGACATTCTATGTGGAAAGCCATAAGACAAGGCTGCTTCATTGCGGACCTCTCCACCAGCAGGGTGTGTTGTTC表一目标区段和参照区段的嵌合特异引物序列
权利要求
1. 一种多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤 (1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和至少一对位于参照区段的嵌合特异引物组成； 所述通用荧光引物长度范围为l(T25bp，5’端用荧光标记，TM值彡57°C值，且对待测基因组具有特异性； 所述嵌合特异引物针对待测区段和参照区段设计，TM值彡62°C，长度范围为28 50bp，3’端为18 25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3’端和5’端的两个序列之间插入两个碱基的固定组合；所有嵌合特异引物之间的TM值的差异不超过3°C ;当有两对或两对以上时，所述参照引物设计在不同的参照区段上，且与待测基因无特异性匹配； 所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异； (2)提供至少一对内对照的嵌合特异引物，针对待测区段或参照区段设计，其扩增产物比多重竞争性PCR产物中待测区段或参照区段所对应的产物长或短l 6bp，且由三部分组成与(I)中所述的嵌合特异引物的3’端特异引物序列完全相同的5’端多重PCR引物区；与(I)中所述的嵌合特异引物下游18 25bp的序列相同，并且TM值>62°C、引物间TM值的差异不超过TC的3’端序列；所述5’端多重PCR引物区和所述3’端序列之间是Hbp的长度调节序列，即在5’端和3’端两序列间分别插入Ilbp任意碱基、或在5’和3’端序列间的靠3’端分别删除Ilbp碱基，使所述的内对照的嵌合特异引物的扩增产物即内对照比多重竞争性PCR产物中待测区段或参照区段所对应的产物长或短l-6bp ； (3)用所述内对照的嵌合特异引物对待测区段或参照区段模板进行PCR扩增制备内对照稀释液，将PCR产物DNA定量、稀释，直接作为内对照模板使用； (4)用一至五种限制性内切酶对目标区段进行消化； (5)多重竞争性PCR反应 (a)将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本与内对照稀释液及多重竞争性PCR反应试剂混合在一起，进行PCR，在前3 16个循环中，退火温度高于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述嵌合特异弓I物引导的扩增，在后17 20个循环中，退火温度低于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述通用引物引导的扩增，且两组退火温度的差距彡5°C ； (b)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测样本中待测区段和参照区段以及内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息； (6)数据分析 1.计算每个待测区段和参照区段的样本峰高和/或峰面积(S)和相应内对照的峰高和/或峰面积(I)，得到每个待测区段和参照区段的比值(S/I); 以一个参照区段的比值为标准，将所有待测区段和参照区段的比值同其作比，进行数据内部标化； iii.按照i和ii的步骤将对照样本进行数据内部标化； iv.将待测样本和对照样本的内部标化值作比,获得待测样本与对照样本的比值,该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。
2.根据权利要求I所述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，其特征在于，所述通用荧光引物长度范围为18 20bp。
3.根据权利要求I所述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，其特征在于，所述嵌合特异引物和所述参照引物长度范围分别为38 45bp。
4.根据权利要求I所述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，其特征在于，所述多重PCR引物对应的扩增产物的长度范围为12(T2000bp，且所述的可检出的长度差异为8 50bpo
5.根据权利要求I所述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，其特征在于，在所述多重竞争性PCR反应中，所述待测样本和所述对照样本的DNA分子数与所述内对照稀释液的DNA分子数相差10倍范围内。
6.根据权利要求5所述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，其特征在于，所述的内对照稀释液为浓度IOng/ μ L的所述内对照PCR产物DNA稀释一百万倍。
7.根据权利要求I所述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，其特征在于，所述限制性内切酶的用量为每种内切酶O. 5U/5ng总DNA量/I μ L反应体系。
8.根据权利要求I所述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物含一对通用荧光引物、或者两对、三对或四对不同荧光标记的通用荧光引物。
9.根据权利要求8所述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物由一对通用荧光引物、一对到二十对针对相同或不同待测基因的嵌合特异弓I物和一对到六对参照弓I物组成。
10.一种基于权利要求I所述的多重竞争性PCR检测拷贝数变异方法的试剂盒，包括至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少一对参照引物、至少一对内对照的嵌合特异引物或者定量稀释后的内对照稀释液、和至少一种限制性内切酶、和/或多重竞争性PCR的反应试剂。
全文摘要
本发明涉及一种快速高密度多重竞争性PCR法检测拷贝数变异的方法，包括下列步骤(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测区段和至少一对位于参照区段的嵌合特异引物组成；(2)用限制性内切酶消化样本获得独立的结构相似的样本模板小片段，使得该检测片段能被高密度PCR所检测，且对于高GC序列不敏感；(3)利用PCR法直接制备内对照模板；(4)多重竞争性PCR反应；和(5)数据分析。本发明的方法能在一天内快速简便地建立起中通量的适于5～28个基因/反应的拷贝数变异的检测方案，结果准确，适用性广。本发明还提供相应的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102936624SQ20121037885
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月8日 优先权日2012年10月8日
发明者陆炯, 陈轶群, 肖君华 申请人:上海翼和应用生物技术有限公司