专利名称：一种用于检测诺如病毒的分子马达生物传感器试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明是关于食源性病毒快速检测技术的一种。
背景技术：
诺如病毒是弓I起人类病毒性肠胃炎暴发的重要病原。诺如病毒无论在散发病例中还是暴发疫情中都占有重要地位，从国内外近年对食品诺如病毒的检出情况看，食源性病毒对食品安全的威胁较严重。目前检测诺如病毒的方法主要有电镜技术、PCR技术、ELISA技术、基因芯片等方法。PCR技术是目前诺如病毒检测的主要方法，但是需要病毒富集、RNA提取、引物设计、PCR反应、扩增产物的鉴定等步骤，整个过程所需时间长。并且根据我国目前的经济水平，电镜技术、PCR技术，基因芯片技术用于医疗机构常规检测尚难推广。ELISA方法虽然简单易操作，不需要贵重设备，但其在灵敏度和特异性上有一定的不足。在门诊就诊病例中有不少诺如病毒感染者，国境口岸亦成为诺如病毒感染性疾病输入的主要途径。因此，快速、高效地排查和确认方法可避免疫情大规模扩散，尽快研制快速、特异性高、灵敏度高的食源性诺如病毒检测技术对保障国境口岸的生物安全、医疗门诊确诊具有非常重要的意义。
发明内容
以受控分子马达技术为核心，集成核酸探针识别、荧光探针标记与检测等技术，建立了一个全新概念的快速检测技术体系。利用ATP酶作为载体对目标物进行检测具有灵敏度高、特异性强、快速的特点。分子马达连接上特异的核酸探针，可以实现对特定食品微生物的快速、特异性、高通量的检测。本发明可将检测时间缩短至lh，且检测灵敏度能达到0.005ng/mL，满足现有的食品微生物检测范围。
附图1为分子马达生物传感器模式图(其中a、b、c、α、β、δ、Υ、ε均为ATP合酶亚基)，I为ε亚基抗体，2为链霉亲和素(Strptavidin)，3为N-biotin，4为NV探针，5为诺如病毒RNA。附图2为chroNV对不同种食源性病毒的检测结果,纵坐标表不突光值,横坐标表示检测的样本，其中I为水，2为甲肝病毒,3为轮状病毒。附图3为chro NV对13个添加诺如病毒食品样本、2个不含有诺如病毒食品样本的检测结果，纵坐标表示荧光值，横坐标表示检测的样本，I 15为食品检测样本编号。
具体实施例方式根据诺如病毒ORFl和0RF2之间的一段高度保守区基因设计特异性核酸探针5’-AGGAGATYGCGATCYCCTGTCCAYA，其中探针的5’用生物素进行标记。将该探针通过生物素抗体连接在分子马达上面，记做Chro NV0利用分子马达生物传感器即可对待测样本的RNA进行检测，当样品为诺如病毒RNA时，检测体系的荧光值会发生明显的变化，通过这一变化即可判断样本为阳性。为此，我们设计了一个试剂盒，可以方便、快速对食品中的沙门氏菌进行检测。试剂盒组成:
权利要求
1.本发明要求保护的内容有:异性核酸探针与FtlF1-ATP合酶连接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亚基上依次连接ε亚基抗体、生物素、链霉亲和素、生物素标记的诺如病毒核酸探针。
2.剂盒检测体系的反应条件:室温温育lOmin。
3.成buffer、启动buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20 氯化镁5mM,Tricine50mM,憐酸 氢二钾 5mM ;启动 buffer:ADP (1.6mM):上述合成 buffer = 1: 3 (v/v)；PBS:137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，IOmM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钾。
全文摘要
一种用于检测食源性诺如病毒的分子马达生物传感器试剂盒属于食源性病毒快速检测领域，主要解决传统检测方法时间过长、灵敏度低、特异性不强的问题。本发明的核心技术是利用载色体Chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器，F0F1-ATP合酶由于能快速地旋转，通过旋转它建立了催化位点与质子转运之间的偶联。首先在ATP合酶的ε亚基上连接诺如病毒核酸探针，将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合后，比较其催化ATP合成10分钟后的ATP产生量，ATP合成的多寡可以通过环境中H+的量进行测量，而H+的多寡通过H-DHPE所体现的荧光强度大小来获得。本试剂盒可对待测样本中的诺如病毒进行快速、灵敏、高通量的检测。
文档编号C12Q1/68GK103088154SQ20121040605
公开日2013年5月8日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者张捷, 王小晋, 陆琳, 张惠媛, 许美玲, 顾德周, 刘岩, 卢晓宇, 汪琦, 张昕, 王佩荣, 陈广全, 乐加昌 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局, 淮安出入境检验检疫局