专利名称：一对用于筛选小麦赤霉病抗性的引物序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一对用于筛选小麦赤霉病抗性的引物序列及其应用
背景技术：
由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是中国长江中下游麦区和东北春麦区小麦的重要病害，近年来向黄淮麦区迅速扩展。多雨的年份，小麦赤霉病的流行和大发生可导致小麦严重减产，同时被病菌感染的麦粒内会产生对人畜有害的毒素，食用后可使人畜呕吐和中毒。化学药剂虽然能防治小麦赤霉病，但对严重感病的品种来说采用药剂防治的效果也不如人意，而且农药防治还存在成本加大和环境污染的问题，因此培育抗病品种是控制此病的根本措施。小麦赤霉病抗性鉴定过程易受环境影响，且费时费力。分子标记辅助选择可在DNA水平针对抗赤霉病的基因或QTL对育种材料进行选择，因而可以克服赤霉病表型鉴定的不稳定性，降低表型评价的成本，提高抗病育种效率。为了获得与小麦赤霉病抗性连锁的分子标记，人们进行了大量研究，最早在抗赤霉病品种苏麦3号及其衍生系中获得了一个位于3B染色体短臂的主效QTL，可解释表型变异的24% - 46%，后来在望水白、宁894037等抗性品种中也在同一染色体区段定位到了主效QTL。与此QTL连锁且位于两侧的分子标记为SSR标记Xgwm493和Xgwm533,但是SSR标记距离抗性QTL遗传距离较大,且在已知的抗病材料如苏麦3号与望水白等品种中存在多态性位点不一致等问题，难以用于标记辅助选择育种，因此有必要开发与抗性基因更近且在抗病品种中多态性位点一致的分子标记。Liu等(2008)报道在该小麦3BS赤霉病抗性QTL区域发现了 7个抗赤霉病候选基因，并根据其中的第2个基因序列设计引物，开发了一个与赤霉病抗性QTL紧密连锁的分子标记UMNlO。该标记上游引物为CGTGGTTCCACGTCTTCTTA，下游引物为TGAAGTTCATGCCACGCATA。 引物经PCR扩增后，抗性品种扩增得到239bp的基因片段，而感病品种扩增得到236bp的基因片段，两者只存在3个核苷酸碱基大小的差异，因此必须通过ABI DNA序列分析仪进行的毛细管电泳分析来区分赤霉病抗感品种。杜军凯等(2010)报道针对该标记，利用特定的DNA单链构象多态性(SSCP)技术,也可以检测到该标记。但是该项技术要求使用12%非变性聚丙烯凝胶进行电泳,凝胶体积为320mm*30mm*0.4mm,电泳功率为80W。而目前我国从事小麦育种的实验室，对PCR扩增产物的检测多以普通琼脂糖凝胶电泳为主，所以利用分子标记UMNlO的引物无法在抗感品种间获得多态性，也无法对抗感品种进行检测分析。为了能使该抗性QTL在我国小麦育种得到可靠应用，我们将该标记的扩增产物进行了 DNA测序，根据抗感品种之间存在的单核苷酸位点差异，将其转化为一般的实验室可操作、利用琼脂糖凝胶电泳即可分辨的SNAP引物，并将其应用于小麦的抗赤霉病分子标记辅助育种中，有效提高小麦杂交育种早世代赤霉病抗性选择的有效性
发明内容
本发明的目的在于提供一对用于筛选小麦赤霉病抗性的弓I物序列及其应用。本发明的目的是这样实现的:一对用于筛选小麦赤霉病抗性的引物序列，其特征在于，所述的一对特异性引物序列为:上游引物SEQ ID N0.1和下游引物SEQ ID N0.2。一种上述引物序列的应用，其特征在于，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2为引物，以待测小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，再对扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳分离检测，若扩增产物中含有236bp左右大小的条带，则待测小麦品种有赤霉病抗性，为抗病品种，否则待测小麦品种无赤霉病抗性，为感病品种。 在上述的引物序列的应用中:
PCR扩增的反应体系为:20-100ng的待测小麦基因组DNA, 5U/ μ L的Taq BI 0.25 μ L，4 μ mol/L 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 各 I μ L, IOmmoI/L 的 dNTP 0.5 μ L, 10XPCR 的Mg2+ Plus缓冲液2.5 μ L，余量为无菌蒸馏水；
PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，随后94°C变性30sec，58°C条件下退火30sec, 72°C延伸30sec，进行35个循环；最后72°C延伸IOmin;在4°C下保存。在上述的引物序列的应用中:
对扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳分离检测的是指:将扩增产物在0.8% - 2%的琼脂糖凝胶中电泳分离，EB染色，判断扩增产物中是否含有236bp的条带。本发明的优点在于:通过SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2对小麦基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物通过琼脂糖电泳进行标记的检测，不需要利用测序仪或者非变性凝胶电泳来进行检测，操作简单；以能否扩增出236bp大小条带来判定小麦材料是否含有该赤霉病抗性基因，非常直观，不需要通过测序或者比较条带的大小。
图1:利用琼脂糖电泳检测引物UMNlO对赤霉病抗感品种的扩增结果。图2:利用SSCP方法检测引物UMNlO对赤霉病抗感品种的扩增结果。图3:利用琼脂糖电泳检测引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2对赤霉病抗感品种的扩增结果。图1和图3中:M:分子量标准DL2000 ;图广图3中:1_7泳道依次为小麦品种苏麦3号、望水白、Alondra、安农8455、绵阳28、宁麦9号、阿夫。
具体实施例方式实施例1:
UMNlO引物[已知引物，委托生工生物工程(上海)有限公司合成]:
上游引物:5 ’ -CGTGGTTCCACGTCTTCTTA-3，，
下游引物:5’ -TGAAGTTCATGCCACGCATA-3’。小麦品种:苏麦3号、望水白、Alondra、安农8455、绵阳28、宁麦9号、阿夫。检测方法:
以UMNlO为引物，以待测小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为:DNA20-100ng, Taq 酶(5U/y L) 0.25 μ L,上下游引物(4 μ mol/L)各 I μ L，dNTP (IOmmoI/L)
0.5 μ L，10 X PCR缓冲液(Mg2+ Plus) 2.5 μ L，然后用无菌蒸馏水补充反应体系至25 μ L ;将反应体系在95°C预变性5mi，随后94°C变性30sec，58°C条件下退火30sec，72°C延伸30sec，进行35个循环；最后72°C延伸IOmin;在4°C下保存。将扩增产物在0.8% - 2%的琼脂糖凝胶中电泳分离，EB染色，获得的检测结果如图1。由图1可见，所有待测小麦品种的扩增产物中都含有一条扩增条带，条带大小相近，无法分清是239bp还是236bp，PCR鉴定结果无法确认上述小麦品种的抗性指标，必须通过毛细管电泳方式，或者是SSCP检测方式(结果见图2)，或者是传统的田间抗性鉴定的方式进行进一步的分析。实施例2
引物[委托生工生物工程(上海)有限公司合成]:
上游引物SEQ ID N0.1
5’ - GTTCCACGTCTTCTTACATAATCCC -3’，
下游引物SEQ ID N0.2:
5’ - TGAAGTTCATGCCACGCATA -3’。小麦品种:苏麦3号、望水白、Alondra、安农8455、绵阳28、宁麦9号、阿夫。检测方法:
以UMNlO SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2为引物，以待测小麦基因组DNA为模板进行进行PCR 扩增，PCR 反应体系为:DNA 20_100ng，Taq 酶(5U/y L) 0.25 μ L，上下游引物(4μ mol/L) # IyL, dNTP (I Ommo I/L) 0.5 μ L，10XPCR 缓冲液(Mg2+ Plus) 2.5 μ L，然后用无菌蒸懼水补充反应体系至25 μ L ;将反应体系在95°C预变性5mi，随后94°C变性30sec，58°C条件下退火30sec，72°C延伸30sec，进行35个循环；最后72°C延伸IOmin;在4°C下保存。将扩增产物在0.8% - 2%的琼脂糖凝胶中电泳分离，EB染色，获得的检测结果如图2。由图2可见，扩增产物中含有236bp大小条带的有苏麦3号、望水白、宁麦9号，证明其含有该赤霉病抗性基因，为抗病品种；而Alondra、安农8455、绵阳28和阿夫没有扩增出条带，证明其不含有该赤霉病抗性基因，为感病品种。进一步利用传统的田间抗性鉴定方法进行验证，各小麦品种于扬花期接种相同数量的病原菌孢子液，于接种后21天调查各小麦品种的病小穗率。抗病性鉴定结果表明，上述抗病品种苏麦3号、望水白、宁麦9号的病小穗率分别为5.7%、5.4%和6.8%，证明其确实高抗赤霉病；而上述感病品种Alondra、安农8455、绵阳28和阿夫的病小穗率分别为24.9%、17.7%,27.7%和26.0%，证明其确实不抗赤霉病，为感病品种。通过对图1和图2的比对，我们可以看出:通过SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2对小麦基因组DNA进行PCR扩增，可以直接通过琼脂糖电泳，以能否扩增出236bp大小条带来判定小麦材料是否含有该赤霉病抗性基因，检测方法操作简单，检测结果非常直观，检测效果明显。
权利要求
1.一对用于筛选小麦赤霉病抗性的引物序列，其特征在于:所述的一对特异性引物序列为:上游引物SEQ ID N0.1和下游引物SEQ ID N0.2。
2.如权利要求1所述引物序列的应用，其特征在于^SEQID N0.1和SEQ ID N0.2为引物，以待测小麦基因组DNA为模板进行PCR扩增，再对扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳分离检测，若扩增产物中含有236bp大小的条带，则待测小麦品种有赤霉病抗性，为抗病品种，否则待测小麦无赤霉病抗性，为感病品种。
3.根据权利要求2所述的引物序列的应用，其特征在于: PCR扩增的反应体系为:20-100ng的待测小麦基因组DNA, 5U/ μ L的Taq BI 0.25 μ L，4 μ mol/L 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 各 I μ L, IOmmoI/L 的 dNTP 0.5 μ L, IOXPCR 的Mg2+ Plus缓冲液2.5 μ L，余量为无菌蒸馏水； PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，随后94°C变性30sec，58°C条件下退火30sec, 72°C延伸30sec，进行35个循环；最后72°C延伸IOmin;在4°C下保存。
4.根据权利要求2或3所述的引物序列的应用，其特征在于:对扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳分离检测的是指:将扩增产物在0.8% - 2%的琼脂糖凝胶中电泳分离，EB染色，判断扩增产物中是否含 有236bp的条带。
全文摘要
本发明涉及一对用于筛选小麦赤霉病抗性的引物序列及其应用。所述引物序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，对小麦基因组DNA进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后可通过判断扩增产物中是否含有236bp的条带，直观获得小麦品种是否具有赤霉病抗性，只有含236bp左右大小条带的小麦品种才有赤霉病抗性。
文档编号C12N15/11GK103224978SQ201310013279
公开日2013年7月31日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者马鸿翔, 王磊, 张旭, 余桂红, 杜军凯 申请人:江苏省农业科学院