专利名称：一种集成温度控制pcr-ce微流控芯片及其制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学应用仪器领域，具体地，涉及一种集成温度控制PCR-CE微流控芯片及其制作方法。
背景技术：
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),或称无细胞克隆技术(Freebacteria cloning technique),作为分子生物学和基因工程的一项重要技术,其是一种在引物引导下选择性扩增DNA和RNA片段的方法。具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，现阶段生物工程采用的PCR扩增仪可对所需要的目的基因片段进行连续多次扩增，并可以复制到几百万倍数量级的数目，广泛应用于以获得目的基因或基因片段为目的的生命科学，医学工程，遗传功臣，疾病诊断等许多领域。DNA片段的两条链的两端序列分别互补，由高温热变性，低温复性和适温延伸这三个反应温度区组成一个周期，循环进行，使得DNA片段得以迅速扩增，并在温度可以循环控制的前提下，此反应可以充分利用反应底物与原料，得到数目可观的基因片段。CE毛细管电泳分离技术是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。带电粒子在直流电场作用下于一定介质(溶剂)中发生的定向运动，带电粒子收到外界所加的高压直流电场作用，同时还会受到溶剂阻力作用，一定时间后，此两种力会产生平衡，荷质比达到所需要求的粒子就会做匀速运动，得以沿流体通道运动。我们通过调节高电压与流速之间关系，使得目的基因片段达到此种关系，即可使得其他物质通过高电压作用分离到通道的管壁上，收集并进入到废液池中集中处理，而目的基因片段通过CE电泳手段得以分离。经检索发现，新型设计的一种PCR反应管(专利号CN201990663U)，此专利设计的PCR反应管事通过 PCR热循环仪对放入其中的PCR管进行反复的升降温完成，实现温度控制的PCR扩增。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种集成温度控制PCR-CE微流控芯片及其制作方法，即能够制作集成PCR反应和CE毛细管电泳为一体的便携式芯片，方便DNA片段以及目的基因的扩增，具有温控精确，反应速度快，用量小，集成度高的特点，制作成本相对低廉，并可以得到迅速而可靠的PCR反应数据。根据本发明的一个方面，提供一种集成温度控制PCR-CE微流控芯片，该芯片采用上下双层设计，上层为PDMS盖片，下层为钼电极基板，上下两层封装成整体芯片；整体芯片集成了温度控制，PCR扩增反应和CE分离三个流程。所述芯片具体包括:注入口，储液池，混合通道，PCR反应腔，CE分离通道，加热电极，温度传感电极以及CE电极；其中注入口、储液池、混合通道、PCR反应腔和CE分离通道在PDMS盖片上实现；加热电极、温度传感电极和CE电极在钼电极基板上实现；所述混合通道由相通的流体通道、交叉的十字通道、波浪型混合通道三部分组成，所述芯片的外部管道与三个注入口键合连接，其中两个注入口进液后分别与储液池相接，另一个注入口进入的样本与所述储液池储存的溶液分别经过各自的流体通道流经交叉十字通道时混合在一起，最后经过波浪型混合通道充分混合均匀，混合完成后进入到PCR反应腔，在PCR反应腔的下部为钼电极基板上的加热电极与温度传感电极，分别对PCR反应进行温度控制与实时温度检测，PCR反应完成后进入CE分离通道，在CE分离通道处有缓冲液储液池、废液池和CE储液池三个液体储存室，其中在缓冲液储液池与废液池的下部为CE电极，该电极与外界高压电源相连接，在CE分离通道的两端分别由插入光纤通道的光纤从外界引入激发电源，并将激发的荧光信号引到外界进行荧光检测；在CE分离通道的尽头连接CE储液池，在该储液池中得到最后的目的产品。所述的混合通道存在一些尺寸缩小的通道部分为毛细管阀，由于制作材料为PDMS是憎水材料，由于毛细现象的存在，缩小通道的尺寸可以起到阻流来控制流体流动方向的作用，两个储液池中的液体用注射泵按照相同的速度从两端泵入交叉通道，由于上部流体通道有毛细管阀阻流，两相流会相遇后共同流入波浪混合通道混合，波浪型混合通道通过_■次流加强对流，提闻混合效率。所述PCR反应腔，与波浪型混合通道的容积相近或相同，因此可以从中央通道外部通过注射泵缓慢压入非溶性气体进入通道，同时因为气体的压力作用，可将反应液以一定速度缓慢推入PCR反应腔中，进行DNA扩增。PCR反应腔的菱形-矩形反应腔结构可以保证减缓进样速度，充分利用腔室，减少内部气泡的生成。所述与PCR反应腔连接的CE分离通道，CE分离通道的结构同样为十字结构，十字通道的作用是给方便进样与分离，样品交叉部分有岔开，整体形成双T型结构，在进样过程中通过加载偏压，压缩样品以减小样品带宽宽度，同时在分离过程中，通过对进样口两端施加电压，将进样口管道内的样品清空，有效的去除了样品的拖尾情况，同时清空管道后还能实现多次重复进样，有效的提高试验的重复性和分离度。所述光纤通道 ，光纤将会使外部激发光源信号从其中一根光纤引入照射到CE分离通道中激发荧光，另一端对准CE分离通道相同位置的光纤会将激发的荧光传递到外部设备进行信号的收集与处理。所述加热电极、温度传感电极和CE电极分布在玻璃基板上，加热电极为蛇形，集中在PCR反应腔下面分布，中央比两端稀疏，保证中心温度不至于过高。在PCR反应腔正中心下方对应位置有温度传感电极，用于检测PCR反应腔中的温度变化并将信号输出到外部控制系统进行温度反馈调节。由于钼具有温度随电阻成线性变化的特点，所以电极采用钼金属，溅射图形化在玻璃基片上。加热与温度传感电极都用电极引脚与外部设备相连。CE分离通道部分需要外接高压电源进行电泳分离，CE电极直接用导线与外接高压电源连接即可。根据本发明的另一个方面，提供一种集成温度控制PCR-CE微流控芯片的制备方法，该方法包括如下步骤:步骤一，上层PDMS盖片是采用微加工技术在基片上加工出凸起阳膜，然后在模具中使用聚合物材料对微通道图形进行复制，将复制材料剥离后可以得到具有通道形状的盖片；
步骤二，下层的钼电极基板的加工过程为:首先在清洁的玻璃基底上溅射钼金属层，然后在金属层上甩正胶、光刻、显影图形化，在溅射刻蚀机中以等离子体轰击基片表面，光刻胶未覆盖住部分的金属将被刻蚀掉，露出基底玻璃面；最终将光刻胶用丙酮酒精去除光刻胶即可露出图形化的钼电极。步骤三，待PDMS盖片与钼电极基片制作完成后，在钼电极基板上甩一层PDMS层，在烘箱里烘到PDMS成为半固态时取出，然后利用等离子体去胶机对PDMS盖片和刚刚拿出的钼电极基板去胶，改变表面的化学特性。步骤四，最后将PDMS盖片与钼电极基片封装起来，这种方法既将两部分封装合成为完整的一片芯片，又能保护PDMS通道会因为温度改变而改变其化学性质。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:本发明设计制作的上述温度控制的PCR-CE微流控芯片微型化，成本低廉，方便，快捷的对相关DNA片段进行合成与分离。同时在此设计与制作过程中利用了很多前沿的MEMS工艺，并可以对以后的芯片改进和制作过程的创新提供了很大的空间。
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:图1为本发明的设计PCR-CE微流控芯片的分解图。图2为本发明的PCR-CE微流控芯片的俯视图。图3为PCR反应腔部分示意图。图4为PDMS盖片的混合通道示意图。图5为CE检测部分通道示意图。图6为微流控芯片的基板整体电极分布图。图中:注入口 1，储液池2，毛细管阀3，十字通道4，波浪型混合通道5，PCR反应腔6，CE储液池7，缓冲液储液池8，废液池9，光纤通道10，CE分离通道11，CE电极12，加热电极13，温度传感电极14。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。如图1所示， 本实施例提供一种集成温度控制PCR-CE微流控芯片，该芯片采用双层设计，上层为以PDMS材料制作的PCR与CE反应通道，下层为采用微加工工艺得到的钼电极基板，从而检测与控制PCR反应所需的温度，并进行循环控制，上下两层采用PDMS半固化和等离子体去胶封装而成，整体芯片集成了温度控制，PCR扩增反应和CE分离三个流程。如图2所示，本实施例所述芯片包括:注入口 I，储液池2，混合通道，PCR反应腔6，CE分离通道11，加热电极13，温度传感电极14，CE电极12。其中注入口 1，储液池2，混合通道，PCR反应腔，CE分离通道在PDMS盖片上实现，加热电极，温度传感电极，CE电极在钼电极基板上实现。本实施例中,所述芯片制作成型为54_X25.4mm的矩形构造,外部直径为1_的塑胶管道与3个注入口 I键合连接，左右两个注入口 I进液后各自与直径为3mm的储液池2相接，保证PCR反应的进液量与反应所需底物和样本量，之后由流体通道、交叉的十字通道4、波浪型混合通道5三部分组成的混合通道将两个储液池2所储存的溶液与样本(通过中间的注入口 I注入)均匀混在一起，混合完成后即进入到PCR反应腔6，PCR的反应腔为一个菱形-矩形的结构，在PCR反应腔6的下部为钼电极基板上的加热电极与温度传感电极，分别对PCR反应进行温度控制与实时温度检测，既可以完成PCR反应的三个阶段的连续循环控制，PCR反应完成后，进入CE分离通道11，在CE分离通道11处有缓冲液储液池、废液池和CE储液池7三个液体储存室，其中在缓冲液储液池与废液池的下部为CE电极12，与外界高压电源相连接，提供CE毛细管电泳分离所需电压信号，并在后面的宽度为IOOum的CE分离通道中进行合成DNA与废液的分离，在CE分离通道11的两端分别由插入光纤通道的光纤从外界引入激发电源，并将激发的荧光信号引到外界进行荧光检测。在CE分离通道11的尽头连接CE储液池7，在该储液池中可得到最后的DNA合成的目的基因。如图4所示，本实施例中，所述的混合通道存在一些50um的通道部分为毛细管阀3，由于制作材料为PDMS是憎水材料，由于毛细现象的存在，缩小通道的尺寸可以起到阻流来控制流体流动方向的作用，与注入口 I连接的两个储液池中的液体用注射泵按照相同的速度从两端泵入交叉通道，由于流体通道有毛细管阀3阻流，两相流会相遇后共同流入波浪混合通道5混合，波浪型混合通道5通过二次流加强对流，提高混合效率。如图3所示，本实施例中，所述PCR反应腔6室，整体容积为10.4ul，与波浪型混合通道5的容积相近，因此可以从中央通道外部通过注射泵缓慢压入非溶性气体进入通道，同时因为气体的压力作用，可将反应液以一定速度缓慢推入PCR反应腔6中，进行DNA扩增。PCR反应腔6腔室的菱形-矩形反应腔结构可以保证减缓进样速度，充分利用腔室，减少内部气泡的生成。
如图5所示，本实施例中，所述CE分离通道11为十字结构，十字通道的作用是给方便进样与分离，样品交叉部分有300um的岔开，整体形成双T型结构，在进样过程中通过加载偏压，压缩样品以减小样品带宽宽度，同时在分离过程中，通过对CE分离通道11进样口两端施加电压，将CE分离通道11进样口管道内的样品清空，有效的去除了样品的拖尾情况，同时清空管道后还能实现多次重复进样，有效的提高试验的重复性和分离度。本实施例中，所述光纤通道距离CE分离通道11约400um，CE分离通道11长度为22mm，光纤将会使外部激发光源信号从其中一根光纤引入照射到CE分离通道11中激发荧光，另一端对准CE分离通道11相同位置的光纤会将激发的荧光传递到外部设备进行信号的收集与处理。如图6所示，本实施例中，所述CE电极12，加热电极13，温度传感电极14分布在玻璃基板上，加热电极13为蛇形，集中在PCR反应腔6下面分布，中央比两端稀疏，保证中心温度不至于过高。在PCR反应腔6正中心下方对应位置有温度传感电极14，用于检测PCR反应腔6中的温度变化并将信号输出到外部控制系统进行温度反馈调节。由于钼具有温度随电阻成线性变化的特点，所以CE电极12，加热电极13，温度传感电极14采用钼金属，溅射图形化在玻璃基片上。加热电极13、温度传感电极14都用电极引脚与外部设备相连。CE分离通道11部分需要外接高压电源进行电泳分离，CE电极12直接用导线与外接高压电源连接即可。其中加热电极13电阻为120欧左右，检测电阻为60欧左右。本实施上述的芯片，上层PDMS盖片是采用微加工技术在基片上加工出凸起阳膜，然后在模具中使用聚合物材料对微通道图形进行复制，将复制材料剥离后可以得到具有通道形状的盖片。下层的钼电极基板的加工过程为首先在清洁的玻璃基底上溅射钼金属层，然后在金属层上甩正胶、光刻、显影图形化，在溅射刻蚀机中以等离子体轰击基片表面，光刻胶未覆盖住部分的金属将被刻蚀掉，露出基底玻璃面。最终将光刻胶用丙酮酒精去除光刻胶即可露出图形化的钼电极。待PDMS盖片与钼电极基片制作完成后，在钼电极基板上甩一层很薄(约0.1mm厚)的PDMS层，在烘箱里烘到PDMS成为半固态时取出，然后利用等离子体去胶机对PDMS盖片和刚刚拿出的钼电极基板去胶，改变表面的化学特性，最后将PDMS盖片与钼电极基片封装起来，这种方法既将两部分封装合成为完整的一片芯片，又能保护PDMS通道会因为温度改变而改变其化学性质。本实施例PCR-CE芯片的原理是从起始的液体混或到最终的分离检测都能在同一块芯片中进行。将待扩增检测的PCR样本从注入口 I注入，并进入到相应的储液池中，另外一个储液池中注入引物、酶、Mg2+、dNTP缓冲液，荧光标定剂等PCR与CE检测所需的底物与溶液。最后一个注入口则通过注射泵通入外界气体，保持和控制内部反应压强。两个储液池的液体通过混合通道进行均匀融合，并利用毛细管阀3起到控制液体流动速度，阻碍其迅速流动而不能混合均匀的目的，只有当外界泵体给予的液压增大到一定程度才能导通。当两个液体流在十字通道4混合均匀后，关闭储液池对应的泵体，打开流体通道的注入口，利用注射泵泵入无菌空气，空气将在十字通道混合的反应液全部压入PCR反应腔6。由于设计的PCR反应腔6和混合通道体积基本一致或相同，则充分混合的反应液可一次性全部进入PCR反应腔6。使用加热电极13与温度传感电极14进行PCR循环扩增，加热电极13采用外部控制电路控制，在高温热变性(90° C左右)，低温复性(60° C左右)和适温延伸(72° C左右)三个温度段循环，大约30个周期即可完成PCR扩增，继续用延伸通道注入CE储液池7，并充满CE储液池与废液池9之间的十字CE分离通道11，在CE电极12上外接高压电源，进行CE电泳分离，这样最终的产物通过十字CE分离通道11，而废液被分离到废液池中。在CE分离通道11的两端插入光纤进入光纤通道10，光纤从外界引入激发光源并将激光的荧光信号引入到外部进行荧光检测，进而得到分离与DNA纯度数据。这样此芯片便可以实现样本混合，PCR扩增反应，CE分 离并检测等一体的功能。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
权利要求
1.一种集成温度控制PCR-CE微流控芯片，其特征在于，该芯片采用上下双层设计，上层为PDMS盖片，下层为钼电极基板，上下两层封装成整体芯片； 所述芯片具体包括:注入口，储液池，混合通道，PCR反应腔，CE分离通道，加热电极，温度传感电极以及CE电极；其中注入口、储液池、混合通道、PCR反应腔和CE分离通道在上层PDMS盖片上实现；加热电极、温度传感电极和CE电极在下层钼电极基板上实现；所述混合通道由相通的流体通道、交叉的十字通道、波浪型混合通道三部分组成，所述芯片的外部管道与三个注入口键合连接，其中两个注入口进液后分别与储液池相接，另一个注入口的样本与所述储液池储存的溶液分别经过各自的流体通道流经交叉十字通道时混合在一起，最后经过波浪型混合通道充分混合均匀，混合完成后进入到PCR反应腔；在PCR反应腔的下部为钼电极基板上的加热电极与温度传感电极，分别对PCR反应进行温度控制与实时温度检测，PCR反应完成后进入CE分离通道，在CE分离通道处有缓冲液储液池、废液池和CE储液池三个液体储存室，其中在缓冲液储液池与废液池的下部为CE电极，该电极与外界高压电源相连接，在CE分离通道的两端分别由插入光纤通道的光纤从外界引入激发电源，并将激发的荧光信号引到外界进行荧光检测；在CE分离通道的尽头连接CE储液池，在该储液池中得到最后的目的产品。
2.根据权利要求1所述的集成温度控制PCR-CE微流控芯片，其特征在于，所述的混合通道中的流体通道存在毛细管阀，与注入口相连的所述储液池中的液体用注射泵按照相同的速度从两端泵入交叉的十字通道，所述混合通道中的流体通道有毛细管阀阻流，两相流会相遇后共同流入波浪型混合通道混合，波浪型混合通道通过二次流加强对流，提高混合效率。
3.根据权利要求1所述的集成温度控制PCR-CE微流控芯片，其特征在于，所述PCR反应腔是菱形-矩形反应腔结构，该PCR反应腔与所述波浪型混合通道的容积相同。
4.根据权利要求1所述的集成温度控制PCR-CE微流控芯片，其特征在于，所述CE分离通道为方便进样与分离的十字结构，样品交叉部分有岔开，整体形成双T型结构，在进样过程中通过加 载偏压，压缩样品以减小样品带宽宽度，同时在分离过程中，通过对该通道进样口两端施加电压，将该通道进样口管道内的样品清空。
5.根据权利要求1所述的集成温度控制PCR-CE微流控芯片，其特征在于，所述光纤通道，其中光纤将会使外部激发光源信号从其中一根光纤引入照射到CE分离通道中激发荧光，另一端对准CE分离通道相同位置的光纤会将激发的荧光传递到外部设备进行信号的收集与处理。
6.根据权利要求1所述的集成温度控制PCR-CE微流控芯片，其特征在于，所述加热电极，温度传感电极以及CE电极分布在钼电极基板上，加热电极为蛇形，集中在PCR反应腔下面分布，中央比两端稀疏；在PCR反应腔正中心下方对应位置有温度传感电极，用于检测PCR反应腔中的温度变化并将信号输出到外部控制系统进行温度反馈调节；加热电极与温度传感电极都用电极引脚与外部设备相连。
7.—种权利要求1所述的集成温度控制PCR-CE微流控芯片的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: 步骤一，上层PDMS盖片是采用微加工技术在基片上加工出凸起阳膜，然后在模具中使用聚合物材料对微通道图形进行复制，将复制材料剥离后可以得到具有通道形状的盖片；步骤二，下层的钼电极基板的加工过程为:首先在清洁的玻璃基底上溅射钼金属层，然后在金属层上甩正胶、光刻、显影图形化，在溅射刻蚀机中以等离子体轰击基片表面，光刻胶未覆盖住部分的金属将被刻蚀掉，露出基底玻璃面；最终将光刻胶用丙酮酒精去除光刻胶即可露出图形化的钼电极； 步骤三，待PDMS盖片与钼电极基片制作完成后，在钼电极基板上甩一层PDMS层，在烘箱里烘到PDMS成为半固态时取出，然后利用等离子体去胶机对PDMS盖片和刚刚拿出的钼电极基板去胶，改变表面的化学特性； 步骤四，最后将PDMS盖 片与钼电极基片封装起来。
全文摘要
本发明提供了一种集成温度控制PCR-CE微流控芯片及其制备方法，该芯片采用双层设计，上层为以PDMS材料制作的PCR与CE反应通道，下层为采用微加工工艺得到的铂电极基板，从而检测与控制PCR反应所需的温度，并进行循环控制，上下两层采用PDMS半固化和等离子体去胶封装而成，整体芯片集成了温度控制，PCR扩增反应和CE分离三个流程。本发明能够制作集成PCR反应和CE毛细管电泳为一体的便携式芯片，方便DNA片段以及目的基因的扩增，具有温控精确，反应速度快，用量小，集成度高的特点，制作成本相对低廉，并可以得到迅速而可靠的PCR反应数据。
文档编号C12M1/36GK103103120SQ20131002028
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者张卫平, 姜川, 骆健, 陈文元, 吴校生, 崔峰, 刘武 申请人:上海交通大学