专利名称：一种利用蔗糖发酵制备丁二酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种利用蔗糖发酵制备丁二酸的方法。
背景技术：
丁二酸，又名丁二酸，是一种常见的天然有机酸，作为重要的C4平台化合物，广泛应用于食品、医药、香料、洗涤剂、精细化工产品、表面活性剂生物可降解材料等方面。丁二酸传统的生产方法是以石油为原料用化学法进行炼制合成。目前，国内外主要使用的是催化加氢法。而随着石油资源日益枯竭，微 生物发酵法生产丁二酸以其环境友好性、可利用废弃的生物质资源、能够固定温室气体CO2等优点，成为研究的热门课题。中国申请201110352084.1公开了一种利用蔗渣发酵制备丁二酸的方法，包括丁二酸生产菌的菌种活化、种子培养及发酵培养产丁二酸的步骤，发酵培养产丁二酸的步骤如下:(1)超声处理蔗渣，使其中糖分处于更有利水解的状态:将蔗渣与稀硫酸按照质量体积比(w/v) 15 20%混合，超声的时间为20 60min，超声温度为15 25°C，超声频率为80-150赫兹；(2)用稀酸水解方法制备多组分糖液:将步骤(I)得到的料液加热至温度120 130°C，水解150 180min后经抽滤得到水解液，调节pH至6.0,115°C灭菌15min后作为碳源备用；(3)将备用碳源直接添加至不含碳源的发酵培养基中，接入种子培养后得到的种子液；(4)向步骤(3)的发酵培养基中添加氮源:氮源的用量为原氮源需要量的O 80% ; (5)将丁二酸生产菌的种子培养液直接接种至步骤(4)的培养基中，发酵制备丁二酸。产琥珀酸放线杆菌能够利用广泛的碳源，包括葡萄糖、果糖、D-木糖、蔗糖、乳糖、乳清等，目前文献报道的发酵法生产丁二酸研究用培养基原料多为葡萄糖，很少有野生菌利用蔗糖的报道。蔗糖是光合作用的主要产物，是一种非还原性二糖，广泛分布于植物体内，特别是甜菜、甘蔗和水果中含量极高，而且蔗糖具有维持渗透压的作用，能够保护菌体，工业上被用来生产柠檬酸、乳酸、甘油等。利用产琥珀酸放线杆菌，以蔗糖作为碳源发酵产丁二酸，生产速率较利用葡萄糖发酵生产速率高。蔗糖浓度过高时也会对发酵过程产生抑制作用，因此，采用一种合适的补糖方法，提高蔗糖的利用率对于丁二酸生产有重大意义。中国专利ZL200610085415.9公开了一种产丁二酸的菌株及其筛选方法和应用，其中利用葡萄糖作为碳源，消耗93 g/L葡萄糖，45 h生产45g/L 丁二酸，其产率有待进一步提闻。此外，现有技术未见以蔗糖为碳源发酵制备丁二酸的技术方案。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于高效利用蔗糖发酵生产丁二酸，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种利用蔗糖发酵制备丁二酸的方法，所述方法包括如下步骤:
(I)斜面培养:将冻存菌种融化并在斜面培养基中进行平板划线后，在温度为30 40°C的厌氧培养箱中活化培养24 72 h，活化好的单菌落用于种子培养基接种和菌株保存；
(2)种子培养:向100mL血清瓶中加入种子培养基30 60 mL，115 121 °C灭菌15 25 min，冷却后接入斜面培养菌株，通入C02 I 3 min，30 40 °C培养，摇床转速100 200 r/min，培养时间为10 16 h，用于发酵培养基接种；
(3)血清瓶培养:100mL血清瓶中加入发酵培养基20 50 mL，加入碱性中和剂，115 121°C灭菌15 25 min,冷却后接入种子培养液,通入CO2 I 3min保证厌氧环境，接种完成后，培养温度为30 40°C，摇床转速100 200 r/min，培养时间为24 72 h ；
(4)3L发酵罐发酵培养:3L发酵罐中发酵培养基体积为1.5 2 L，接种量为5 10%(v/v)，温度为30 40 °C，发酵罐中持续通入CO2以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速100 300 rpm,发酵过程分别采用碱性中和剂控制pH在6.6 7.0,发酵时间为24 72h，即得。本发明所述的发酵微生物菌种制备丁二酸的方法可以是现有技术中任意的厌氧发酵制备方法，包括斜面培养、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤。作为优选地:
其中，所述斜面培养基以IL计，含有:葡萄糖10g，酵提取物5g，玉米浆5g，NaHCO310g, NaH2PO4.2H20 9.6g, K2HPO4.3H20 15.5g,琼脂 20g。所述种子培养基以IL计，含有:葡萄糖10 g，酵提取物5g，NaH2PO4.2Η20
9.6g, K2HPO4.3H20 15.5g, NaHCO3 10g，玉米浆 5g, pH 7.0。所述发酵培养基以IL计，含有:糖类10 100 g，乙酸钠1.36g，NaCl lg, CaCl20.2g, MgCl2 0.2g, Na2HPO4 0.31 g，NaH2PO4 1.6g，K2HP04g，酵母提取物 15g。上述发酵培养基中，糖类 可以选择现有技术公开的多种技术方案，均在一定程度上可以实现丁二酸的发酵，但考虑到生产成本以及丁二酸的收率等，应当对糖类作进一步的研究与开发。本领域技术人员知道，廉价碳源如糖蜜等含有大量蔗糖，是蔗糖和葡萄糖的混合物，由于其来源广泛，成本低廉，因此有必要研究蔗糖-葡萄糖的混合糖发酵。高糖浓度时，在总糖浓度不变的情况下，以蔗糖-葡萄糖混合糖代替部分纯蔗糖发酵，糖抑制现象会得到缓解，同时蔗糖-葡萄糖的比例会影响到丁二酸的生产。本发明优选利用蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖发酵制备丁二酸，利用蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖产丁二酸的高收率、高生产速率，并通过优化调控方式进一步提高丁二酸的收率和生产速率。与利用葡萄糖生产丁二酸相比较，利用纯蔗糖发酵时，单批发酵利用蔗糖速度快，丁二酸收率高、生产速率快，而利用补料单批发酵方式，能够进一步缩短发酵时间，提高丁二酸生产速率；利用蔗糖-葡萄糖混合糖发酵时，在蔗糖-葡萄糖最佳比例范围内，先添加蔗糖作为碳源，待蔗糖耗至一定浓度时，添加蔗糖-葡萄糖的混合物，能够很好的减低糖抑制作用。作为本发明最理想的技术方案，优选所述糖类为蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖，具体在发酵培养过程中，先加入蔗糖使其浓度为50g/L，当蔗糖浓度低于10g/L，添加蔗糖-葡萄糖混合糖至糖浓度为10g/L-40g/L，所述混合糖中二者的用量比为4:1。此外，本发明所述糖类也可以仅为浓度为50_100g/L的蔗糖，不加入蔗糖-葡萄糖混合糖。本发明所述菌株优选为产琥拍酸放线杆菌tinobacillus succinogenesNJ113)。该菌已申请专利并获得授权，专利授权公告号为CN100537744C。其中，所述步骤3中碱性中和剂为CaC03、Mg (OH) 2和/或碱式MgCO3,优选Mg (OH)20碱性中和剂与蔗糖比例为0.6:1 1.2:1。其中，所述步骤4中碱性中和剂为氨水、NaOH、Na2CO3^ NaHC03、CaCO3> Mg(OH)2和/或 MgCO3.Mg (OH)2,优选 Mg (OH) 2。具体地，本发明的技术目的通过下面的技术方案实现:
利用蔗糖发酵制备丁二酸，包括斜面培养(即菌种活化)、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤，其特征在于在厌氧发酵产酸的步骤中利用碳源为蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖。本发明包括菌种活化、种子培养与发酵罐培养等步骤，可以采用与传统方法基本相同的步骤，其主要区别是发酵罐培养步骤中所采用的碳源为纯蔗糖或者蔗糖与蔗糖-葡萄糖混合糖共用。本发明所述的厌氧发酵生产丁二酸的微生物为从特征厌氧环境中筛选出的丁二酸生产菌株产玻拍酸放线杆菌succinogenes NJ113 (CGMCC N0.1716)。此外，产琥珀酸放线杆菌YH123也可以用于实现本发明。本发明的有益效果在于:以蔗糖为碳源，所得丁二酸收率和生产速率均比利用葡萄糖发酵结果高，蔗糖浓度为100 g/L时，在血清瓶中厌氧培养能够产生57.1 g/L 丁二酸，发酵罐中单批发酵产生57.5g/L 丁二酸，而采用补料单批发酵则能够产生60.5 g/L 丁二酸，说明鹿糖能够替代葡萄糖，作为产琥拍酸放线杆菌Xe tinobaciIlus succinogenesNJ113 (CGMCC N0.1716)的碳源发酵生产丁二酸。
图1为产琥珀酸放线杆菌NJ113利用蔗糖补料分批发酵结果示意图。图2为产琥珀酸放线杆菌NJl 13利用蔗糖-葡萄糖混合糖补料分批发酵结果示意图。图3为产琥珀酸放线杆菌YH123利用蔗糖发酵结果示意图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1 利用蔗糖作为碳源生产丁二酸，具体方法如下:
本发明所述的制备丁二酸的方法可以使用现有技术中任何厌氧发酵产丁二酸的微生物菌种。本实施例所采用的产丁二酸的微生物菌种为:产琥珀酸放线杆菌NJ113(Actinobacillus succinogenes NJ113),该菌已申请专利并获得授权,专利授权公告号为CN100537744C。本发明所述的发酵培养基可以使用现有技术中任何厌氧发酵产丁二酸的发酵培基。
本实施例所采用的斜面培养基(g/L):葡萄糖10 (分消)，酵提取物5，玉米浆5，
NaHCO3 10，NaH2PO4.2Η20 9.6, K2HPO4.3Η20 15.5，琼脂 20。种子培养基(g/L):葡萄糖10 (分消)，酵提取物5，NaH2PO4.2H20 9.6,K2HPO4.3H20 15.5，NaHCO3 10，玉米浆 5，pH 7.0。发酵培养基(g/L):糖类10 100 g (分消)，乙酸钠 1.36,NaCl LCaCl2 0.2,MgCl2 0.2，Na2HPO4 0.31，NaH2PO4 1.6，K2HPO4，酵母提取物 15。本实施的具体步骤为:
(1)菌种活化:将冻存于-80°C冰箱的菌种融化后在斜面培养基中进行平板划线后，在温度为37°C的厌氧培养箱中活化培养48 h，活化好的单菌落用于种子培养基接种和菌株保存；
(2)种子培养:向100mL血清瓶中加入种子培养基50 mL，121 °C灭菌15min，冷却后接入斜面培养菌株，通入CO2 2 min, 37 °C培养，摇床转速200 r/min，培养时间为12 h，用于发酵培养基接种；
(3)血清瓶培养:100mL血清瓶中加入发酵培养基30 mL，加入碱性中和剂CaC03、Mg (OH)2、碱式MgCO3等，碱性中和剂与蔗糖比例为1:1，121°C灭菌15min，冷却后接入种子培养液，通入CO2 2min保证厌氧环境。接种完成后，培养温度为37°C，摇床转速200 r/min,培养时间为48h。(4)3L发酵罐发酵培养:3 L发酵罐中发酵培养基体积为1.5 L，接种量为5 % (v/V)，温度为37 °C，发酵罐中持续通入CO2以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速200 rpm，发酵过程采用20 % (WA)Na2CO3溶液作为碱性中和剂，控制pH在6.8，发酵时间为24 72 h。分析方法:
丁二酸等酸类代谢产物采用高效液相色谱法分析。采用仪器为德国DIONEXUltiMate3000高效液相色谱仪，检测器为RI和紫外检测器。其中，丁二酸，乙酸，甲酸等有机酸的测定使用 Aminex@HPX-87H 离子色谱柱(300 mmX 7.8 mm, 9 μ m ;Bio_Rad ChemicalDivision, Richmond, Calif.), 流动相 5 mM 硫酸；柱温 55 °C;流速 0.6 ml/min;进样量 20μ L0有机酸标准溶液(丁二酸(Fluka)、乙酸(Sigma)、甲酸(Fluka))用重蒸水配制。根据峰面积与有机酸标准溶液的浓度关系制作标准曲线。样品稀释后检测，根据峰面积计算各样品含量。蔗糖含量的测定采用DNS法，过程如下:发酵液离心后，5 M H2S04调节pH至1.0，90 1:水浴酸解90 min, 10 M NaOH调节pH至6.0，酸解后的发酵液稀释至蔗糖浓度为0_1g/L，采用DNS法测定酸解液中还原糖的浓度，在540 nm处测定吸光值。利用葡萄糖((Tl.0g/L)制作标曲。利用标曲，根据测定的吸光值计算出还原糖浓度，再换算成蔗糖浓度。丁二酸生产速率定义为丁二酸质量浓度(g -L-1)/发酵培养时间(h) ;丁二酸收率(%)定义为丁二酸质量浓度(g.L-1)/消耗的糖浓度(g*L-l)。本实施例选用蔗糖作为碳源用于生物法生产丁二酸。利用4(T120 g/L的蔗糖进行厌氧发酵，48 h后发酵液离心取样，测定有机酸和残余蔗糖含量，结果如下:
表I利用蔗糖发酵产丁二酸结果
权利要求
1.一种利用蔗糖发酵制备丁二酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (O斜面培养:将冻存菌种融化并在斜面培养基中进行平板划线后，在温度为30 40°C的厌氧培养箱中活化培养24 72 h，活化好的单菌落用于种子培养基接种和菌株保存； (2)种子培养:向100mL血清瓶中加入种子培养基30 60 mL，115 121 °C灭菌15 25 min，冷却后接入斜面培养菌株，通入CO2 I 3 min，30 40°C培养，摇床转速100 200 r/min，培养时间为10 16 h，用于发酵培养基接种； (3)血清瓶培养:100mL血清瓶中加入发酵培养基20 50 mL，加入碱性中和剂，115 121°C灭菌15 25 min,冷却后接入种子培养液,通入CO2 I 3min保证厌氧环境，接种完成后，培养温度为30 40°C，摇床转速100 200 r/min，培养时间为24 72 h ； (4)3L发酵罐发酵培养:3L发酵罐中发酵培养基体积为1.5 2 L，接种量为5 10%(v/v)，温度为30 40 °C，发酵罐中持续通入CO2以保持发酵体系的厌氧环境，搅拌转速100 300 rpm,发酵过程分别采用碱性中和剂控制pH在6.6 7.0,发酵时间为24 72h0
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述斜面培养基以IL计，含有:葡萄糖10g，酵提取物 5g，玉米浆 5g，NaHCO3 10g, NaH2PO4.2H20 9.6g，K2HPO4.3H20 15.5g，琼脂20g。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述种子培养基以IL计，含有:葡萄糖 10 g,酵提取物 5g，NaH2PO4. 2Η20 9.6g，K2HPO4.3Η20 15.5g, NaHCO3 10g，玉米浆 5g，pH 7.0。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述发酵培养基以IL计，含有:糖类 10 100 g,乙酸钠 1.36g, NaCl lg, CaCl2 0.2g, MgCl2 0.2g, Na2HPO4 0.31g, NaH2PO41.6g，K2HPO4g，酵母提取物 15g。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述糖类为蔗糖-葡萄糖混合糖，发酵培养过程中，先加入蔗糖使其浓度为50 g/L，当蔗糖浓度低于10 g/L，添加蔗糖-葡萄糖混合糖至糖浓度为10 g/L-40 g/L，所述混合糖中二者的总用量比为4:1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述糖类为浓度为50-100g/L的蔗糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述菌株为产琥珀酸放线杆菌(ActinobaciIlus succinogenes ) NJl 13。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)中碱性中和剂为氨水、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、CaCO3、Mg (OH) 2 和 / 或 MgCO3.Mg (OH) 2。
全文摘要
本发明公开了一种利用蔗糖发酵制备丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵产酸三步骤，并创造性地在厌氧发酵产酸的步骤中利用蔗糖和蔗糖-葡萄糖混合糖为碳源。采用本发明的技术方案所得丁二酸收率和生产速率均比利用葡萄糖发酵结果高，蔗糖浓度为100g/L时，在血清瓶中厌氧培养能够产生57.1g/L丁二酸，发酵罐中采用补料单批发酵则能够产生60.5g/L丁二酸。蔗糖-葡萄糖混合糖中蔗糖和葡萄糖的最佳比例为4:1，此时丁二酸的浓度和收率达到最大，分别为61.6g/L，85.3%。
文档编号C12P7/46GK103205468SQ20131014463
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月24日 优先权日2013年4月24日
发明者姜岷, 戴文宇, 奚永兰, 徐蓉, 张九花, 陈可泉, 张敏 申请人:南京工业大学