专利名称：核酸平行检测液相芯片及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术及临床检测技术领域，特别涉及一种用于呼吸道感染病原体诊断的核酸平行检测液相芯片及其制备方法与应用。背景技术：
呼吸道感染是常见的一种传染病。常见病因为病原体，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区，具有较强的传染性，而且若不及时治疗，炎症可波及其他器官发生相应症状，全身症状亦会加重。常见的并发症有鼻窦炎、中耳炎、眼结合膜炎等；年幼及体弱患儿，上呼吸道感染易向下发展，引起支气管炎及肺炎；少数并有细菌感染时对体弱儿还可引起全身及其他部位的并发症如败血症、脑膜炎以及肾炎。在呼吸道感染的治疗过程中，很多临床医生总是〃经验性〃地选用抗生素，忽略病原学的研究。但抗生素是用来对抗细菌的，对病原体感染一点作用也没有。而在全部呼吸道感染中有90%以上都是由病原体引起的，并不是细菌。因此若每一个呼吸道感染患者都使用抗生素，则有90% 以上都是不必要的。这样不仅导致药物资源的浪费，还造成抗生素的滥用，从而导致细菌耐药性；此外不同的细菌感染，所选用的抗生素种类、药量、天数也不同，因此明确呼吸道感染的病原体是应成为临床用药的一个基本准则。目前，呼吸道感染实验室诊断常用方法为病原体培养法，ELISA(酶联免疫吸附法)，分子生物学逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)或real-time RT-PCR (rRT-PCR)等，这些方法一次只能检测一种病原体，在实际应用过程中检测既繁琐又需要相对大量的试剂和临床标本，检测费用高，因此如果能运用新的技术将这些病原体进行同时检测，将会对这一类疾病的诊疗提供极大的方便。目前日益成熟的生物芯片技术的高通量的特点可以实现多种病原体的一次性的联合检测。液相芯片技术是生物芯片的一种，它除了具有普通生物芯片(即固相芯片)高通量的特点外，还具有固相芯片不具有的高稳定性、高敏感性等优点，因此呼吸道感染相关病原体平行检测液相芯片的研制和开发迎合了目前实验室和临床诊断的需要。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种检测迅速准确、省时省力的核酸平行检测液相芯片及其制备方法与应用。本发明是通过如下技术方案实现的:
一种核酸平行检测液相芯片，主要由对应呼吸道感染相关病原体的微球、探针、特异性引物、生物素化的通用引物及链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征在于:所述呼吸道感染相关病原体包括呼吸道合胞体病毒A、呼吸道合胞体病毒B、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、腮腺炎病毒、人冠状病毒、单纯疱疹病毒-1和单纯疱疹病毒-2共11中病原体，所述微球为分别与针对上述11种呼吸道感染相关病原体的特异性探针偶联形成的11、15、22、28、36、42、49、55、56、71和75号微球，所述探针是针对上述11种病原体靶基因的氨基化的特异性探针；所述特异性引物能对上述11种病原体进行特异性扩增；所述通用引物是与上述11种病原体靶基因无关的核酸序列，其中反向通用引物5’端带有生物素标记。本发明根据引发呼吸道感染病原体多样化的特点，针对目前检测采用的ELISA、RT-PCR和real-time RT-PCR等方法一次只能检测一种病原体技术的不便、繁琐费时和实验室及临床诊断的需要，选择针对呼吸道感染相关病原体靶基因的特异性探针，分别与不同色号的微球偶联，根据检测需要混合，初步制备出可对上述呼吸道感染相关病原体进行一次性平行检测的液相芯片。本发明检测的病原体指标如下:
权利要求
1.一种核酸平行检测液相芯片，主要由对应呼吸道感染相关病原体的微球、探针、特异性引物、生物素化的通用引物及链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征在于:所述呼吸道感染相关病原体包括呼吸道合胞体病毒A、呼吸道合胞体病毒B、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、腮腺炎病毒、人冠状病毒、单纯疱疹病毒-1和单纯疱疹病毒-2共11中病原体，所述微球为分别与针对上述11种呼吸道感染相关病原体的特异性探针偶联形成的11、15、22、28、36、42、49、55、56、71和75号微球，所述探针是针对上述11种病原体靶基因的氨基化的特异性探针；所述特异性引物能对上述11种病原体进行特异性扩增；所述通用引物是与上述11种病原体靶基因无关的核酸序列，其中反向通用引物5’端带有生物素标记。
2.根据权利要求1所述的核酸平行检测液相芯片，其特征为，所述每一条探针5’端带有一个氨基，其序列为:
3.根据权利要求1所述的核酸平行检测液相芯片，其特征为，所述特异性引物5’端带有通用引物标签，反向通用引物5 ’端带有一个生物素标志，其序列为， 特异性引物序列:
4.根据权利要求I所述的核酸平行检测液相芯片的制备方法，其特征为，主要包括如下步骤 (1)微球与氨基化的探针偶联形成偶联体，分别选取11种不同荧光色的羧基微球，洗涤、活化羧基微球；以11、15、22、28、36、42、49、55、56、71、75号微球的顺序分别对应地加入针对呼吸道合胞体病毒A、呼吸道合胞体病毒B、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒I、副流感病毒2、副流感病毒3、腮腺炎病毒、人冠状病毒、单纯疱疹病毒-I、单纯疱疹病毒-2的特异性氨基化探针；加入EDC混匀，室温下，以200 250 rpm的转速放在摇床上孵育120分钟；重复I 2次；用PBS-TBN洗涤2 3次；分别得到11种不同特异性探针与微球形成的偶联体；计数单位体积每种微球偶联体的数，分别于4 1条件下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合； (2)将特异性探针与微球偶联的偶联体、特异性引物、活化的生物素标记的通用引物、链霉亲和素-藻红蛋白按比例配置，得到呼吸道感染相关病原体平行检测液相芯片。
5.根据权利要求I所述的核酸平行检测液相芯片在制备呼吸道感染临床诊断和检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的核酸平行检测液相芯片的应用，其特征在于将标记有探针的微球偶联体、特异性引物、作为报告分子的活化的生物素标记的通用引物、链霉亲和素-藻红蛋白按比例配置，探针与相应的目的核酸特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与链霉亲和素-藻红蛋白特异性的结合，将混合物上样到Luminex 200，采用液相技术将微球偶联体分为单个细胞流，利用红、绿两束激光检测，获得光信号、处理数据就可完成对生物反应的实时、定量分析。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术及临床检测技术领域，特别公开了一种用于呼吸道感染病原体诊断的核酸平行检测液相芯片及其制备方法与应用。该核酸平行检测液相芯片，主要由对应呼吸道感染相关病原体的微球、探针、特异性引物、生物素化的通用引物及链霉亲和素-藻红蛋白组成，其特征在于所述微球为分别与针对11种呼吸道感染相关病原体的特异性探针偶联形成的11、15、22、28、36、42、49、55、56、71和75号微球，所述探针是针对11种病原体靶基因的氨基化的特异性探针。本发明实现对多种呼吸道感染相关病原体的平行检测，可同时检测11种病原体，方便不同的疾病的实验室和临床检测需要。
文档编号C12Q1/70GK103255231SQ20131014515
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月24日 优先权日2013年4月24日
发明者李艳艳, 张凯宁 申请人:山东艾克韦生物技术有限公司