一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的tps2启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体公开了一种姜花花部特异和受伤害、虫害诱导的TPS2启动子及其应用。所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明所述TPS2启动子调控的目的基因在转基因烟草中仅在花组织表达，其表达与花发育进程有关，且表达受伤害和虫害的诱导。而且本发明所述TPS2启动子可以连接到任意一种植物转化载体，然后导入姜花或其它植物细胞中，可获得含有所述启动子的转基因花香和抗性，从而用于生产；也可以根据本发明所述启动子序列信息产生特异性的分子标记，用于鉴定姜花或其它植物的花香和抗性基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。
【专利说明】一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地，涉及一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动子及其应用。
【背景技术】
[0002]启动子是位于结构基因5'端上游区的一段能识别并活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始的DNA序列。它是植物基因转录调控的中心，是理解基因转录调控机制和表达模式的关键。
[0003]根据启动子的转录模式可将其分为:组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。其中，组织特异型启动子亦称为器官特异启动子，包括果实特异启动子、根特异启动子、叶特异启动子及花器官特异启动子等。在这类启动子的调控下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位，并往往表现发育调控的特性。
[0004]花器官特异表达启动子可使目的基因在花中特异性表达，可有效控制目的基因在花中特异表达且与花发育进程密切相关，此外，花器官基因作用时还会受到许多诱导型等调控元件的协同作用。矮牵牛CHS的调控元件发现其中的一个G-box，是相关转录因子的结合域，是光、厌氧生活和ABA应答元件，受光和紫外线诱导调控，与花特异表达有关(洪亚辉等，2003)。当植物受到人为的创伤或害虫造成的机械损伤后，会产生一些小分子物质和多糖，它们作为信号物质诱导一系列防御基因的表达。土豆损伤基因蛋白酶抑制剂基因Pin II启动子伤诱导区域在启动子的近端区域，将-700~-195区段与_90CaMV35S启动子融合，发现嵌合启动子具有伤诱导的活性，因此认为该区段控制该基因的伤诱导表达。
[0005]花器官特异启动子不仅含有所必须的保守性顺式元件外，还含有一些组织特异型和诱导型启动子的特有序列。并且这种的组织特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为基础，由这类启动子中同时存在几种控制组织特异性表达的元件的种类、数目及相对位置等共同决定。 [0006]目前对转基因技术中启动子的选择主要采用组成型启动子，在组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和不同的发育阶段都会表达，且持续、高效的表达，没有时空特异性，造成了能量的损耗，影响阳性植株的成活率，引起植株生理和形态发生异常改变，从而影响植物的正常生长发育。由于组织特异和诱导型启动子能够有效地调控下游基因的表达，最大限度地减少由于外源蛋白在转基因植物体内的积累对其自身造成的伤害。Kasuga 等将 rd29A::DREBlA 和 35S::DREBlA 转化烟草，与 rd29A::DREBlA 转基因植株相比，35S::DREBlA转基因烟草明显出现生长滞后现象；rd29A::DREBlA转基因植株的胁迫耐性也明显高于35S::DREBlA转基因植株。Pellegrineschi用胁迫诱导型启动子rd29A驱动DREB1A/CBF3的表达，提高了转基因小麦对干旱胁迫的耐性，而且没有引起明显的畸形。
[0007]花作为植物重要的生殖器官，在利用植物杂种优势人工创建不育系、以花器官的表达元件研究一些基因特别是转录因子的功能等基因工程研究中起重要作用。其中花药特异表达启动子和花粉启动子起到了十分重要的作用。利用花药绒毡层特异启动子TA29、A9等构建雄性不育基因，创造雄性不育性植株已在烟草、油菜等获得成功。常小丽(2009)将从百合中克隆到的花部特异的CHS基因启动子转入拟南芥中发现，在转化植株的花序部位具有特异性表达。Kobayashi等发现,从三花龙胆(Getiana triflora)中克隆得到的CHS基因启动子可在矮牵牛的花瓣唇部特异性表达。Lewinsohn等采用E8启动子,将仙女扇的LIS基因导入番爺，成熟的果实合成并释放香气明显的S-芳樟醇和8-羟基芳樟醇。Davidovich等(2007)采用PG启动子，将柠檬罗烯香叶醇合成酶(GES)基因转入番茄，该基因在转基因番茄果实中过量表达导致香叶醇的积累量增加，成功的改变番茄果实风味。
[0008]随着植物基因工程技术的发展，组织特异和诱导型启动子可用于人为控制目标基因在植株的特定发育时期、特殊组织器官和相关逆境条件下精确表达，在改良作物的抗性、提高花卉的观赏状、改善果实和蔬菜的风味等方面具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0009]本发明的目的为了克服现有技术中对姜花花部特异和伤害、虫害诱导启动子的研究鲜见报道的缺陷，提供一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动子。
[0010]本发明的另一个目的是提供一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动子在培育改变花色、花香和育性等花部特有性状及提高抗虫能力的植物新品种的应用。
[0011]本发明通过以下技术方案予以实现上述目的:
[0012]一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动子，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示。该启动子总长度为1922bp，分段长度分别为782bp和321bp。TPS2启动子赋予姜花花香基因HcTPS2花部特异和伤害、虫害诱导表达特征。本发明所述的TPS2启动子序列与⑶S基因融合表达转化烟草后`，目标基因在烟草仅花组织表达，其表达与花发育进程有关，并且在叶片中表达受伤害、虫害和茉莉酸甲酯诱导。
[0013]经过软件分析得到所述TPS2启动子含有3个5'端系列缺失的目的片段p_320、p-780 和 p-1928, p-320、p-780 和 p-1928 的序列如 SEQIDN0:2 ~4 所示。
[0014]一种重组载体，所述重组载体为在出发载体的多克隆位点插入如上所述TPS2启动子序列(SEQIDN0:2)。所述出发载体可以是本【技术领域】中经常用到的所有类型的植物表达载体，优选地，本发明所用的植物表达载体为PCAMBIA1300G植物表达载体。
[0015]一种重组载体，所述重组载体为在出发载体的多克隆位点插入如上所述TPS2启动子的5'端系列缺失的目的片段p-320、p-780或p-1928序列。所述出发载体可以是本【技术领域】中经常用到的所有类型的植物表达载体，优选地，本发明所用的植物表达载体为PCAMBIA1300G植物表达载体。
[0016]一种包含如上所述重组载体的重组菌。
[0017]一种包含如上所述重组载体的细胞系。
[0018]TPS2启动子在培育改变花色、花香和育性等花部特有性状及提高抗虫能力的转基因植物新品种的应用。
[0019]一种培育转基因花香或抗性植物的方法，具体步骤为:将含有如上所述的重组载体导入出发植物细胞，从而得到TPS2启动子启动目的基因表达的转基因花香或抗性植物。[0020]优选地，所述目的基因为⑶S基因。
[0021]本发明同样包括将三种长度的启动子片段作为主要结构部分有效地连接上合适的目标功能基因所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种启动子片段的植物和这种植物的种子。
[0022]根据本发明提供的启动子DNA序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得等同的启动子DNA序列:(I)通过数据库检索获得；(2)以启动子DNA片段为探针筛选姜花或其它植物的基因组文库获得；(3)根据启动子DNA序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从姜花或其它植物的基因组中获取；(4)在启动子DNA序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得。
[0023]本发明提供的启动子DNA序列具有重要的应用价值。应用之一是将所述的启动子DNA序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将启动子DNA序列导入植物细胞，可获得表达所述花部特异和伤害、虫害诱导表达特征，从而应用于生产。本发明所述的启动子DNA序列构建到植物转化载体中，可以对融合表达的下游基因进行调控，从而增强植物产生花香和增强抗性等能力。
[0024]本发明提供的启动子DNA序列的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP (单核苷酸多态)、SSR (简单序列重复多态)、RFLP (限制性内切酶长度多态)、CAP (切割扩增片段多态)。用这些标记可鉴定姜花或其它植物的花香基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0026]本发明将克隆的TPS2启动子DNA序列与控制花色、花香和抗性目标功能基因结合，有助于产生新的花色、花香和抗 性植物，而且不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。另外，本发明能够进一步提供或应用上述TPS2启动子DNA片段获得的新花色、花香和抗性的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的启动子转入其他的植株。
[0027]说明书附图
[0028]图1.TPS2启动子与⑶S融合表达的转基因烟草⑶S在不同组织表达特异性；a:不同组织⑶S染色情况；b:不同组织⑶S酶活力情况。
[0029]图2.TPS2启动子与⑶S融合表达的转基因烟草⑶S在花器官不同发育时期的表达;A:不同发育时期GUS染色情况，其中图示I为未开放的花苞；2为半开状态的花瓣；3为盛开状态下的花瓣；4为衰老的花瓣；B:不同发育时期GUS酶活力情况，其中图示I~4同A。
[0030]图3.不同长度片段TPS2启动子与GUS融合表达的转基因烟草GUS在花瓣中茉莉酸甲酯处理，伤害处理后的表达；A:不同处理后花瓣中GUS染色情况；B:不同处理后花瓣中GUS酶活力情况；图示I为未处理的花瓣，2为茉莉酸甲酯处理的花瓣，3为伤害处理的花瓣。
[0031]图4.TPS2启动子与GUS融合表达的转基因烟草GUS在叶片中茉莉酸甲酯，伤害和虫害的诱导表达；A:不同处理后叶片中GUS染色情况；B:不同处理后叶片中GUS酶活力情况，图示I为未处理，2为茉莉酸甲酯处理，3为伤害处理，4为虫害处理。[0032]图5.不同长度片段TPS2启动子与GUS融合表达的转基因烟草植株的PCR检测图；A:P-1928转基因植株PCR检测；B:P_780转基因植株PCR检测；C:P_320转基因植株PCR检测。
[0033]图6.TPS2启动子p-780片段与花香基因HcTPSl融合表达的转基因烟草植株的PCR检测图；A:转基因烟草用HcTPS2启动子特异引物扩增；B:转基因烟草用潮霉素引物特异引物扩增；C:转基因烟草用HcTPSl基因特异引物扩增。
【具体实施方式】
[0034]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法均为本领域常规使用的试剂和方法。
[0035]实施例1
[0036]TPS2启动子序列的获得
[0037]S1.姜花叶片总DNA的提取:将经液氮研磨的0.1~0.2g姜花植物叶片粉末转移至1.5mL离心管中。加入ImLCTAB溶液，65°C水浴30分钟；每隔10分钟，颠倒一次。然后，向离心管中加入ImL酚:氯仿(I: I)，颠倒几次，1000Orpm离心10分钟，转移上清至一新的离心管，加等体积的氯仿:异戊醇(24: I)，混匀，1000Orpm离心10分钟。转移上清至一新的离心管。加等体积的异丙醇，颠倒混匀，1000Orpm离心10分钟，除去上清，70%乙醇洗一次，真空抽干，溶于30yL的无菌水中，用于PCR扩增。所述CTAB溶液的组成为:TrislOOmM, NaCll.4M, 20mMEDTA, CTAB2%，巯基乙醇 0.1%。
[0038]S2.采用hiTAIL-PCR技术克隆HcTPS2基因的5'端上游调控序列:根据发明人之前获得的姜花HcTPS2 基因的序列(见 Li 和 Fan, 2011，Molecular Cloning and ExpressionAnalysis of a Terpene Synthase Gene, HcTPS2, in Hedychium coronarium.PlantMolecular Biology Reporter29 (I): 35-42),在其5'端设计3个向外的特异性巢式引物spl、sp2、sp3,随机简并引物设计参照Liu等(2007)文献中设计的5个随机简并引物(Liu,2007, BioTechniques,43 (5):649_656)。具体序列如下:
[0039]spl:5’-CGGATATCATGGGAGCACAGATAGTAGTGC-3’ (SEQID NO:6)
[0040]sp2:5’-CTACACGATCACTACTTTGGAGCCTTGTCCTTC-3’ (SEQID NO:7)
[0041]sp3:5’-ATGAGGTCAGAGTTGTCGTGTGGATTTGGGCGTAG-3’ (SEQIDN0:8)
[0042]LAD-1:5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA-3，(SEQIDN0:9)
[0043]LAD-2:5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT-3’ (SEQIDN0:10)
[0044]LAD-3: 5，-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCWNVNNNCCAA-3，( SEQIDN0:11)
[0045]LAD-4:5’-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT-3’ (SEQIDN0:12)
[0046]ACl:5，-ACGATGGACTCCAGAG-3’ (SEQIDN0:13)
[0047]扩增的体系和程序参照Liu等(2007)文献中的进行。把扩增出DNA片段从琼脂糖胶中回收并连接到pMD-lOTvector，转化E.col1.DH5 α，酶切鉴定后测序。测序序列如SEQIDN0:1所示；SEQIDN0:1所示序列包括启动子TPS2序列和起始密码子之后的基因的部分ORF序列。起始密码子之前的序列就是启动子TPS2的核苷酸序列，序列长1922bp，如SEQIDN0:2 所示。
[0048]将启动子TPS2的核苷酸序列(SEQIDN0:2所示)提交在线启动子分析软件，预测启动子中包含的顺式调控元件，结果发现:启动子TPS2的核苷酸序列分成3个5'端系列缺失的目的片段;3个5'端缺失序列分别为p-320、p-780和p-1928。p-320长度约为320bp(SEQIDNO: 3 所示);p-780 约 78Ibp (SEQIDN0:4 所示);p_1928 约 192Ibp (SEQIDN0:5 所示)。
[0049]TPS2启动子调控元件分析
【权利要求】
1.一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的TPS2启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。
2.根据权利要求1所述TPS2启动子，其特征在于，所述TPS2启动子含有3个5'端系列缺失的目的片段p-320、p-780和p-1928，p_320、p-780和p-1928的序列如SEQ IDNO:3~5所示。
3.—种重组载体，其特征在于，所述重组载体为在出发载体的多克隆位点插入权利要求I所述TPS2启动子序列。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体为在出发载体的多克隆位点插入权利要求2所述TPS2启动子的5'端系列缺失的目的片段p-320、p-780或p-1928序列。
5.一种包含权利要求3或4所述重组载体的重组菌。
6.一种包含权利要求3或4所述重组载体的细胞系。
7.权利要求1所述TPS2启动子在培育转基因花香或抗性植物品种中的应用。
8.一种培育转基因花香或抗性植物的方法，其特征在于，将含有权利要求3或4所述的重组载体导入出发植物细胞，从而得到TPS2启动子启动目的基因表达的转基因花香或抗性植物。
9.根据权利要求8所述 方法，其特征在于:所述目的基因为GUS基因。
【文档编号】C12N15/113GK103525816SQ201310370871
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】范燕萍, 李昕悦, 余让才, 吴永琼, 岳跃冲, 玉云祎 申请人:华南农业大学