Hbv b 基因型1799g>c 突变作为分子标记的应用及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了HBV?B基因型1799G>C突变作为分子标记的应用及试剂盒，基于HBV?B基因型的1799位点突变同肝硬化/肝癌具有极高的相关性；第1799位G/C多态性作为分子标记可以应用于制备提示HBV?B基因型感染者疾病进程趋势的试剂或试剂盒；并作为制备提示HBV?B基因型感染者演变成肝硬化/肝癌进程可能性的试剂或药物的靶点；从而能够在感染早期预测感染B基因型乙肝病毒的病程进展，从而在感染初期协助治疗患者，避免肝病进程加速转为严重肝病甚至肝癌，也有利于预后目标的监测。
【专利说明】HBV B基因型1799G>C突变作为分子标记的应用及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于こ型肝炎病毒的防治【技术领域】，涉及HBV B基因型1799G>C突变作为分子标记的应用及试剂盒。
【背景技术】
[0002]大量的文献报道，こ型肝炎病毒(HBV)是我国肝硬化/肝癌发生的最主要因素，约90%以上的肝硬化/肝癌患者发现こ型肝炎病毒感染。我国是こ肝发病率最高的国家，所以对于こ肝病毒感染的早期诊断对肝病发展进程控制显得尤为重要。こ肝病毒感染后导致肝硬化/肝癌的机理尚未明确，但HBV整合至人类肝脏细胞的基因组内所引发慢性肝病甚至肝硬化/肝癌的现象已得到充分证实。我国HBV感染以B型和C型为主，南方地区B型多于C型，北方地区C型多于B型。尽管HBV基因组突变与药物治疗性耐药的关系、突变与HBeAg表达的关系、基因型与疾病预后的关系已有报道，然而HBV基因组BCP区(basic corepromoter)1799位碱基G>C突变与HBV感染、基因型以及肝硬化/肝癌的关系尚未见报道。经文献检索，仅发现个别研究提示该突变与B型HBV感染后HBeAg的假性转阴相关。
【发明内容】
[0003]本发明解决的问题在于提供HBV B基因型1799G>C突变作为分子标记的应用及试剂盒，可以在感染初期提早发现，协助治疗患者，避免肝病进程加速转为严重肝病甚至肝癌，也有利于预后目标的监測。
[0004]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0005]第1799位G/C多态性作为分子标记在制备提示HBV B基因型感染者疾病进程趋势的试剂或试剂盒中的应用 。
[0006]基于所述的试剂或试剂盒的扩增产物的DNA测序結果，依据第1799位G/C多态性给出的野生型或突变型的提示--第1799位为G则为野生型，第1799位为C则为突变型。
[0007]HBV B基因型第1799位的G>C突变在制备提示HBV B基因型感染者演变成肝硬化/肝癌进程可能性的试剂或药物中作为靶点的应用。
[0008]所述的试剂或药物作出提示还依赖于DNA测序結果。
[0009]ー种提示HBV B基因型感染者疾病进程趋势的试剂盒，包括基于HBV的PreS2、S区的分型检测引物对、1799位点突变检测引物对、以及含有DNA扩增酶和底物的PCR反应液；
[0010]该试剂盒还包括一个基于扩增产物DNA测序结果的提示卡，提示卡提示第1799位为G则为野生型，第1799位为C则为突变型；其中突变型的感染者具有巨大可能性导致感染こ肝病毒后演变成肝硬化/肝癌。
[0011]所述的分型检测引物对包括:
[0012]PreS2、S 外巢上游引物:atgtgtctgc ggcgttttat ；
[0013]PreS2、S 外巢下游引物:actttccaat caatagg ；[0014]PreS2、S 内巢上游引物:gttgtaaaac gacggccagg ttgcccgttt gtc ；
[0015]PreS2、S 内巢下游引物:actttccaat caatagg ；
[0016]所述的1799位点突变检测引物对包括:
[0017]BCP 外巢上游引物:tcgcttcacc tctgcac ；
[0018]BCP外巢下游引物:aaaaaagtca gaaggcaaaa a ；
[0019]BCP 内巢上游引物:gttgtaaaac gacggccaga atgtcaacga ccgacctt ；
[0020]BCP 内巢下游引物:aaaaaagtca gaaggcaaaa a。
[0021]所述试剂盒的扩增程序为:
[0022]第一轮外巢扩增:95°C预变性5min ;94°C变性30s、52°C退火30s、72°C延伸50s，40个循环数；72°C延伸5min ；
[0023]第二轮内巢扩增:95°C预变性5min ;94°C变性30s、52°C退火30s、72°C延伸50s，30个循环数；72°C延伸5min。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0025]本发明提供的HBV B基因型1799G>C突变作为分子标记的应用及试剂盒，是基于HBV B基因型的1799位点突变同肝硬化/肝癌具有极高的相关性；该相关性是通过长期的基因筛查发现的，并基于这ー现象的发现，通过引物设计并结合金标准ーDNA测序为基础而建立试剂盒，通过HBV的PreS2、S区测序分型，进而检测B基因型HBV的1799位点多态性(是否突变)。
[0026]结果表明，第1799位G/C多态性作为分子标记可以应用于制备提示HBVB基因型感染者疾病进程趋势的试剂或试剂盒；并作为制备提示HBV B基因型感染者演变成肝硬化/肝癌进程可能性的试剂或药物的靶点；从而能够在感染早期预测感染B基因型こ肝病毒的病程进展，从而在感染初期协助治疗患者，避免肝病进程加速转为严重肝病甚至肝癌，也有利于预后目标的监測。【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为中国人群感染的HBV的序列比对结果图；
[0028]图2-1为PreS2、S区扩增电泳结果图；图2_2为BCP区扩增电泳结果图，其中泳道1为第一轮外巢扩增，泳道2为第二轮内巢扩增。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体的实施例对本发明做进ー步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0030]针对HBV病毒，通过美国国立卫生信息中心数据库(NCBI)搜索中国人群感染的HBV的B基因型，B2基因亚型，C基因型，C1基因亚型，C2基因亚型的全基因组序列。
[0031]将所有各基因型及各基因亚型进行Clustal比对，寻找PreS2、S基因区及BCP区的型间保守区，比对结果如图1所示，其中箭头标示为1799位点。
[0032]1、分析设计扩增区域和引物
[0033]在上述分析的基础上，使用Primerf设计扩增引物如表1所示，相应的扩增程序如表2所示；目标在于稳定扩增各HBV基因型的PreS2、S区分型检测序列以及BCP区突变(1799位点突变)检测序列。
[0034]表1分型检测引物及BCP区突变检测引物
【权利要求】
1.第1799位G/C多态性作为分子标记在制备提示HBVB基因型感染者疾病进程趋势的试剂或试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，基于所述的试剂或试剂盒的扩增产物的DNA测序结果，依据第1799位G/C多态性给出的野生型或突变型的提示:第1799位为G则为野生型，第1799位为C则为突变型。
3.HBV B基因型第1799位的G>C突变在制备提示HBV B基因型感染者演变成肝硬化/肝癌进程可能性的试剂或药物中作为靶点的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂或药物作出提示还依赖于DNA测序結果。
5.ー种提示HBV B基因型感染者疾病进程趋势的试剂盒，其特征在于，包括基于HBV的PreS2、S区的分型检测引物对、检测1799位点突变的BCP区扩增引物对、以及含有DNA扩增酶和底物的PCR反应液； 该试剂盒还包括一个基于扩增产物DNA测序结果的提示卡，提示卡提示第1799位为G则为野生型，第1799位为C则为突变型；其中突变型的感染者具有巨大可能性导致感染乙肝病毒后演变成肝硬化/肝癌。
6.如权利要求5所述的提示HBVB基因型感染者疾病进程趋势的试剂盒，其特征在于，所述的分型检测引物对包括: PreS2、S 外巢上游引物:atgtgtctgc ggcgttttat ； PreS2> S 外巢下游引物:actttccaat caatagg ； PreS2、S 内巢上游引物:gttgtaaaac gacggccagg ttgcccgttt gtc ； PreS2、S 内巢下游引物:actttccaat caatagg ； 所述的BCP区扩增引物对包括: BCP 外巢上游引物:tcgcttcacc tctgcac ； BCP 外巢下游引物:aaaaaagtca gaaggcaaaa a;
BCP 内—t?字5丨ネ勿:gttgtaaaac gacggccaga atgtcaacga ccgacctt ； BCP 内巢下游引物:aaaaaagtca gaaggcaaaa a。
7.如权利要求6所述的提示HBVB基因型感染者疾病进程趋势的试剂盒，其特征在于，所述PreS2、S区的分型检测引物对、BCP区扩增引物对扩增使用同样巢式程序，其扩增程序包括: 第一轮外巢扩增:95°C预变性5min ;94°C变性30s、52°C退火30s、72°C延伸50s，40个循环数；72°C延伸5min ； 第二轮内巢扩增:95°C预变性5min ;94°C变性30s、52°C退火30s、72°C延伸50s，30个循环数；72°C延伸5min。
【文档编号】C12Q1/68GK103451319SQ201310370575
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】颜真, 包晗, 王伟华 申请人:中国人民解放军第四军医大学