一种提高百合多糖活性的酶法修饰制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法，属于农产品功能成分制备【技术领域】。采用复合酶(β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)法对百合多糖(403.3kDa)进行生物修饰(即酶法可控降解)。修饰后经分离纯化，产物百合多糖的分子量为8.0kDa～70.0kDa。采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖及其修饰产物体外免疫调节活性。修饰后的百合多糖活性显著提高，与底物相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5～77.2％。百合多糖的分子量过高或过低，其活性都较低。本发明创立了提高百合多糖免疫活性的方法，生物修饰后的百合多糖在医药和功能食品领域更具应用价值。
【专利说明】一种提高百合多糖活性的酶法修饰制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农产品功能成分制备【技术领域】，涉及一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法。
【背景技术】
[0002]百合是国家卫生部审批通过的首批药食两用品之一，不仅在临床上有着广泛的应用，而且还具有很好的保健作用，百合多糖是百合的主要功能因子之一。研究表明百合多糖具有增强免疫，抗肿瘤等生物活性。通过超声波辅助热水浸提法，我们从百合中提取一种百合多糖，分子量为403.3kDa，主要由甘露糖、葡萄糖按1:1的摩尔比通过β _1，4糖苷键组成(含有少量I —2或1 — 6键型)，还含有微量的阿拉伯糖和少量硫酸基团。采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖免疫调节活性，发现该百合多糖活性较低，主要原因可能是其分子量过大，粘度较高所致。因此，通过对百合多糖化合物结构进行改造，降低分子量，寻找活性更强的百合多糖修饰产物的研究具有重要意义。
[0003]对于化合物的分子修饰，可采用物理、化学或生物(酶法)。相对于物理或化学方法，采用酶法对百合多糖进行降解具有专一性强，反应可控，产物分子量分散度小等优点。β -甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β -1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及甘露聚糖。葡聚糖酶能专一性作用于葡聚糖的β_1，4和β_1，3糖苷键产生低聚糖。但是，我们前期的实验表明两种酶单独作用于百合多糖时效率较低。因为两种酶有着相似的最适作用温度和ΡΗ，因此我们将两种酶以一定的用量比复合应用于百合多糖的降解，获得较好的作用效果O
[0004]本发明采用复合酶(β_甘露聚糖酶和β_葡聚糖酶)法对百合多糖进行可控降解修饰，通过反应条件控制，以期获得系列高活性的百合多糖修饰产物。
【发明内容】
[0005]技术问题
[0006]本发明的目的在于针对百合多糖活性低的问题，提供一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法。
[0007]技术方案
[0008]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0009]采用复合酶(β -甘露聚糖酶和β -葡聚糖酶)法对百合多糖(403.3kDa)进行生物修饰，酶作用条件为:底物百合多糖浓度30?40g/L ； β -甘露聚糖酶浓度500?900U/L, β-葡聚糖酶250?450U/L ；ρΗ5.5?6.5 (PBS缓冲液);温度40?55°C ;时间0.5?
1.0h。
[0010]反应结束后去除酶及产物分离制备方法为:反应结束后，将溶液加热至100°C，保温5min,而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4°C，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物，百合多糖修饰产物的分子量是8.0kDa?70.0kDa0
[0011]采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖及修饰产物体外免疫调节活性，修饰后的百合多糖活性显著提高，与底物相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5?77.2%。
[0012]本发明技术与产品具有如下的有益效果:采用酶法对百合多糖进行降解修饰具有专一性强，反应可控，产物分子量分散度小等优点；通过可控降解修饰，修饰产物的免疫活性明显提高，生物修饰后的百合多糖可广泛应用于医药和功能食品领域。
【具体实施方式】
[0013]研究中所用的酶活力及生产公司如下甘露聚糖酶(10000U/g)，禾本生物工程有限公司；β-葡聚糖酶(50000U/g)，上海工硕生物技术有限公司。
[0014]实施例1
[0015]按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰:底物百合多糖浓度30/L ；β-甘露聚糖酶浓度500U/L，β-葡聚糖酶250U/L;pH5.5(PBS缓冲液)；温度40°C;时间0.5h。反应结束后，将溶液加热至100 °C,保温5min,而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4°C，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量:70.0kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5%。
[0016]实施例2
[0017]按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰:底物百合多糖浓度35/L ；β-甘露聚糖酶浓度600U/ L，β-葡聚糖酶300U/L;pH6.0(PBS缓冲液)；温度45°C;时间40min。反应结束后，将溶液加热至100°C,保温5min,而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4°C，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量:50.3kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加45.2%。
[0018]实施例3
[0019]按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰:底物百合多糖浓度40/L ；β-甘露聚糖酶浓度700U/L，β-葡聚糖酶350U/L;pH6.5(PBS缓冲液)；温度45°C;时间50min。反应结束后，将溶液加热至100°C,保温5min,而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4°C，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量:40.5kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加55.0%。
[0020]实施例4
[0021]按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰:底物百合多糖浓度35/L ；β-甘露聚糖酶浓度800U/L，β-葡聚糖酶400U/L;pH6.0(PBS缓冲液)；温度50°C:时间45min。反应结束后，将溶液加热至100°C,保温5min,而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4°C，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量:30.5kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加77.2%。[0022]实施例5
[0023]按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰:底物百合多糖浓度30/L ；β-甘露聚糖酶浓度850U/L，β-葡聚糖酶425U/L;pH6.5(PBS缓冲液)；温度50°C;时间50min。反应结束后，将溶液加热至100°C,保温5min,而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4°C，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量:18.3kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加60.8%。
[0024]实施例6
[0025]按下列条件及操作利用复合酶对百合多糖进行修饰:底物百合多糖浓度30/L ；β-甘露聚糖酶浓度900U/L，β-葡聚糖酶450U/L ;pH6.5 (PBS缓冲液)；温度55°C;时间Ih。反应结束后，将溶液加热至100°C，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4°C，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物(分子量:8.0kDa)，与底物百合多糖相比，对巨噬细 胞增殖活性增加50.8%。
【权利要求】
1.一种提高百合多糖活性的生物修饰制备方法，其特征在于采用复合酶(β-甘露聚糖酶和β -葡聚糖酶)法对百合多糖(403.3kDa)进行生物修饰(即酶法可控降解)，通过反应条件控制，获得系列高免疫活性百合多糖修饰产物。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于复合酶的作用条件为:底物百合多糖浓度30?40g/L ； β -甘露聚糖酶浓度500?900U/L，β -葡聚糖酶250?450U/L ；ρΗ5.5?6.5 (PBS缓冲液);温度40?550C ;时间0.5?1.0h。
3.根据权利要求1?2所述的方法，在复合酶中，β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶用量比为 2:1 (U/U)。
4.根据权利要求1?3所述的方法，其特征在于反应结束后去除酶及产物分离制备方法为:反应结束后，将溶液加热至100°C，保温5min，而后离心(6000rpm)去除酶蛋白，将上清液放入透析袋(截留分子量为5.0kDa)内透析(4°C，12h)，透析结束后将样品离心(5000rpm)，取上清液冷冻干燥，即可获得白色粉末状百合多糖修饰产物，百合多糖修饰产物的分子量范围是8.0kDa?70.0kDa0
5.根据权利要求1?4所述的方法，其特征在于采用体外巨噬细胞RAW264.7模型研究百合多糖及修饰产物体外免疫调节活性，修饰后的百合多糖活性显著提高，与底物相比，对巨噬细胞增殖活性增加40.5?77.2%。百合多糖的分子量过高或过低，其活性都较低。
6.根据权利要求1?5所述的方法，其特征在于百合多糖、β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶，pH，温度及作用时间优选组合为35g/L、800U/L和400U/L、6.0 (PBS缓冲液)、50°C和45min。在此作用条件下，百合多糖修饰产物的分子量为30.5kDa。与底物百合多糖相比，对巨噬细胞增殖活性增加77.2%。
【文档编号】C12P19/14GK103436571SQ201310404673
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】陈志刚, 张丹妮, 王芬, 郭晓玉 申请人:南京农业大学