经代谢的经调节的生长培养基和使用方法

经代谢的经调节的生长培养基和使用方法
【专利摘要】本发明描述了包含经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物的组合物和使用方法。经代谢的经调节的生长培养基和经代谢的细胞提取物组合物可以与可接受的载体一起配制在可注射制剂或局部制剂中，例如，作为霜剂、洗剂或凝胶，且可以用于药妆或药物应用。经代谢的经调节的生长培养基和经代谢的细胞提取物还可以被进一步处理以浓缩或减少包含在经代谢的经调节的生长培养基或经代谢的细胞提取物内的一种或多种要素或组分。生长培养基可以通过任何真核细胞来调节。经代谢的经调节的生长培养基和经代谢的细胞提取物可以用于防止或治疗病状，例如皮肤病状。
【专利说明】经代谢的经调节的生长培养基和使用方法
[0001]本申请是申请日为2011年11月11日，申请号为201180064131.0，发明名称为“经代谢的经调节的生长培养基和使用方法”的发明专利申请的分案申请。
[0002]交叉引用
[0003]本申请要求2010年11月12日提交的美国临时申请第61/413，166号的权益，通过引用以其整体并入本文。
发明领域
[0004]本公开内容涉及包含经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物的组合物，和用于通过向受试者施用组合物防止或治疗病状例如皮肤病状的方法。
[0005]发明背景
[0006]培养基组合物通常包含必需氨基酸、盐、维生素、矿物质、微量金属、糖、脂质和核苷。细胞培养基努力供应满足使细胞在控制的、人造的和体外的环境中生长所需要的营养需求必需的组分。营养素制剂、pH和同渗容摩根据参数例如细胞类型、细胞密度和采用的培养系统而改变。许多细胞培养基制剂在文献中被证明，且许多培养基是商购的。一旦培养基用细胞温育，其就被本领域技术人员称为“废的”或“经调节的培养基”。经调节的培养基包含培养基的许多原始组分，以及各种细胞代谢物和分泌的蛋白，分泌的蛋白包括，例如生长因子、炎性媒介物和其他胞外蛋白。
[0007]发明概述
[0008]在一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基是由酵母细胞代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，经调节的生长培养基通过在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生`长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基来制备。在其他实施方案中，组合物是局部的或可注射的组合物。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在一个实施方案中，组合物使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在一个实施方案中，组合物减淡细纹和皱纹的外观；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善皮肤纹理、肤色和弹性；减少粗糙度和光损伤；加强皮肤本身再生的能力；防止或减少环境损伤；使皮肤光滑和紧致；使老年斑变亮和减淡；减少细纹和粗纹以及皱纹；改善细的和粗的眼周皱纹的外观；改善鼻唇沟的外观；改善口周皱纹；改善面部细纹和粗纹；改善肤色、发光度和均匀度；改善皮肤紧致度；减少触觉粗糙度；改善皮肤纹理、总的光损伤、总的色素沉着过多；整体改善；减淡黑斑和/或斑纹的外观；改善皮肤亮度外观和年轻外观；改善皮肤的总病状；改善光老化皮肤的外观；改善内在和外在老化的皮肤的外观；改善皮肤细胞更新；改善皮肤屏障；改善皮肤保持水分的能力；减淡褐色和红色斑点、发红的外观；增加皮肤表皮厚度；加强真皮表皮连接；减少孔尺寸和孔的出现；改善光滑度，或其组合。
[0009]在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善至少2倍。一种或多种症状或病状的改善倍数包括但不限于，3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之间的任何数量。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致改善约1%至约100%、约10%至约90%、约20%至约80%、约30%至约70%、约40%至约60%、或约50%。在其他实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 100%、约 125%、约 150% 或一种或多种症状或病状改善更多。
[0010]在其他实施方案中，本公开内容还提供包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物是由酵母细胞代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，细胞提取物源自动物细胞、皮肤细胞或成纤维细胞。在其他实施方案中，组合物是局部的或可注射的组合物。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色 素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
[0011]在一个实施方案中，本公开内容提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基:(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；(b)培养酵母细胞；(C)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。
[0012]在另一个实施方案中，本公开内容提供用于制备经代谢的经调节的生长培养基的工艺，该工艺包括:(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；(b)培养酵母细胞；(C)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。
[0013]在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物。在另一个实施方案中，公开内容提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物，其中局部组合物用于治疗或防止皮肤病状。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在一些实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
[0014]在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物，其中局部组合物用于治疗或防止皮肤病状，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01%至约50%的量存在，且经代谢的经调节的生长培养基通过在足以满足使酵母细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养酵母细胞以形成经调节的生长培养基来制备。
[0015]在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的皮肤病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观`下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
[0016]在一个实施方案中，本公开内容提供用于治疗脱发的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于刺激毛发生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的先天性缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的外观缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在一个实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的后天缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。所述方法可以使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；改善肤色、纹理和/或紧致度；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观；减淡细纹和皱纹的外观；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善皮肤纹理、肤色和弹性；减少粗糙度和光损伤；加强皮肤本身再生的能力；防止或减少环境损伤；使皮肤光滑和紧致；使老年斑变亮和减淡；减少细纹和粗纹以及皱纹；改善细的和粗的眼周皱纹的外观；改善鼻唇沟的外观；改善口周皱纹；改善面部细纹和粗纹；改善肤色、发光度和均匀度；改善皮肤紧致度；减少触觉粗糙度；改善皮肤纹理、总的光损伤、总的色素沉着过多；整体改善；减淡黑斑和/或斑纹的外观；改善皮肤亮度外观和年轻外观；改善皮肤的总病状；改善光老化皮肤的外观；改善内在和外在老化的皮肤的外观；改善皮肤细胞更新；改善皮肤屏障；改善皮肤保持水分的能力；减淡褐色和红色斑点、发红的外观；增加皮肤表皮厚度；加强真皮表皮连接；减少孔尺寸和孔的出现；改善光滑度，或其组合。
[0017]在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减淡细纹和皱纹的外观的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减少老年斑和色素沉着异常的出现的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于改善皮肤纹理、肤色和弹性的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减少粗糙度和光损伤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于加强皮肤本身再生的能力的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或减少环境损伤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于使皮肤平滑和紧致的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于使老年斑变亮和减淡的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的经调节的生长培养基。
[0018]在另一个实施方案中，本公开内容提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物:(a)提供细胞提取物；(b)培养酵母细胞；(C)将酵母细胞暴露于细胞提取物；(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的经调节的细胞提取物。
[0019]在另一个实施方案中，本公开内容提供用于制备经代谢的细胞提取物的工艺，该工艺包括:(a)提供细胞提取物；(b)培养酵母细胞；(C)将酵母细胞暴露于细胞提取物；(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的细胞提取物。
[0020]在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物。在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物，其中局部组合物用于治疗或防止皮肤病状。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
[0021]在另一个实施方案中，本公开内容提供包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物，其中局部组合物用于治疗或防止皮肤病状，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01%至约50%的量存在，且经代谢的细胞提取物是由酵母细胞代谢的细胞提取物。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在一个实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。
`[0022]在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的皮肤病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于治疗脱发的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于刺激毛发生长的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的先天性缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的外观缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在一个实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量?’促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或治疗受试者中的后天缺陷的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。所述方法可以使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；改善肤色、纹理和/或紧致度；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，减淡细纹和皱纹的外观；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善皮肤纹理、肤色和弹性；减少粗糙度和光损伤；加强皮肤本身再生的能力；防止或减少环境损伤；使皮肤光滑和紧致；使老年斑变亮和减淡；减少细纹和粗纹以及皱纹；改善细的和粗的眼周皱纹的外观；改善鼻唇沟的外观；改善口周皱纹；改善面部细纹和粗纹；改善肤色、发光度和均匀度；改善皮肤紧致度；减少触觉粗糙度；改善皮肤纹理、总的光损伤、总的色素沉着过多；整体改善；减淡黑斑和/或斑纹的外观；改善皮肤亮度外观和年轻外观；改善皮肤的总病状；改善光老化皮肤的外观；改善内在和外在老化的皮肤的外观；改善皮肤细胞更新；改善皮肤屏障；改善皮肤保持水分的能力；减淡褐色和红色斑点、发红的外观；增加皮肤表皮厚度；加强真皮表皮连接；减少孔尺寸和孔的出现；改善光滑度，或其组合。
[0023]在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减淡细纹和皱纹的外观的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于减少老年斑和色素沉着异常的出现的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于改善皮肤纹理、肤色和弹性的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提 供用于减少粗糙度和光损伤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于加强皮肤本身再生的能力的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于防止或减少环境损伤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于使皮肤平滑和紧致的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。在另一个实施方案中，本公开内容提供用于使老年斑变亮和减淡的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的经代谢的细胞提取物。
[0024]在一个实施方案中，还提供包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物，其中经代谢的经调节的生长培养基是由酵母细胞代谢的经调节的生长培养基。在一个实施方案中，经调节的生长培养基通过在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基来制备。在另一个实施方案中，组合物是可注射组合物或局部组合物。在又一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在另一个实施方案中，经代谢的调节生长培养基被封装在密封剂内。在一个实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降?’老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在一些实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹(circum-oral geographical wrinkle)、双颊凹陷或乳房发育不全。在其他实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在一些实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后或感染后发生的医疗病状。在其他实施方案中，后天缺陷是医疗程序后缺陷。在其他实施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎缩、角化性病变、去核眼睛中眼球内陷、面部痤疮凹坑、线状硬皮病皮下萎缩、鞍鼻畸形、龙贝格病或单侧声带麻痹。
[0025]还提供了包含经代谢的细胞提取物和可接受的载体的组合物，其中经代谢的细胞提取物是由酵母细胞代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，细胞提取物源自动物细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自皮肤细胞。在另一个实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在一些实施方案中，组合物是可注射组合物或局部组合物。在一些实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在其他实施方案中，经代谢的调节生长培养基被封装在密封剂内。在一个实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。在一些实施方案中，组合物用于治疗或防止皮肤病状。在其他实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹 ；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
[0026]在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天缺陷。在一些实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在一些实施方案中，外观缺陷的治疗使晒伤和老化皮肤复原；改善细纹和皱纹的外观；促进细胞更新；减少老年斑和色素沉着异常的出现；改善肤色、纹理和弹性；减少粗糙度和光损伤；预防或减少环境损伤；使皮肤饱满；使皮肤变亮；使皮肤发亮；加强皮肤本身再生的能力；改善老年斑的外观；使老年斑变亮和减淡；改善皮肤紧致度、弹性、回弹性；使皮肤上的细纹光滑、紧致或填充；减淡眼睛下方黑眼圈的外观；改善唇纹理或状态；增强自然唇色；增加唇量；促进手术后皮肤的上皮形成；恢复皮肤的屏障或水分平衡；改善老年斑的外观；改善皮肤色素沉着的外观，或其组合。在一些实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后或感染后发生的医疗病状。在其他实施方案中，后天缺陷是医疗程序后缺陷。在其他实施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎缩、角化性病变、去核眼睛中眼球内陷、面部痤疮凹坑、线状硬皮病皮下萎缩、鞍鼻畸形、龙贝格病或单侧声带麻痹。在其他实施方案中，组合物用于治疗或防止细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。
[0027]本文还提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基:
[0028](a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
[0029](b)培养酵母细胞；
[0030](C)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
[0031](d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
[0032](e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，在以上工艺中使用的酵母是毕赤酵母(Pichia genus)。在其他实施方案中,酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。在其他实施`方案中，步骤(a)中的细胞是皮肤细胞。在其他实施方案中，步骤(a)中的细胞是成纤维细胞。在其他实施方案中，步骤(a)中的细胞是动物细胞。在其他实施方案中，制备经代谢的经调节的生长培养基的工艺还包括(e)处理经代谢的经调节的生长培养基，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基包括(a)或(b)的培养步骤中的连续流系统或生物反应器系统。在其他实施方案中，细胞被悬浮或漂浮在生长培养基中。
[0033]本文提供了用于制备以上经代谢的经调节的生长培养基的工艺，该工艺包括:
[0034](a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
[0035](b)培养酵母细胞；
[0036](C)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
[0037](d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
[0038](e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一个实施方案中，提供了包含经代谢的经调节的生长培养基和可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001%至约95%的量存在。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01%至约50%的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01%至约10%的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10%至约20%的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01%、0.5%、
1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10%、约15%、或约20%的量存在组合物中。在其他实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种:水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、留族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在一些实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基被封装在密封剂内。在一些实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。
[0039]本文还提供了通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物:
[0040](a)提供细胞提取物；
[0041](b)培养酵母细胞；
[0042](c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
[0043](d)培养酵母细 胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
[0044](e)收集经代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在其他实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在其他实施方案中，细胞提取物源自皮肤细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自动物细胞。在其他实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的细胞提取物，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一个实施方案中，培养包括连续流系统或生物反应器系统。
[0045]在其他实施方案中，用于制备以上经代谢的细胞提取物的工艺包括:
[0046](a)提供细胞提取物；
[0047](b)培养酵母细胞；
[0048](C)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
[0049](d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
[0050](e)收集经代谢的细胞提取物。
[0051]本文还提供了包含以下的组合物:可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基:
[0052](a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
[0053](b)培养酵母细胞；
[0054](C)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
[0055](d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
[0056](e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在其他实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在一些实施方案中，步骤(a)中的细胞是皮肤细胞。在其他实施方案中，步骤(a)中的细胞是成纤维细胞。在又一个实施方案中，步骤(a)中的细胞是动物细胞。在一些实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的经调节的生长培养基，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一些实施方案中，步骤(a)或(b)的培养包括连续流系统或生物反应器系统。在其他实施方案中，细胞被悬浮或漂浮在生长培养基中。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001%至约95%的量存在。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01%至约50%的量存在。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01%至约10%的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约 0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10%、约15%、或约20%的量存在组合物中。在其他实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种:水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、留族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在其他实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在其他实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基被封装在密封剂内。在一个实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。
[0057]本文还提供了包含以下的组合物:可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物:
[0058](a)提供细胞提取物；
[0059](b)培养酵母细胞；
[0060](c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
[0061](d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
[0062](e)收集经代谢`的细胞提取物。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在其他实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在其他实施方案中，细胞提取物源自皮肤细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自成纤维细胞。在其他实施方案中，细胞提取物源自动物细胞。在一个实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的细胞提取物，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在另一个实施方案中，培养包括连续流系统或生物反应器系统。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001%至约95%的量存在。在又一个实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01%至约50%的量存在。在其他实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01%至约10%的量存在。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10%至约20%的量存在。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10%、约15%、或约20%的量存在组合物中。在一个实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种:水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、腊、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、留族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在其他实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在又一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基被封装在密封剂内。在另一个实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。
[0063]本文还提供了用于防止或治疗受试者中的皮肤病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含以下的组合物:可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基:
[0064](a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；
[0065](b)培养酵母细胞；
[0066](C)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；
[0067](d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和
[0068](e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一个实施方案中，皮肤病状是外观缺陷。在另一个实施方案中，病状是脱发。在另一个实施方案中，病状是先天性缺陷或后天缺陷。在一个实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后或感染后发生的医疗病状。在另一个实施方案中，后天缺陷是医疗程序后缺陷。在又一个实施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎缩、角化性病变、去核眼睛中眼球内陷、面部痤疮凹坑、线状硬皮病皮下萎缩、鞍鼻畸形、龙贝格病或单侧声带麻痹。在一个实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在某些实施方案中，病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善至少2倍。一种或多种症状或病状的改善倍数包括但不限于3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之间的任何数量。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致改善约1%至约100%、约10%至约90%、约20%至约80%、约30%至约70%、约40%至约60%、或约50%。在其他实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善约5%、约10%、约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约100%、约125%、约150%或一种或多种症状或病状改善更多。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在一些实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在一个实施方案中，步骤(a)中的细胞是皮肤细胞。在另一个实施方案中，步骤(a)中的细胞是成纤维细胞。在一些实施方案中，步骤(a)中的细胞是动物细胞。在其他实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的经调节的生长培养基，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一个实施方案中 ，步骤(a)或(b)的培养包括连续流系统或生物反应器系统。在另一个实施方案中，细胞被悬浮或漂浮在生长培养基中。在其他实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.0001%至约95%的量存在组合物中。在另一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01%至约50%的量存在组合物中。在一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约0.01%至约10%的量存在组合物中。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10%至约20%的量存在。在一些实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约 0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的经调节的生长培养基以组合物的按重量计约10%、约15%、或约20%的量存在组合物中。在一些实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种:水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、甾族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在一个实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在另一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在一个实施方案中，经代谢的经调节的生长培养基被封装在密封剂内。在一些实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。在一些实施方案中，至少一种胞外基质蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5%至约100%。在一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约10%至约50%。在另一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约60%至约100%。在又一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 95% 或约 100%。在一个实施方案中，胞外基质蛋白是胶原蛋白或赖氨酰基羟化酶蛋白。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被C0L4A1基因或PLODl基因编码。在其他实施方案中，至少一种修复蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，修复蛋白被上调约10%至约70%。在另一个实施方案中，修复蛋白被上调约25%至约50%。在一些实施方案中，修复蛋白被上调约 5%、约 10%、约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%。在一个实施方案中，修复蛋白是纤连蛋白。在又一个实施方案中，修复蛋白被FNl基因编码。在一些实施方案中，至少一种细胞连接蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5%至约200%。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约10%至约80%。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被上调约30%至约50%。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约 5%、约 10%、约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 95%、约 100%、约 110%、约 120%、约 130%、约140%、约150%、约160%、约170%、约180%、约190%或约200%。在其他实施方案中，细胞连接蛋白是内披蛋白。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被IVL基因编码。在一个实施方案中，至少一种抗氧化蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在又一个实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5%至约300%。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约10%至约50%。在其他实施方案中，抗氧化蛋白被上调约200%至约250%。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约 5%、约 10%、约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 95%、约 100%、约 125%、约 150%、约 175%、约200%、约250%或约300%。在一个实施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在另一个实施方案中，抗氧化蛋白被S0D2基因编码。
[0069]本文还提供了用于防止或治疗受试者中的皮肤病状的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含以下的组合物:可接受的载体和通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物:[0070](a)提供细胞提取物；
[0071](b)培养酵母细胞；
[0072](c)将酵母细胞暴露于细胞提取物；
[0073](d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和
[0074](e)收集经代谢的细胞提取物。
[0075]在一个实施方案中，病状是外观缺陷。在另一个实施方案中，病状是脱发。在另一个实施方案中，病状是先天性缺陷或后天缺陷。在一个实施方案中，后天缺陷是创伤后、手术后或感染后发生的医疗病状。在另一个实施方案中，后天缺陷是医疗程序后缺陷。在又一个实施方案中，后天缺陷是凹陷性瘢痕、皮下萎缩、角化性病变、去核眼睛中眼球内陷、面部痤疮凹坑、线状硬皮病皮下萎缩、鞍鼻畸形、龙贝格病或单侧声带麻痹。在一个实施方案中，外观缺陷是眉间皱眉线、深鼻唇沟折痕、嘴边地理皱纹、双颊凹陷或乳房发育不全。在某些实施方案中，皮肤病状是外观缺陷、先天性缺陷、脱发或后天医疗缺陷。在另外的实施方案中，皮肤病状是细纹和皱纹；老年斑和色素沉着异常；皮肤纹理、肤色和弹性下降；粗糙度和光损伤；皮肤本身再生的能力下降；环境损伤；皮肤光滑度和紧缩感下降；老年斑；细纹和粗纹以及皱纹；细的和粗的眼周皱纹；鼻唇沟；面部细纹和粗纹；皮肤发光度和均匀度下降；皮肤紧致度下降；色素沉着过多；黑斑和/或斑纹；皮肤亮度和年轻外观下降；光老化皮肤；内在和外在老化的皮肤；异常的皮肤细胞更新；皮肤屏障下降；皮肤保持水分的能力下降；褐色和红色斑点；发红；皮肤表皮厚度异常；真皮表皮连接减少；孔尺寸和孔数量增加；或其组合。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善至少2倍。一种或多种症状或病状的改善倍数包括但不限于，3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、75倍、100倍或更多倍，或在其之间的任何数量。在某些实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致改善约1%至约100%、约10%至约90%、约20%至约80%、约30%至约70%、约40%至约60%、或约50%。在其他实施方案中，施用本文描述的组合物可以导致一种或多种症状或病状改善 约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 100%、约 125%、约150%或一种或多种症状或病状改善更多。在一些实施方案中，酵母是毕赤酵母属。在一些实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在一个实施方案中，步骤(a)中的细胞源自皮肤细胞。在另一个实施方案中，步骤(a)中的细胞源自成纤维细胞。在一些实施方案中，步骤(a)中的细胞源自动物细胞。在其他实施方案中，工艺还包括(e)处理经代谢的细胞提取物，其中处理是浓缩、过滤、纯化或其组合。在一个实施方案中，步骤(a)或(b)的培养包括连续流系统或生物反应器系统。在另一个实施方案中，细胞被悬浮或漂浮在生长培养基中。在其他实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.0001%至约95%的量存在组合物中。在另一个实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01%至约50%的量存在组合物中。在一个实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约0.01%至约10%的量存在组合物中。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10%至约20%的量存在。在一些实施方案中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约 0.01%,0.5%、1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的量存在。在一个非限制性实例中，经代谢的细胞提取物以组合物的按重量计约10%、约15%、或约20%的量存在组合物中。在一些实施方案中，组合物还包括以下中的至少一种:水、表面活性剂、乳化剂、调节剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增稠剂、固定剂、着色剂、营养制品、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗菌剂、留族激素、去屑剂、抗痤疮组分、防晒剂和防腐剂。在一个实施方案中，组合物是可注射的组合物或局部组合物。在另一个实施方案中，局部组合物是软膏剂、霜剂、水凝胶或洗剂。在一个实施方案中，经代谢的细胞提取物被封装在密封剂内。在一些实施方案中，密封剂是脂质体、泡囊、亚微米乳液、聚合物胶囊密封材料、凝胶、霜剂和洗剂中的至少一种。在一些实施方案中，至少一种胞外基质蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被上调约5%至约100%。在一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约10%至约50%。在另一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约60%至约100%。在又一个实施方案中，胞外基质蛋白被上调约 5%、约 10%、约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%。在一个实施方案中，胞外基质蛋白是胶原蛋白或赖氨酰基羟化酶蛋白。在一些实施方案中，胞外基质蛋白被C0L4A1基因或PLODl基因编码。在其他实施方案中，至少一种修复蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，修复蛋白被上调约10%至约70%。在另一个实施方案中，修复蛋白被上调约25%至约50%。在一些实施方案中，修复蛋白被上调约5%、约10%、约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%。在一个实施方案中，修复蛋白是纤连蛋白。在又一个实施方案中，修复蛋白被FNl基因编码。在一些实施方案中，至少一种细胞连接蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5%至约200%。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约10%至约80%。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被上调约30%至约50%。在一个实施方案中，细胞连接蛋白被上调约5%、约10%、约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 95%、约 100%、约 110%、约 120%、约 130%、约 140%、约 150%、约160%、约170%、约180%、约190%或约200%。在其他实施方案中，细胞连接蛋白是内披蛋白。在一些实施方案中，细胞连接蛋白被IVL基因编码。在一个实施方案中，至少一种抗氧化蛋白通过将组合物施用至受试者而上调。在又一个实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5%至约300%。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约10%至约50%。在其他实施方案中，抗氧化蛋白被上调约200%至约250%。在一些实施方案中，抗氧化蛋白被上调约5%、约10%、约15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约75%、约 80%、约 85%、约 90%、`约 95%、约 100%、约 125%、约 150%、约 175%、约 200%、约 250% 或约300%ο在一个实施方案中，抗氧化蛋白是超氧化物歧化酶蛋白。在另一个实施方案中，抗氧化蛋白被S0D2基因编码。
[0076]附图简述
[0077]图1是表示由三维组织产品Transcyte?和Dermagraft?随时间沉积的氨基葡聚
糖和胶原的沉积的动力学的图表。氨基葡聚糖的沉积体积取决于生长时间，而胶原的沉积不取决于生长时间。
[0078]图2是表示胞外基质(从Transcyte?除去)和以1:2、1:5、1:10和1:100的稀释度加入到人成纤维细胞和角质形成细胞的单层培养物的效果的图表。所阐明的最显著的效果是以基质的1:10稀释度。[0079]图3是表示暴露于经调节的培养基(先前已经支持细胞在Transcyte?中生长的细胞培养基)的人成纤维细胞和角质形成细胞的相对增殖的图表。在少至三天显示细胞响应的增加。
[0080]图4是表明细皱纹和粗皱纹的研究员评估的图表。在所有访问中观察到细皱纹和粗皱纹的平均分数的显著下降(全部P〈0.0001)。在每一个数据组，在左边示出细皱纹评估，且在右边示出粗皱纹评估。
[0081]图5是表明肤色、紧致度和发光度的研究员评估的图表。在所有访问中皮肤紧致度、肤色和发光度的平均分数显著改善(全部P <0.02)。在每一个数据组，在左边示出第4星期结果，在中间示出第8星期结果，且在右边示出第12星期结果。
[0082]图6是表明触觉粗糙度的研究员评估的图表。在所有访问中皮肤紧致度、肤色和发光度的平均分数显著改善(全部P〈0.0001)。分别在左手列示出第4星期的从基线的百分数变化，在中间列示出第8星期的从基线的百分数变化和在右手列示出第12星期的从基线的百分数变化。
[0083]图7是提供来自实施例18中所描述的12星期临床使用(组合的/组合产品)研究的受试者自我评估问卷的第12星期的结果的图表。
[0084]发明详述
[0085]本公开内容涉及包含使用任何真核细胞类型或三维组织构建体培养的经代谢的经调节的生长培养基和/或经代谢的细胞提取物的新的组合物、以及使用组合物的方法。以单层或以三维培养细胞。细胞优选地是人且包括基质细胞、实质细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞。由细胞和组织培养物调节的培养基将包含各种天然分泌的蛋白，例如生物学活性生长因子。还公开了包含源自经调节的细胞培养基的产品的新的组合物和这些组合物的用途。
[0086]“预调节的”细胞培养基可以是充分地解决正被培养的细胞的营养需求的任何细胞培养基。细胞培养基的实例包括(但不限于)达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、Ham’ sF12、RPMI1640、Iscove’ S、McCoy’s和本领域技术人员容易明白的其他培养基制剂，包括见于以下中的那些:Methods For Preparation of Media, Supplements and SubstrateFor Serum-Free Animal Cell Culture Alan R.Liss, New York(1984)和 Cell&TissueCulture: Laboratory Procedures, John ffiley&Sons Ltd., Chichester, Englandl996,两者通过引用以其整体并入本文。培养基可以被补充有支持所需的细胞或组织培养物所需的任何组分。另外，如果需要的话，可以加入血清例如牛血清，其是白蛋白、球蛋白、生长促进剂和生长抑制剂的复合溶液。血清应是不含病原体的且针对支原体细菌、真菌和病毒污染而被仔细地筛过。此外，血清应通常从美国获得而不是从本地牲畜携带可递送的剂的国家获得。激素加入到培养基中可能是期望的或可能不是期望的。培养基还可以是不含血清的，即，细胞在没有血清补充物的情况下生长。
[0087]“经调节的生长培养基”可以是如本文所公开调节的任何生长培养基，且可以被制备，例如如在美国专利第6，372，494号；第7，118，746号；第7，160，726号中所公开的，它们全部通过引用以其整体并入本文。
[0088]其他成分例如维生素、生长和附着因子、蛋白等，可以由本领域技术人员根据他的或她的特定需要来选择。在一些实施 方案中，可以使用适合于实现所需的经调节的培养基的任何细胞类型。基因工程细胞可以用于培养培养基。这样的细胞可以被修饰，例如，以表达一种或多种所需的蛋白，使得一种或多种被表达的蛋白在培养基中的浓度被优化用于特定的所需应用。根据本公开内容，用于调节培养基的细胞和组织培养物可以被设计为表达目标基因产物，该目标基因产物可以给予各种各样的功能，包括(但不限于)类似于生理反应的表达蛋白的改善的性质、可用于具体应用的特定蛋白的增加的表达，例如创伤愈合或抑制某些蛋白例如蛋白酶、乳酸等。
[0089]细胞可以被设计成表达目标基因产物，目标基因产物是生物学活性的，提供所选择的生物学功能，作为选择的生理情况的报告基因，增加基因产物的缺乏的或有缺陷的表达，或提供抗病毒、抗菌、抗微生物或抗癌活性。根据本公开内容，目标基因产物可以是肽或蛋白，例如酶、激素、细胞因子、抗原、或抗体、调节蛋白例如转录因子或DNA结合蛋白、结构蛋白例如细胞表面蛋白，或目标基因产物可以是核酸例如核糖体或反义分子。目标基因产物包括(但不限于)增强细胞生长的基因产物。例如，遗传修饰可以上调内源性蛋白，通过表达异种离子通道或改变内源性离子通道功能而引入新的蛋白或调节离子浓度。实例包括(但不限于)基因组织，其表达被全身递送的基因产物(例如，分泌的基因产物例如蛋白，包括生长因子、激素类、因子VII1、因子IX、神经递质和脑啡肽)。
[0090]在一些实施方案中，使细胞根据技术人员已知的任何方法以二维单层生长。参见，例如，细胞培养技术，诸如在以下中描述的那些=Sambrook J等人(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第三版)；Goeddel 编辑(1990)Methods inEnzymologyl85, Current Protocols In Molecular Biology ;F.M.Ausubel 等人编辑，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons, Inc.(1994，增订直到 1999) ；Animal Cell Culture:A PracticalApproach (Freshney 编辑 1986)。
[0091]在一些实施方案 中，细胞在三维基质支撑物上生长并以多层生长，形成细胞基质。该基质系统比先前所描述的单层组织培养系统在更大的程度上接近体内存在的生理状态。三维培养物例如 Dermagraft.(Advanced Tissue Sciences, Inc.，La
Jolla, CA) “Dermagraft?，，和 TransCyte?(Smith&Nephew, PLC，UnitedKingdom) “Transcyte?”，产生许多生长因子和以生理比率和浓度分泌到培养基中的其他蛋白。Dermagraft?主要由在可生物降解的羟乙酸乳酸聚酯(polyglactin)上培养的异源新生成纤维细胞组成。TransCyte?是包括结合至过渡覆盖物的三维基质组织的临时活的皮肤替换物，如美国专利5，460，939中所描述的。另外，调节细胞培养基的三维组织培养物可以包含许多组织类型中见到的间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、和/或胚胎干细胞和/或实质细胞和/或实质干细胞，组织类型包括(但不限于)骨髓、皮肤、肝、胰腺、肾、肾上腺和神经组织，以及胃肠道和泌尿生殖道组织、和循环系统。参见美国专利第 4，721，096 号；第 4，963，489 号；第 5，032，508 号；第 5，266，480 号；第 5，160，490 号；和第5，559，022号，它们中的每一个通过引用以其整体并入本文。
[0092]1.定义
[0093]本文使用的以下术语将具有所指示的意思:
[0094]细胞:包括来自任何有机体的细胞,有机体包括动物、植物、真菌、原生生物或无核原虫类。在一个实施方案中，细胞源是动物或植物。在另一个实施方案中，动物是哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物是人。
[0095]细胞提取物:包括可以或不可以包括细胞微粒物质的溶解的或碎裂的细胞内容物。
[0096]粘附层:直接附接至三维支撑物或通过附着于本身直接附接至支撑物的细胞而间接连接的细胞。
[0097]经调节的培养基:包含胞外蛋白和细胞代谢物的制剂，其先前已经支持任何所需的真核细胞类型的生长，所述细胞已经以二维或三维被培养。还称为“经调节的细胞培养基”或“经调节的细胞和组织培养基”。
[0098]基质细胞:具有或不具有疏松结缔组织中存在的其他细胞和/或成分的成纤维细胞，包括(但不限于)内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞、脂肪细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、软骨细胞、前软骨细胞(prechondrocyte)等。
[0099]组织特有的或实质细胞:形成器官的不同于其支持骨架的必需和区别的组织的细胞。
[0100]二维细胞培养物:以单层(例如)在平旦表面等上培养的细胞。
[0101]三维骨架:三维支架主要由任何材料和/或形状组成，所述材料和/或形状(a)允许细胞附接至其(或可以被修饰为允许细胞附接至其)；和(b)允许细胞以多于一层生长。该支撑物接种有基质细胞以形成活的三维基质组织。骨架的结构可以包括网、海绵或可以由水凝胶形成。
[0102]三维基质组织或活的基质基质:已经接种有在支撑物上生长的基质细胞的三维骨架。由基质细胞加工的胞外基质蛋白沉积到骨架上，因此形成活的基质组织。活的基质组织可以支持稍后接种的组织特有的细胞的生长，以形成三维细胞培养物。
[0103]组织特有的三维细胞培养物或组织特有的三维构建体:已经接种有组织特有的细胞并被培养的三维活的基质组织。一般而言，用于接种三维基质的组织特有的细胞应包括该组织的“干”细胞(或“储备”细胞)；即，产生将成熟为形成组织实质的特有细胞的新细胞的那些细胞。
[0104]以下缩写将具有所指示的意思:
[0105]BCS=小牛血清
[0106]BFU-E=红系爆式形成单位
[0107]TGF-β =转化生长因子-β
[0108]CFU-C=培养集落形成单位
[0109]CFU-GEMM=粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞集落形成单位
[0110]CSF=集落刺激因子
[0111]DMEM=达尔伯克改良伊格尔培养基
[0112]EDTA=乙二胺四乙酸
[0113]FBS=胎牛血清
[0114]FGF=成纤维细 胞生长因子
[0115]GAG=葡胺聚糖[0116]GM-CSF=粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子
[0117]HBSS=汉克平衡盐溶液
[0118]HS=马血清
[0119]IGF=胰岛素样生长因子
[0120]LTBMC=长期骨髓培养
[0121]MEM=最低必需培养基
[0122]PBL=外周血白细胞
[0123]PBS=磷酸盐缓冲盐水
[0124]F1DGF=血小板衍生生长因子
[0125]RPMI1640=洛斯维帕克纪念研究所培养基编号1640 (GIBCO, Inc.，GrandIsland, N.Y.)
[0126]SEM=扫描电子显微术
[0127]VEGF=血管内皮生长因子
[0128]11.经代谢 的经调节的生长培养基和经代谢的细胞提取物
[0129]在一个实施方案中，本公开内容提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的经调节的生长培养基:(a)在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞以形成经调节的生长培养基和从经培养的细胞除去经调节的生长培养基；(b)培养酵母细胞；(C)将酵母细胞暴露于经调节的生长培养基；(d)培养酵母细胞以使经调节的生长培养基的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的经调节的生长培养基。在一些实施方案中，细胞可以源自植物和/或动物源，包括人。
[0130]在另一个实施方案中，本公开内容提供通过包括以下的工艺制备的经代谢的细胞提取物:(a)提供细胞提取物；(b)培养酵母细胞；(C)将酵母细胞暴露于细胞提取物；(d)培养酵母细胞以使细胞提取物的至少一部分代谢；和(e)收集经代谢的细胞提取物。在一些实施方案中，细胞提取物通过以下来获得:在足以满足使细胞在体外生长所需要的营养需求的生长培养基中培养细胞和从生长培养基除去所得到的细胞提取物。在一些实施方案中，细胞可以源自植物和/或动物源，包括人。
[0131]使胞外蛋白在经调节的生长培养基或细胞提取物例如生长因子、细胞因子和应激蛋白中代谢，在以下中打开了新的可能性:制备用于包括组织修复的各种各样领域的产品，例如，治疗创伤和其他组织缺陷例如外观缺陷以及人和动物供给补充物。例如，已知生长因子在创伤愈合过程中起到重要的作用。通过本公开内容的代谢工艺将这些生长因子的至少一种活性给予经调节的细胞培养基或细胞提取物。
[0132]细胞的细胞因子和生长因子涉及到许多关键的细胞过程，包括细胞增殖、粘附、形态学外观、分化、迁移、炎症反应、血管生成、和细胞死亡。研究已经证明，缺氧应激和对细胞的损伤诱导包括mRNA和蛋白的水平增加的响应，蛋白相应于生长因子例如I3DGF (血小板衍生生长因子)、VEGF (血管内皮生长因子)、FGF (成纤维细胞生长因子)和IGF (胰岛素样生长因子)(Gonzalez-Rubio, M.等人，1996，Kidney Int.50 (I):164-73 ；Abramovitch, R.等人，1997，Int J Exp.Pathol.78(2):57-70 ；Stein, 1.等人，1995，Mol Cell Biol.15(10):5363-8 ；Yang, ff.等人，1997，FEBS Lett.403 (2):139-42 ；ffest, N.R.等人，1995，J.Neurosc1.Res.40(5):647-59)。[0133]生长因子，例如转化生长因子_β，还称为TGF-β，由某些应激蛋白在创伤愈合期间诱导。两种已知的应激蛋白是GRP78和HSP90。这些蛋白稳定细胞结构且使细胞对不利状态有抵抗力。二聚蛋白的TGF-β家族包括TGF-01、TGF-02和TGF-03且调节许多细胞类型的生长和分化。此外，该蛋白家族展示各种生物效应，刺激一些细胞类型的生长(Noda等人，1989，EndocrinologylM =2991-2995)和抑制其他细胞类型的生长(Goey 等人，1989, J.1mmunol.143:877-880 ；Pietenpol 等人，1990, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87 =3758-3762) 0还示出TGF-β增加包括胶原和纤连蛋白的胞外基质蛋白的表达(Ignotz 等人，1986, J.Biol.Chem.261:4337-4345)和加速创伤的愈合(Mustoe 等人，1987，Science237:1333-1335)。
[0134]另一种这样的生长因子是H)GF。I3DGF最初被发现是间叶细胞衍生的细胞的有效促细胞分裂剂(Ross R.等人，1974，Proc.Natl.Acad.Sc1.USAU(4):1207-1210 ；KohlerN.等人，1974，Exp.Cell Res.87 =297-301) 0另外的研究已经表明，PDGF增加组织形成中的细胞构成和肉芽形成的速率。用I3DGF治疗的创伤具有早期炎症反应的出现，包括中性白细胞和巨噬细胞类型在创伤部位处的增加。这些创伤还示出增强的成纤维细胞功能(Pierce, G.F.等人，1988.J.Exp.Med.167:974-987)。 PDGF 和 TGF-β 两者均已经在动物研究中被示出增加胶原形成、DNA含量和蛋白水平(Grotendorst, G.R.等人，1985，J.Clin.1nvest.76:2323-2329 ；Sporn, Μ.B.等人，1983，Science (Wash DC)U豆:1329)。已经表明TOGF在治疗人创伤中是有效的。在人创伤中，TOGF-AA表达在经历愈合的压力溃疡内增加。I3DGF-AA的增加相应于创伤的活化成纤维细胞、胞外基质沉积和有效血管形成的增加。此外，在慢性非愈合创伤中没有看到F1DGF-AA的这样的增加(Principles of TissueEngineering, R.Lanza 等人(编辑)，第 133-141 页(R.G.Landes C0.TX1997)。具有诱导血管生成和创伤愈合的能力的许多其他生长因子包括VEGF、KGF和碱性FGF。
[0135]A.牛.长培养基
`[0136]用于细胞培养的生长培养基制剂在文献中是熟知的，且许多是商购的。
[0137]预调节的培养基成分包括(但不限于)下面所描述的那些。另外，成分的浓度是本领域普通技术人员熟知的。参见，例如上文的Methods For Preparation OfMedia, Supplements and Substrate for Serum-free Animal Cell Cultures, supra。成分包括氨基酸(D-氨基酸和/或L-氨基酸两者)，例如谷氨酸盐、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸以及它们的衍生物；酸溶性亚组例如硫胺、抗坏血酸、正铁化合物、亚铁化合物、嘌呤、谷胱甘肽和磷酸二氢钠。
[0138]另外的成分包括糖、脱氧核糖、核糖、核苷、水溶性维生素、核黄素、盐、微量金属、脂质、乙酸盐、磷酸盐、HEPES、酚红、丙酮酸盐和缓冲剂。
[0139]常常使用在培养基制剂中的其他成分包括脂溶性维生素(包括A、D、E和K)类固醇和它们的衍生物、胆固醇、脂肪酸和脂质、吐温80、2_巯基乙醇嘧啶以及各种补充物，包括血清(胎儿的，马、小牛等)、蛋白(胰岛素、转铁蛋白、生长因子、激素类等)、抗生素(庆大霉素、青霉素、链霉素、两性霉素B等)、全蛋超滤液和附着因子(纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、昆布氨酸、肌腱蛋白(tenascin)等)。
[0140]培养基可以需要或可以不需要补充有生长因子和其他蛋白例如附着因子，因为许多细胞构建体尤其是本申请中描述的三维细胞和组织培养物构建体本身将这样的生长因子和附着因子以及其他产物加工到培养基中。
[0141]B.细朐培养物
[0142]1.细朐
[0143]任何细胞可以使用在细胞培养物中。例如，细胞可以是基质细胞、实质细胞、间充质干细胞(血统定向或非定向的祖细胞)、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞。仅举几个例子，细胞可以包括(但不限于)骨髓、皮肤、肝、胰腺、肾、神经组织、肾上腺、粘膜上皮和平滑肌。包括基质的成纤维细胞和成纤维细胞样细胞以及其他细胞和/或成分在来源上可以是胎儿的或成人的，且可以源自适宜的源例如皮肤、肝、胰腺、粘膜、动脉、静脉、脐带和胎盘组织等。这样的组织和/或器官可以通过适当的活组织切片或在尸体解剖之后获得。实际上，尸体器官可以用于提供基质细胞和成分的丰富供应。
[0144]包括基质的胚胎干细胞和/或其他成分可以使用本领域已知的方法来分离。例如，最近，人胚胎干细胞种群以及分离和使用这些细胞的方法已经被报告在Keller等人，Nature Med.，5:151-152 (1999)，Smith Curr.Biol.8:R802-804 (1998)中；已经从原生殖细胞被分离，Shamblatt等人，PNAS95:13726-1373 (1998)；已经从胚细胞被分离，Thomason等人，Science282:1145-1147(1988)。间充质干细胞的分离和培养是本领域已知的。参见Mackay 等人，Tissue Eng.4:415-428 (1988) ;William 等人,Am Surg.65:22-26 (1999)。这些细胞的接种在下文描述在部分5.3中。同样地，神经干细胞可以在以下中描述的方式被分离:Flax 等人，Nature Biotechnol., 16:1033-1039 (1998);和 Frisen 等人，Cell.Mol.Life Sc1.，54:935-945(1998)。
[0145]细胞可以本领域已知的任何方式来培养，包括以单层、珠或以三维和通过任何方式(即，培养容器、滚瓶、连续流系统等)。细胞和组织培养的方法是本领域熟知的，且被描述在例如上文的 Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures, supra,下文的Freshney(1987), Culture of Ani`mal Cells:A Manual of Basic Techniques, infra。
[0146]一般而言，利用的细胞系被仔细地筛选人和动物病原体。取决于应用，当仅不含病原体的细胞是可接受的时(例如，对于创伤愈合、食物添加剂等)，这样的筛选可以具有关键的重要性。筛选病原体的方法是本领域熟知的。细胞类型，无论是以二维还是三维被培养，将影响经调节的培养基的性质。在一些实施方案中，细胞以二维被培养。在其他实施方案中，细胞以三维被培养。
[0147]a.某因工稈细朐
[0148]在一些实施方案中，细胞可以作为用于将基因产物引入到促进例如组织缺陷的修复和/或再生的培养基或提取物中的媒介物。细胞可以被基因工程为表达(例如)炎性媒介物例如IL-6、IL-8和G-CSF。细胞还可以或可选择地被基因工程为表达抗炎因子，例如，抗 GM-CSF、抗 TNF、抗 IL-1、抗 IL-2 等。
[0149]在另一个实施方案中，细胞可以被基因工程为将基因表达到将发挥治疗作用的培养基或提取物中，例如，在TGF-β的生产中以刺激软骨生产，或其他因子例如BMP-13以促进软骨形成、或促进基质细胞的迁移和/或基质沉积的刺激因子。因为构建体包括真核细胞，所以基因产物将被适当地表达和加工以形成活性产物。优选地，使用的表达控制成分应允许基因的调节表达，使得产物可以在培养物中被过度合成。通常，所选择的翻译启动子和具体地启动子成分，部分地取决于培养的组织和细胞的类型。能够分泌蛋白的细胞和组织是优选的(例如，具有大量糙面内质网和高尔基体细胞器的那些)。过渡生产的基因产物然后将由工程细胞分泌到经调节的培养基中。
[0150]细胞可以被基因工程为调节一个或多个基因；或基因表达的调节可以是短暂的或长期的；或基因活性可以是不可诱导的或可诱导的。
[0151]细胞还可以被基因工程为“破坏(knock out) ”促进炎症的因子的表达。在下面讨论用于降低目标基因表达水平或目标基因产物活性水平的负调节技术。如本文使用的“负调节”是指相对于在没有调节处理的情况下的目标基因产物的水平和/或活性，目标基因产物的水平和/或活性下降。原产于该细胞的基因的表达可以使用许多技术来降低或破坏，例如，表达可以通过使用标准同源重组技术使完全基因失活(通常称为“击昏”)来抑制。通常，编码蛋白的重要的区的外显子(或该区的外显子5’)由阳性可选择的标记物(例如neo)间隔，阻止从目标基因生产正常mRNA且导致基因的失活。基因还可以通过在基因的一部分中产生缺失或失活插入，或通过删除整个基因而失活。通过将具有两个同源性的区域的构建体用于在基因组中远离的目标基因，插入两个区域的序列可以被删除。Mombaerts等人，1991，Proc.Nat.Acad.Sc1.U.S.A.88:3084-3087?可选择地，基因还可以通过删除上游或下游表达成分而失活。
[0152]抑制目标基因的表达的反义分子和核酶分子还可以用于降低目标基因活性的水平。例如，抑制主要组织适合性基因群(HLA)的表达的反义RNA分子已经被表明关于免疫响应是最通用的。此外，适当的核酶分子可以被设计，如由例如Haseloff等人，1988，Nature—:585-591 ;Zaug 等人，1984，SciencegM:574-578 ;和 Zaug 和Cech, 1986，Science益1:470-475所描述的。更进一步地，三链螺旋分子可以用于降低目标基因活性的水平。这些技术由L.G.Davis等人编辑，Basic Methods in MolecularBiology,第 2 版，Appleton&Lange, Norwalk, Conn.1994 详细地描述。
[0153]可用于对细胞进行基因工程的方法是本领域熟知的且在共同在审的美国专利4，963，489和5，785，964 中进一步详述，两个专利的公开内容通过引用并入本文。例如，包含外源核酸例如编码所关心的基因产物的重组体DNA构建体或支撑物，可以被构建和用于转变或转染基质细胞。携带外源核酸且能够表达所述核酸的这样的转变的或转染的细胞，被选择且以本公开内容的三维构建体克隆扩展。
[0154]用于制备包含所关心的基因的DNA构建体的方法、用于转化或转染细胞的方法，和用于选择携带并表达所关心的基因的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，在以下中描述的技术:Maniatis 等人，1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Ausubel 等人，1989, Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates&ffileyInterscience, N.Y.;和 Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.。
[0155]细胞可以使用任何各种载体中的任何来设计，载体包括但不限于，整合病毒载体，例如，还原病毒载体或腺相关病毒载体；或非整合复制载体，例如，乳头状瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体；或复制缺陷型病毒载体。当需要短暂表达时，非整合载体和复制缺陷型载体可能是优选的，因为可诱导的或构成的启动子可以在这些系统中用于控制所关心的基因的表达。可选择地，整合载体可以用于获得短暂表达，只要所关心的基因受可诱导的启动子控制。将DNA引入细胞中的其他方法包括使用脂质体、脂转染、电穿孔、基因枪、或通过直接的DNA注射。
[0156]细胞优选地用核酸例如DNA来转变或转染，通过一种或多种适当的表达控制成分例如启动子或增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸部位以及其他、和可选择的标记物来控制，即，与它们处于操作结合。在引入外来DNA之后，工程细胞可以允许在富集培养基中生长且然后转到选择的培养基。外来DNA中的可选择的标记物给予针对选择的抗性且允许细胞稳定地将外来DNA整合在诸如例如质粒上，进入它们的染色体并生长以形成灶，该灶又可以被克隆和扩展到细胞系。该方法可以有利地用于对将基因产物表达到培养基中的细胞系工程化。
[0157]任何启动子可以用于驱动插入的基因的表达。例如，病毒启动子包括(但不限于)CMV启动子/增强子、SV40、乳头状瘤病毒、埃-巴二氏病毒、弹性蛋白基因启动子和β-球蛋白。优选地，用于控制所关心的基因的表达的控制成分应允许基因的调节表达，使得产物仅当在体内需要时被合成。如果需要短暂表达，则构成的启动子优选地用于非整合和/或复制缺陷型载体中。可选择地，当需要时，可诱导的启动子可以用于驱动插入的基因的表达。可诱导的启动子可以建到整合和/或复制载体中。例如，可诱导的启动子包括但不限于，金属硫蛋白和热休克蛋白。
[0158]根据一个实施方案，用于表达所关心的的外源基因的可诱导的启动子是为如本文所公开的由于低温保存和随后的解冻而诱发的那些调节蛋白的天然启动子的那些。例如，TGF-13、VEGF、或各种已知的热休克蛋白的启动子可以用作表达控制成分，即，可以可操作地结合至所关心的外源基因以在调节细胞培养基的组织构建体中表达所需的基因产物。
[0159]各种方法可以用于获得被工程化到细胞中的基因产物的构成的或短暂的表达。例如，可以使用由Seldon等人，1987，Science236:714-718描述的转核移植技术。如本文使用的“转核”表明移植的细胞的核已经通过加入DNA序列通过稳定的或短暂的转染而被改变。优选地，细胞被工程化为短暂地和/或在可诱导的控制下在手术后恢复时间期间表达这样的基因产物，或被工程化为锚至基质细胞的嵌合融合蛋白，例如，被工程化为主要由受体或受体样分子的细胞内和/或横跨膜域组成的嵌合分子，作为胞外的域融合至基因产物。
[0160]此外，可能期望制备具有包含外来基因产物、生长因子、调节因子等的胞外基质的构建体，其然后在经调节的培养基中被发现。该实施方案是基于以下发现:在人基质细胞在三维支撑物骨架上生长期间，细胞在骨架上合成和沉积，原样产生的人胞外基质在正常人组织中。胞外基质局部地由细胞分泌且不仅将细胞和组织结合在一起，而且影响其接触的细胞的发育和行为。胞外基质包含各种结缔组织蛋白，例如，在主要由氨基葡聚糖链的网络组成的水合凝胶中交织的纤维形成蛋白。氨基葡聚糖是长的带负电荷的多糖链的多相群，其(除了透明质酸)共价地键合至蛋白以形成蛋白聚糖分子。根据该实施方案，基质细胞可以被基因工程为表达所需的基因产物，或改变的基因产物形式，其将存在胞外基质中和最终存在细胞培养基中。
[0161]2.培养细朐
[0162]在一些实施方案中，细胞在二维细胞培养物中生长。在其他实施方案中，细胞在三维细胞培养物中生长。参见，例如，通过引用以其整体并入本文的美国专利第6，372，494号。用于细胞培养物中的基质细胞优选地包括成纤维细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞、和/或胚胎干细胞，具有或不具有本文更充分地描述的另外的细胞和/或成分。
[0163]细胞可以通过本领域已知的任何方式来培养。优选地，在能够实现无菌加工和处理的环境中培养细胞。细胞和组织培养的常规方式已经由于需要人监督和控制培养基而受限制。这限制了可以在单一时间培养的细胞和组织的量和从而限制了可以在单一时间获得的经调节的细胞培养基的体积。由于该原因，优选的是，培养基以允许大规模生长(产生大规模经调节的培养基)的方式使用(例如)用于无菌大规模培养的设备，比如共同所有的美国专利5，763，267( ‘267专利)中描述的设备来调节，为了所有的目的，通过引用以其整体并入本文。使用‘267专利中描述的无菌封闭系统，将预调节的培养基从流体储器运输至入口歧管且均匀地分配至连续流系统中的培养物且可用于培养三维细胞和组织培养物，
例如诸如Dermagraft?。特定地，‘267专利中描述的设备包括多个柔性的或半柔性的处理
室，该处理室包括一个或多个个体培养袋、多个硬的隔离物、入口流体歧管、出口流体歧管、流体储器，和用于在系统内运输流体的装置。
[0164]在处理期间，将液体培养基从流体储器运输至入口歧管，入口歧管又将培养基均匀地分配至连接的处理室和内部培养袋中的每一个。还提供出口流体歧管以确保每一个处理室被均匀地填充和确保在处理期间形成的任何气泡被从处理室除去。处理室是柔性的或半柔性的，以便在冲洗和应用培养的移植物期间提供便于最终用户的处理。由于处理室的柔性，还提供硬的隔离物，硬的隔离物确保在处理期间在室内均匀的流体分布。
[0165]在另一个实施方案中，在用于组织培养物的无菌生长的设备中培养组织，如为了所有目的以其整体并入 本文的美国专利第5，843，766 (‘766专利)号中所描述的。‘766专利公开了组织培养室，其中室是提供用于组织的生长的套管，组织可以在相同的无菌容器中生长，以冷冻形式被保存，和运往最终用户。组织培养室包括套管，套管包括在套管内的基材，基材被设计为促进在基材的表面上的三维组织生长。套管包括帮助培养基的流入和流出的入口和出口。套管还包括至少一个流量分配器。在一个实施方案中，流量分配器是挡板，其用于分配在室内的培养基流以产生组织的连续的、均一的块。在第二实施方案中，流量分配器是偏转板、分配通道和流动通道的组合。在每一个实施方案中，套管还包括密封件以便确保在组织生长和储存期间在室内部的无菌环境。
[0166]成纤维细胞将支持许多不同的细胞和组织在三维培养系统中生长，且因此，可以被接种到基质上以形成“一般的”基质支持基体，用于培养各种细胞和组织中的任一种。然而，在某些情况下，使用“特殊的”而不是“一般的”基质支持基体可能是优选的，在该情况下，基质细胞和成分可以从特定的组织、器官或个体获得。此外，成纤维细胞和其他基质细胞和/或成分可以源自将在三维系统中培养的相同类型的组织。当培养组织时这可能是有利的，其中特殊的基质细胞可以起到特定的结构/功能作用，例如，动脉的平滑肌细胞、神经组织的神经胶质细胞、肝的库柏法细胞等。
[0167]一旦接种到三维支撑物上，基质细胞将在骨架上增殖并沉积由基质细胞天然分泌的结缔组织蛋白例如生长因子、调节因子和胞外基质蛋白。基质细胞和它们的天然分泌的结缔组织蛋白基本上包围骨架，因此形成活的基质组织，该活的基质组织将支持接种到本公开内容的三维培养系统中的组织特有的细胞的生长。实际上，当用组织特有的细胞接种时，三维基质组织将维持培养物的活跃增殖，持续长的时间段。重要地，因为网的开口允许培养物中的基质细胞离开，汇合的基质培养物没有展示接触抑制，且基质细胞继续生长、分裂和保持功能上是活性的。
[0168]生长因子和调节因子由基质组织加工到培养基中。生长因子(例如但不限于，aFGF、PFGF、胰岛素生长因子或TGF-β)、或天然的或改性的血液制品或其他生物活性的生物分子(例如但不限于，透明质酸或激素类)，增强三维骨架或支架的定植(colonization)并调节培养基。
[0169]在体内使用培养物之前可以改变基质细胞生长的程度，这取决于以三维组织培养生长的组织的类型。调节培养基的活的基质组织可以通过将它们植入体内而用作矫正结构。可选择地，活的基质组织可以用另一种细胞类型接种并植入体内。基质细胞可以被基因工程为调节分泌到培养基中的蛋白产物的水平以提高从经调节的培养基获得的回收产物的浓度。例如，基质细胞可以被基因工程为提高从经调节的培养基获得的以下产物中的一种或多种的浓度。抗炎因子例如抗GM-CSF、抗TNF、抗IL-1、抗IL-2等。可选择地，基质细胞可以被基因工程为“破坏”促进炎症的天然基因产物的表达，例如，GM-CSF, TNF, IL-UIL-2，或“破坏” MHC的表达以便降低排斥的风险。
[0170]基质细胞以三维生长将维持基质细胞和组织特有的细胞两者在培养物中的活跃增殖，持续比单层系统持续的时间更长的时间。此外，三维系统支持细胞在体外培养中的成熟、分化和分离，以形成类似于在体内发现的对应物的成人组织组分且将蛋白固定到更接近地类似生理比率的调节的培养基中。
[0171]a.三维基质组织的建立
[0172]三维支撑物或骨架可以是任何材料和/或形状，该材料和/或形状:(a)允许细胞附接至其(或可以被修饰为允许细胞附接至其)；和(b)允许细胞以多于一层生长。许多不同的材料可以用于形成骨架，`包括但不限于:不可生物降解的材料，例如，尼龙(聚酰胺)、涤纶(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯基化合物(例如，聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE ;特氟隆)、thermanox(TPX)、硝酸纤维素、棉花；和可生物降解的材料，例如，聚乙醇酸(PGA)、胶原、胶原海绵、肠线、纤维素、明胶、葡聚糖、聚链烷酸酯等。这些材料中的任何可以例如被纺织、编织、针织等为网，以形成三维骨架。骨架又可以被塑造成矫正结构所需的任何形状，例如管、绳、细丝等。某些材料例如尼龙、聚苯乙烯等是用于细胞附着的差的基材。当这些材料用作三维骨架时，可取的是在接种基质细胞之前预处理骨架以便增强基质细胞附着到支撑物。例如，在用基质细胞接种之前，尼龙骨架可以用0.1M乙酸来处理，并在聚赖氨酸、FBS和/或胶原中温育以包覆尼龙。聚苯乙烯可以同样地使用硫酸来处理。
[0173]当培养物被植入体内时，可以优选使用可生物降解的基质，例如诸如聚乙醇酸、胶原、胶原海绵、纺织胶原、肠线材料、明胶、聚乳酸、或聚乙醇酸和其共聚物。当培养物将被维持长的时间段或低温保存时，不可降解的材料例如尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯类聚合物、特氟隆、棉花等可以是优选的。可以根据本公开内容使用的方便的尼龙网是NITEX?,其是具有210 μ m的平均孔径和90 μ m的平均尼龙纤维直径的尼龙过滤网(#3-210/36, Tetko, Inc.，N.Y.)。
[0174]具有或不具有下面所描述的其他细胞和成分的包括成纤维细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞的基质细胞，被接种到骨架上。此外，在疏松结缔组织中存在的细胞连同成纤维细胞可以被接种到三维支撑物上。这样的细胞包括但不限于平滑肌细胞、内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞、月旨肪细胞等。如先前解释，胎儿成纤维细胞可以用于形成将支持各种不同的细胞和/或组织的生长的“一般的”三维基质基体。然而，“特殊的”基质组织可以通过用源自将被培养的相同类型的组织和/或源自稍后接收根据三维系统在培养物中生长的细胞和/或组织的特定个体的成纤维细胞接种三维骨架来制备。
[0175]因此，在一个实施方案中，可以培养专门用于特定组织的基质细胞。例如，造血组织的基质细胞，包括但不限于成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞/单核细胞、脂肪细胞和网状细胞，可以用于形成三维近汇合基质，用于在体外长期培养骨髓。造血基质细胞可以容易地通过以低的力例如3000xg离心从骨髓悬浮液中形成的“血沉棕黄层”获得。在构成动脉的内壁的基质层中，可以加入高比例的未分化的平滑肌细胞以为蛋白提供弹性。肝的基质细胞可以包括成纤维细胞、库柏法细胞、以及血管和胆管内皮细胞。同样地，神经胶质细胞可以用作基质来支持神经细胞和组织的增殖；用于该目的的神经胶质细胞可以通过胚胎或成年脑的胰蛋白酶化或胶原酶消化来获得(Ponten和Westermark, 1980,在Federof, S.Hertz,L.编辑“Advances in Cellular Neurobiology, ^ 第 I 卷，New York, AcademicPress，第209-227页中)。细胞在三维基质细胞培养物中生长可以通过向骨架加入以下物质或用这些物质包覆支撑物来进一步增强:蛋白(例如，胶原、弹性纤维、网状纤维)糖蛋白、葡糖氨基葡聚糖(例如硫酸肝素、硫酸软骨素_4、硫酸软骨素-6、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等)、细胞基质、和/或其他材料。
[0176]此外，间充质干细胞(血统定向或非定向的祖细胞)是用于接种到骨架上的有利的“基质”细胞。细胞可以分化为骨细胞、腱和韧带的成纤维细胞、骨髓基质细胞、结缔组织的脂肪细胞和其他细胞、软骨细胞，这取决于内生的或补充的生长以及调节因子和其他因子，包括前列腺素、白细胞介素和天然存在的抑素，其调节增殖和/或分化。
[0177]成纤维细胞可以容易地通过分解作为成纤维细胞的源的适当的器官或组织而分离。这可以容易地使用本领域技术人员已知的技术来完成。例如，组织或器官可以用机械方法来分解和/或用消弱在邻近细胞之`间的连接的消化酶和/或螯合剂处理，使得可以将组织分散成单个细胞的悬浮液，而没有明显的细胞破裂。酶促离解可以通过切碎组织和用许多消化酶中的任何单独地或组合地处理切碎的组织来完成。这些包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、和/或透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、链酶蛋白酶、分散酶等。机械破坏还可以通过许多方法来完成，包括但不限于，仅举几个例子，使用研磨机、搅拌机、筛、匀浆器、压力室或绝缘子(insonator)。对于组织解聚技术的综述，参见 Freshney, Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques,第 2 版，A.R.Liss, Inc.，New York, 1987，第 9 章，第 107-126 页。
[0178]一旦组织已经简化为单个细胞的悬浮液，悬浮液就可以被分为亚群，可以从该亚群获得成纤维细胞和/或其他基质细胞和/或成分。这还可以使用用于细胞分离的标准技术来完成，包括但不限于，具体细胞类型的克隆和选择、不需要的细胞的选择性破坏(阴性选择)、基于混合种群中的差别的细胞可凝集性的分离、冻-融程序、混合种群中的细胞的差别附着性质、过滤、常规离心和区带离心、淘析离心法(逆流离心)、单位重力分离、逆流分布法、电泳和荧光活化细胞分选。对于无性选择和细胞分离技术的综述，参见 Freshney, Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques,第 2 版，A.R.Liss, Inc., New York, 1987，第 11 和 12 章，第 137-168 页。
[0179]成纤维细胞的分离可以例如如下进行:将新鲜的组织样品彻底地洗涤并在汉克平衡盐溶液(HBSS)中切碎以除去血清。将切碎的组织在新制备的离解酶例如胰蛋白酶溶液中温育1-12小时。在这样的温育之后，离解的细胞被悬浮，通过离心做成丸并覆盖在培养容器上。所有成纤维细胞将在其他细胞之前附着，因此，适当的基质细胞可以被选择性地分离和生长。然后，分离的成纤维细胞可以生长成合流，从汇合的培养物中提起和接种到三维基质上(参见，Naughton等人，1987，J.Med.18 (3和4) 219-250)。用高浓度的基质细胞例如约IO6至5X IO7细胞/ml接种三维骨架将导致在较短的时间段内建立三维基质组织。
[0180]在接种基质细胞之后，应在适当的营养培养基中温育三维骨架。如前所述的，许多商购的培养基例如RPMI1640、Fisher’ s、Iscove’ s、McCoy’ s等可以适于使用。重要的是，在温育期期间，三维基质细胞培养物被悬浮或漂浮在培养基中以使增殖活性最大化。培养物被定期地“进料”，且回收和加工经调节的培养基，如下面部分5.6和5.7所描述的。因此，取决于待被培养的组织和所需的胶原类型，可以选择适当的基质细胞来接种三维基质。
[0181]在温育三维基质细胞培养物期间，可以从基质释放增殖的细胞。这些释放的细胞可以粘住培养容器的壁，在该处它们可以继续增殖和形成汇合的单层。这应(例如)通过在进料期间除去释放的细胞，或通过将三维基质培养物转移至新的培养容器来防止或最小化。容器中存在汇合的单层将“停止”细胞在三维基质和/或培养物中的生长。除去汇合的单层或将培养物转移至新容器中的新鲜培养基将恢复三维培养系统的增殖活性。应注意，如果需要的话，对经调节的培养基进行加工，使得其不包含任何全细胞(除非全细胞用于特殊应用)。这样的除去或转移应在具有超过25%合流的基质单层的任何培养容器中进行。可选择地，培养系统可以被搅拌以防止释放的细胞粘住，或代替地定期地进料培养物，培养系统可以被设置为 使得新鲜的培养基连续地流过系统。流速可以被调节为使在三维培养物内的增殖最大化，和洗出和除去从培养物释放的细胞，使得它们将不粘住容器的壁并生长至合流。
[0182]其他细胞例如实质细胞，可以在三维活基质组织上接种和生长。
[0183]b.将另外的细胞接种到细胞培养物中
[0184]一旦细胞培养物已经达到特定的生长程度，就可以将另外的细胞接种到细胞培养物中并连同细胞培养物的细胞一起培养。另外的细胞在活组织上在体外生长以形成自然组织的经培养的对应物，且通过以类似于生理水平的比率将胞外产物加工到培养基中来调节培养基。接种物中的高浓度细胞将有利地比低浓度更快地导致在培养物中增加的增殖。
[0185]选择用于接种的细胞将取决于待被培养的组织，所述组织可以包括但不限于，仅举几个例子，骨髓、皮肤、肝、胰腺、肾、神经组织、肾上腺、粘膜上皮和平滑肌。这样的细胞将特有的胞外蛋白例如某些生长因子加工到培养基中，导致优化用于某些组织特殊应用的培养基。
[0186]例如且不是作为限制，可以在活组织上培养各种上皮细胞。这样的上皮细胞的实例包括(但不限于)角质形成细胞、口腔粘膜和胃肠(G.1.)道细胞。这样的上皮细胞可以通过以下来分离:根据本领域已知的方法酶促处理组织，随后使这些细胞在培养物中扩展和将上皮细胞应用至(例如)三维基质支撑物细胞基质。基质支撑物的存在提供了促进上皮细胞的正常分裂和分化的生长因子和其他蛋白。
[0187]一般而言，该接种物应包括该组织的“干”细胞(还称为“储备”细胞)；即，产生新细胞的那些细胞，新细胞将成熟为形成组织的各种组分的特殊细胞。
[0188]接种物中使用的实质细胞或其他表面层细胞可以从通过使用用于获得基质细胞的上述标准技术来分解所需的组织而制备的细胞悬浮液获得。整个细胞悬浮液本身可以用于接种三维活基质组织。因此，包含在匀浆内的再生细胞将在基质上适当地增殖、成熟和分化，而非再生细胞将不会。可选择地，特定的细胞类型可以使用用于分级基质细胞的上述标准技术从细胞悬浮液的适当部分分离。当“干”细胞或“储备”细胞可以容易地被分离时，这些可以用于优先地接种三维基质支撑物。例如，当培养骨髓时，基质可以用新鲜的或源自低温保存样品的骨髓细胞来接种。当培养皮肤时，三维基质可以用黑素细胞和角质形成细胞来接种。当培养肝时，三维基质可以用肝细胞来接种。当培养胰腺时，三维基质可以用胰腺内分泌细胞来接种。对于可以用于从各种组织获得实质细胞的方法的综述，参见，Freshney, Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique,第 2 版，A.R.Liss, Inc.，New York, 1987，第 20 章,第 257-288 页。
[0189]实际上，在接种之前沉积在基质基体上的不同比例的各种类型胶原可以影响稍后接种的组织特有细胞的生长。例如，为了造血细胞的最佳生长，基质应优选地在初始基质中包含6:3:1的近似比率的胶原类型II1、IV和I。对于三维皮肤培养系统，胶原类型I和III优选地被沉积在初始基质中。被沉积的胶原类型的比例可以通过选择加工适当的胶原类型的成纤维细胞来操 纵或增强。这可以使用能够激活补体且界定特定的胶原类型的适当的同种型或亚纲的单克隆抗体来完成。这些抗体和补体可以用于不利地选择表达所需的胶原类型的成纤维细胞。可选择地，用于接种基质的基质细胞可以是合成所需的适当的胶原类型的细胞的混合物。表1中示出各种类型的胶原的分布和来源。
[0190]表1
【权利要求】
1.一种用于制备经代谢的细胞提取物的工艺，所述工艺包括: (a)提供细胞提取物； (b)培养酵母细胞； (C)将所述酵母细胞暴露于所述细胞提取物； (d)培养所述酵母细胞以使所述细胞提取物的至少一部分代谢，和； (e)收集所述经代谢的细胞提取物。
2.根据权利要求1所述的工艺，其中将步骤(e)的所述收集的经代谢的细胞提取物浓缩、过滤和/或纯 化。
【文档编号】C12P1/02GK103816108SQ201310559913
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2011年11月11日 优先权日:2010年11月12日
【发明者】J·V·格鲁伯, S·饶, R·梅塔, S·蒿蒂 申请人:阿勒根公司, 奥麒个人护理产品公司