一种水稻基因组dna的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻基因组DNA的提取方法，包括裂解、提取、离心分离、酶解以及沉淀等步骤。通过本发明的方法，能够简易有效的提取水稻大片段基因组DNA，与现有的技术相比，能简化操作步骤，减少离心次数和转速，减少所需试剂的数量，DNA的质量完全可以满足包括基因组文库构建、基因组序列扩增、Southern?blot，TAIL-PCR等在内的常见后续实验的要求。
【专利说明】一种水稻基因组DNA的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物领域，具体而言，涉及一种高纯度、大片段水稻基因组DNA的简易提取方法。
【背景技术】
[0002]水稻不仅是主要的粮食作物，而且是重要的模式生物。随着水稻基因组研究的发展，分子生物学技术在水稻研究中得到广泛地的应用。在水稻分子生物学研究中，提取和制备其DNA是许多研究工作的基础和前提，例如:构建基因组文库、Southern杂交、RFLP, PCR分离基因以及调控区等。在这些基于基因组DNA的操作中，对提取DNA的质量要求不仅包括高得率、高纯度、完整性好且断裂降解程度尽可能小，而且要尽量排除其他大分子，如蛋白质、多糖等的污染。由于一些植物组织材料中富含多糖和酚类物质，如果在DNA提取中未将其有效的去除，将抑制后续的操作，包括酶切、PCR反应，所以在DNA的抽提中，要应尽可能将其去除。
[0003]目前常用的水稻基因组DNA的提取方法主要有CTAB法和SDS法，在此基础上，根据不同的实验需要，还有一些衍生的简易制备微量DNA方法的报道[3-11]。这些方法的原理是利用基因组DNA分子量远远大于细胞器DNA的特点，在破碎细胞后，通过有机试剂的多次抽提，将基因组DNA溶解在水相中，最后通过异丙醇或乙醇将其沉淀，达到分离提取的目的。根据实验目的的不同，对提取DNA的质量和大小的要求也不同，例如:构建基因组文库，初始DNA长度必须在IOOkb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段就很少，获得的基因组文库的库容就小，达不到覆盖基因组全部遗传信息的目的；如果是RFLP和PCR分析，DNA长度要达到50kb才可以满足实验需要。
[0004]现有的DNA提取方法，为去除蛋白质、多糖等大分子，需要在抽提过程中采用有机试剂多次处理、多次离心，而这样的多步骤操作，势必在提取过程中，不可避免的造成染色体DNA机械断裂，产生大小不同的片段。因此，平衡好DNA纯度和长度两个因素是建立有效提取方法的关键。目前符合制备基因组文库要求的、长度至少在IOOkb以上的高纯度、大片段水稻基因组DNA的简易制备方法还未见报道。
【发明内容】
[0005]由于提取高纯度、大片段基因组DNA是许多分子生物学实验的基础和前提，现有的方法大多关注DNA的得率和操作的简便性，对提取DNA的长度这一主要质量指标重视不足，导致不能满足一些后续实验，例如构建基因组文库要求。本发明的目的是建立了一种简便的、适合从水稻黄化苗中提取大片段基因组DNA的方法，这种既关注质量，也兼顾操作简便的技术方法同样适用于其他的植物材料。
[0006]为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0007]本发明一方面涉及一种水稻基因组DNA的提取方法，其特征在于包括如下步骤:
[0008](I)取新鲜水稻黄花苗材料液氮研磨，化冻前将粉末转移至预热至60-70°C的CTAB缓冲液中，轻轻转动离心管，轻柔混匀，水浴保温l_3h。
[0009](2)将裂解混合物从水浴取出，冷却至室温后，加入0.8-1.2倍体积的氯仿/异戊醇,轻轻颠倒混合成乳浊液；
[0010](3)室温4500-5500rpm离心8-15min，将上层水相转至新容器中，加I / 1000-2 /100体积的RNase A溶液,轻柔颠倒混匀，36-38°C保温20min-40min ；
[0011](4)加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，待有白色丝状物产生，收集白色丝状物；
[0012](5)将收集丝状DNA用60 % -80 %乙醇洗涤2次；
[0013](6)将洗涤后的DNA在室温空气干燥。
[0014]在本发明的一个优选实施方式中，所述的CTAB缓冲液的pH值为7.9-8.1之间，包括Tris-HCl缓冲溶液，EDTA, NaCl以及CTAB，使用前加入0.2% B-巯基乙醇。
[0015]在本发明的另一个优选实施方式中，所述的氯仿/异戊醇的体积比是24:1。
[0016]在本发明的一个优选实施方式中，所述的RNase A的浓度为8_20mg / mL。
[0017]本发明建立了一种简易有效的水稻大片段基因组DNA的提取技术，与现有的技术相比，能简化操作步骤，减少离心次数和转速，减少所需试剂的数量，DNA的质量完全可以满足包括基因组文库构建、基因组序列扩增、Southern blot, TAIL-PCR等在内的常见后续实验的要求。
【专利附图】
【附图说明】`
[0018]图1:实施例1所提取的水稻基因组DNA的0.7%琼脂糖凝胶电泳检测结果:其中M =Lambda DNA / Hind III Marker (0.5ug) ;1_3:基因组 DNA(5ul)
【具体实施方式】
[0019]实施例1
[0020](I)取I克新鲜水稻黄花苗材料液氮研磨，化冻前将粉末转移至2ml已预热至650C的CTAB缓冲液中(在水浴中)，轻轻转动离心管，轻柔混匀，65°C水浴保温2h。其中CTAB 缓冲液:100mM Tris-HCl (pH8.0), 20mM EDTA, 1.4M NaCl，2 % CTAB，用前加入 0.2 %β-巯基乙醇；
[0021](2)将裂解混合物从水浴取出，冷却至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(两者的体积比24:1)，轻轻颠倒混合成乳浊液。
[0022](3)室温5000rpm离心IOmin,将上层水相转至新管中，加I / 100体积的RNaseA(10mg / ml),轻柔颠倒混匀，37°C保温30min。
[0023](4)加入0.7倍体积的异丙醇，仔细混匀，一旦有白色丝状物产生,立即用玻璃钩将其钩出。
[0024](5)将钩出的丝状DNA用20ml 70%乙醇洗涤2次。
[0025](6)将DNA挑出到新离心管中，室温空气干燥后，溶于尽可能少的TE中，4°C储存。
[0026]根据本实施例的方法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果，依据Lambda DNA /Hind III DNA Marker条带的指示，本方法提取的DNA长度达到了 50kb以上，而且是DNA群体的主要组分(图1)。由于琼脂糖凝胶电泳分辨率的限制，50kb以上的DNA条带堆积在凝胶中，显示为一条亮度较高的条带。电泳中，RNA条带由于在提取中已经过RNase A消化，所以亮度较弱(未显示)。采用分光光度法测定样品在0D260和0D280吸收值，以0D260 /0D280计算DNA纯度，结果显示，比值一般在2.0左右，稍有波动，说明提取的DNA中所含的RNA和蛋白质污染极少，符合后续实验对DNA质量的要求。
[0027]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范`围为准。
【权利要求】
1.一种水稻基因组DNA的提取方法，其特征在于包括如下步骤: (1)取新鲜水稻黄花苗材料液氮研磨，化冻前将粉末转移至预热至60-70°C的CTAB缓冲液中，轻轻转动离心管，轻柔混匀，水浴保温l_3h。 (2)将裂解混合物从水浴取出，冷却至室温后，加入0.8-1.2倍体积的氯仿/异戊醇，氯仿/异戊醇的体积比为20— 30:1，轻轻颠倒混合成乳浊液； (3)室温4500-5500rpm离心8-15min，将上层水相转至新容器中，加I/ 1000-2 / 100体积的RNase A溶液,轻柔颠倒混匀，36-38°C保温20min-40min ； (4)加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，待有白色丝状物产生，收集白色丝状物； (5)将收集丝状DNA用60%-80%乙醇洗涤2次； (6)将洗涤后的DNA在室温空气干燥。
2.根据权利要求1所述的提取方法，所述的CTAB缓冲液的pH值为7.9-8.1之间，包括Tris-HCl缓冲溶液，EDTA, NaCl以及CTAB，使用前加入0.2% β -巯基乙醇。
3.根据权利要求1所述的提取方法，所述的氯仿/异戊醇的体积比是24:1。
4.根据权利要求1所述的提取方法，所述`的RNaseA的浓度为8_20mg / mL。
【文档编号】C12N15/10GK103555712SQ201310559435
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】梁卫红, 李佳佳, 楼晨, 林群婷, 杨丹丹, 王俊杰, 郝雨帆 申请人:河南师范大学