一种用于细胞高效分离的生物芯片的制作方法
【专利摘要】一种用于细胞高效分离的生物芯片，由盖片层和置于其下的载片组成；盖片层内开有用于细胞高效分离的微通道，微通道包括依次连通的加液口、分离区和排液口，分离区和加液口连通的第一分离区由多个相间分布的扩张段和对称尖角结构组成，和排液口连通的第二分离区是由第一分离区分支的三个通道，排液口包括和第二分离区的三个通道分别连通的中间排液口和两侧排液口；加液口和排液口为在盖片层上开设的通孔，分离区为在盖片层上开设的盲道，底部和载片表面相通；尺寸较大的细胞具有较大的惯性，较快地移动至微通道的中心，由中间排液口排出，尺寸较小的细胞被排布于微通道的两侧，由两侧排液口排出，实现大小不同细胞的高效分离；可以被广泛地应用于生物医学和环境监测等领域。
【专利说明】—种用于细胞高效分离的生物芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物芯片，具体涉及一种用于细胞高效分离的生物芯片。
【背景技术】
[0002]医学领域中，血液检测是评估人体健康状况的一个重要途径。血液中的血细胞主要分为红细胞、白细胞和血小板。红细胞一般呈双凹圆盘状，在人体中主要起到物质输送的作用，如从肺吸入的氧气及消化道吸收的营养物质都依靠红细胞运输才能到达全身各组织，同时组织代谢产生的二氧化碳与其他废物也依赖血液中的红细胞运输到肺、肾等处排泄，从而保持身体的正常代谢。白细胞为无色有核的球形细胞，一般较红细胞体积大，能作变形运动穿过毛细血管进入周围组织，发挥其防御和免疫功能，这是由于白细胞能吞噬异物产生抗体，在机体损伤治疗、抗御病原入侵和对疾病的免疫方面起着重要的作用。光镜下根据白细胞质内有无特殊颗粒可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞两类，有粒白细胞又可以根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种。白细胞中的五种细胞，在机体健康维护中各有分工:中性粒细胞在人体伤口处包围并杀灭细菌和异物，其还可吞噬机体内的坏死细胞，参与炎症反应；嗜酸性颗粒细胞能够消除异物的毒性；嗜碱性粒细胞则可以释放抗凝血剂使血管扩张与收缩；淋巴细胞可以使肿瘤缩小。其中T淋巴细胞主要参与细胞免疫，B淋巴细胞主要参与体液免疫。此外，淋巴细胞还合成并分泌多种淋巴因子参与造血调控；单核细胞会清除、杀灭外来微生物，消除受伤或死亡的细胞和细胞碎片。血小板在止血过程中起着重要作用，正常生理情况下,血小板有着相对稳定的数量。当血液中的血小板含量发生变化时,病人的血液止血和凝血功能将出现异常。严重时会危机病人的生命安全。通过检测血液中血小板的含量，对正确评估病人血液止血和凝血功能有着重要的意义。检测结果同时可以作为患者是否需要进行血小板输注的参考指标。
[0003]血液中的各类血细胞各有分工，对人体健康起着不同的作用，因此准确地检测血液中某种或多种血细胞的含量和属性，对评估人体健康状况有着重要的意义。为了准确地检测血液中某种血细胞的含量和属性，或对某种细胞进行培养与研究，需要将目标细胞与其他细胞分离开，以排除其他细胞的影响。除此之外，在疾病诊断、环境监测等领域也需要细胞分离。如艾滋病的诊断和研究中需要将T淋巴细胞从血液中的其他细胞中分离出来；疟疾的诊断和治疗需要将被感染的红细胞从正常红细胞中分离出来；胎儿健康状况的监测需要将胎儿的红细胞从母体周边血液中分离出来；将水体中的藻类细胞进行分离和检测，为水污染的预防和治理提供直接的参考。
[0004]传统的血细胞分离方法主要包括离心式细胞分离技术、流式细胞分选技术、电泳式细胞分离技术。离心式细胞分离技术是基于不同细胞的密度差异，使用离心机将目标细胞分离出来。流式细胞分选技术是使包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，而后使用激光束依次照射到每个细胞上，不同的细胞会发出不同的散射光和荧光，通过探测设备检测每个细胞发出的光学信号，而后转换成电信号再输入电脑处理，以判断细胞的种类，然后再利用某种手段将目标细胞从其他细胞中分离出来。电泳式细胞分离技术则是利用不同细胞的表面电位的差异，在电场作用下，不同的细胞会产生不同的泳动速度，根据细胞泳动速度的不同将目标细胞分离出来。传统的细胞分离方法虽可以将目标细胞从其他细胞中分离出来，但是存在以下缺点:1)价格昂贵，成本高，不利于在基层医疗机构中的推广和使用；2)需要外加动力，耗能高；3)体积庞大，不便于携带；4)结构复杂，需要精密设备辅助；5)使用及维护费用高。
【发明内容】
[0005]为解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于细胞高效分离的生物芯片，具有集成化，精度高，结构简单，操作简易，成本低，体积小等特点，将在生物医学、环境监测和机械检测等领域发挥重要作用。
[0006]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]—种用于细胞高效分离的生物芯片，生物芯片由盖片层4和置于盖片层4下的载片5组成；所述盖片层4内开设有用于细胞高效分离的微通道，所述微通道包括依次连通的加液口 1、分离区2和排液口 3，所述分离区2和加液口 I连通的第一分离区2-1由多个相间分布的扩张段和对称尖角结构组成，和排液口 3连通的第二分离区2-2是由第一分离区
2-1分支的三个通道，所述排液口 3包括和第二分离区2-2的三个通道分别连通的中间排液口 3-1和两侧排液口 3-2 ;所述加液口 I和排液口 3为在盖片层4上开设的通孔，所述分离区2为在盖片层4上开设的盲道，底部和载片5表面相通。[0008]所述微通道位于盖片层4和载片5相结合处的中央位置。
[0009]所述盖片层4和载片5通过等离子不可逆处理结合在一起。
[0010]所述第一分离区2-1由100组对称尖角结构和扩张段组成。
[0011]所述加液口 I和排液口 3均为圆柱形孔。
[0012]所述加液口 I和排液口 3的深度为50 u m,直径为10mm。
[0013]所述对称尖角结构的尖角角度为45度，对称尖角结构的尖角伸入分离区2的长度为80 ii m，尖角沿流动方向上的长度为80 u m,相对的两个尖角相距40 u m,相邻尖角在流动方向上的距离为200 u m,扩张段宽度为200 u m。
[0014]所述盖片层4的材料为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。
[0015]所述载片5的材料为玻璃或硅。
[0016]本发明基于不同细胞具有不同的惯性。尺寸大的细胞具有更大的惯性，当细胞流经本发明的微通道时，同时受到惯性升力和离心力。惯性升力将细胞推到微通道的两侧，而由尖角结构引起的离心力则将细胞推至通道的中心。大细胞由于具有更大的惯性，在惯性升力和离心力的作用下，将比小细胞更快地移动到微通道的中心，最后大细胞由中间排液口排除，小细胞进入两侧排液口，实现不同细胞的分离。
[0017]本发明和现有技术相比较，具有如下优点:
[0018]I)成本低，价格低廉，与其他传统及主动式的微流体细胞分离技术相比，本发明无需昂贵的辅助设备，因而对商品化的市场推广带来便利。
[0019]2)体积小，便于携带，可以方便地应用于家庭医疗及个人保健等方面。
[0020]3)精度高，可以实现不同尺寸细胞的完全分离，与其他被动式的微流体细胞分离技术相比，可以在无外力场的作用下实现不同尺寸细胞的完全分离，提高了细胞分离的精度。
[0021]4)机械结构简单，操作容易，加工制作过程简单方便。
[0022]5)集成化，可扩展性高，可与具有其他功能的生物芯片相结合，促进分析系统的集成化和自动化。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明细胞高效分离生物芯片的俯视图。
[0024]图2为图1沿A-A向的剖视图。
[0025]图3为图1沿B-B向的剖视图。
[0026]图4为本发明细胞高效分离生物芯片的三维示意图。
[0027]图5为本发明细胞高效分离生物芯片颗粒实验验证结果图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0029]如图1至图4所示，本发明一种用于细胞高效分离的生物芯片，该生物芯片由标准软光刻技术加工，由盖片层4和置于盖片层4下的载片5组成；盖片层4内开设有用于细胞高效分离的微通道，微通道包括依次连通的加液口 1、分离区2和排液口 3，分离区2和加液口 I连通的第一分离区2-1由多个相间分布的扩张段和对称尖角结构组成，和排液口 3连通的第二分离区2-2是由第一分离区2-1分支的三个通道，排液口 3包括和第二分离区2-2的三个通道分别连通的中间排液口 3-1和两侧排液口 3-2 ;加液口 I和排液口 3为在盖片层4上开设的通孔，分离区2为在盖片层4上开设的盲道，底部和载片5表面相通。
[0030]作为本发明的优选实施方式，所述微通道位于盖片层4和载片5相结合处的中央位置。
[0031]作为本发明的优选实施方式，所述盖片层4和载片5通过等离子不可逆处理结合
在一起。
[0032]作为本发明的优选实施方式，所述第一分离区2-1由100组对称尖角结构和扩张段组成。 [0033]作为本发明的优选实施方式，所述加液口 I和排液口 3均为圆柱形孔。
[0034]作为本发明的优选实施方式，所述加液口 I和排液口 3的深度为50iim，直径为IOmm0
[0035]作为本发明的优选实施方式，所述对称尖角结构的尖角角度为45度，对称尖角结构的尖角伸入分离区2的长度为80 iim，尖角沿流动方向上的长度为80iim，相对的两个尖角相距40 u m,相邻尖角在流动方向上的距离为200 u m,扩张段宽度为200 u m。
[0036]作为本发明的优选实施方式，所述盖片层4的材料为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。
[0037]作为本发明的优选实施方式，所述载片5的材料为玻璃或娃。
[0038]本发明的工作原理为:细胞样本液由加液口 I加注入微通道,而后进入用于细胞分离的分离区2，细胞在分离区2中同时受到惯性升力和离心力。尺寸较大的细胞具有较大的惯性，较快地移动至微通道的中心，而后由中间排液口 3-1排出，尺寸较小的细胞在分离区2中被排布于微通道的两侧，最后由两侧排液口 3-2排出，实现大小不同的细胞的高效分离。
[0039]下面以将血液中的红细胞和白细胞分离为例来说明本发明的具体实施例如下:
[0040]①提取待处理的血液样本；
[0041]②在驱动设备(如注射泵)的驱动下，血液样本以一定的流量由加液区I加注到本发明的生物芯片中；
[0042]③血液中的红细胞和白细胞在分离区2中同时受到惯性升力和由尖角结构引发的离心力。白细胞较红细胞的体积更大，具有更大的惯性。在两种力的共同作用下，在分离区2中白细胞较红细胞将更早地移动至微通道的中心，红细胞分布在微通道的两侧；
[0043]④经过分离区2后，白细胞进入中间排液口 3-1 ;红细胞进入两侧排液口 3-2 ；
[0044]⑤从中间排液口 3-1中抽取白细胞，从两侧排液口 3-2中抽取红细胞，用于下一步的研究。
[0045]为验证本发明分离效果的可靠性，使用本发明对直径为7.32微米和15.5微米的荧光聚苯乙烯颗粒(尺寸分别对应于红细胞和白细胞)进行了分离实验。将颗粒溶于去离子水中，并采用可以精确控制流 量的注射泵注入颗粒液，利用荧光显微镜和CCD摄相机跟踪拍摄颗粒群轨迹。两种颗粒的分离结果如图5所示，实验验证了本发明可以实现不同大小颗粒的高效分离，从而在生物医学、环境监测等领域发挥重要作用。
【权利要求】
1.一种用于细胞高效分离的生物芯片，其特征在于:由盖片层(4)和置于盖片层(4)下的载片(5)组成；所述盖片层(4)内开设有用于细胞高效分离的微通道，所述微通道包括依次连通的加液口(I)、分离区(2)和排液口(3)，所述分离区(2)和加液口(I)连通的第一分离区(2-1)由多个相间分布的扩张段和对称尖角结构组成，和排液口(3)连通的第二分离区(2-2)是由第一分离区(2-1)分支的三个通道，所述排液口(3)包括和第二分离区(2-2)的三个通道分别连通的中间排液口(3-1)和两侧排液口(3-2);所述加液口(I)和排液口(3)为在盖片层(4)上开设的通孔，所述分离区(2)为在盖片层(4)上开设的盲道，底部和载片(5)表面相通。
2.根据权利要求1所述的一种用于细胞高效分离的生物芯片，其特征在于:所述微通道位于盖片层(4)和载片(5)相结合处的中央位置。
3.根据权利要求1所述的一种用于细胞高效分离的生物芯片，其特征在于:所述盖片层(4)和载片(5)通过等离子不可逆处理结合在一起。
4.根据权利要求1所述的一种用于细胞高效分离的生物芯片，其特征在于:所述第一分离区(2-1)由100组对称尖角结构和扩张段组成。
5.根据权利要求1所述的一种用于细胞高效分离的生物芯片，其特征在于:所述加液口(1)和排液口(3)均为圆柱形孔。
6.根据权利要求5所述的一种用于细胞高效分离的生物芯片，其特征在于:所述加液口(1)和排液口(3)的深度为50iim，直径为10_。
7.根据权利要求1所述的一种用于细胞高效分离的生物芯片，其特征在于:所述对称尖角结构的尖角角度为45度，对称尖角结构的尖角伸入分离区(2)的长度为80 iim，尖角沿流动方向上的长度为80 u m，相对的两个尖角相距40 u m,相邻尖角在流动方向上的距离为200 u m,扩张段宽度为200 u m。
8.根据权利要求1所述的一种用于细胞高效分离的生物芯片，其特征在于:所述盖片层(4)的材料为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS。
9.根据权利要求1所述的一种用于细胞高效分离的生物芯片，其特征在于:所述载片(5)的材料为玻璃或硅。
【文档编号】C12M1/00GK103642672SQ201310602809
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】赵亮, 范亮亮, 魏庆宇, 罗帅帅, 者江 申请人:西安交通大学