一种快速检测牛鹦鹉热嗜衣原体的方法
【专利摘要】本发明提供一种特异快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan?MGB探针实时荧光定量PCR的方法。本发明提供了检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan?MGB探针实时荧光的特异性引物如下：根据GenBank中牛鹦鹉热衣原体主要外膜A蛋白的基因序列，利用Primer?5.0软件设计引物，包括上游引物和下游引物序列，同时针对引物之间的基因片段设计TaqMAN探针，5’端标记FAM，3’端标记NFQ-MGB，扩增目标片段的长度为180bp。本发明的检测鹦鹉热嗜衣原体的探针实时荧光定量PCR方法，检测灵敏度高，操作简单快速，并且成功应用于奶牛鹦鹉热嗜衣原体样本中的检测，可为病原微生物DNA的快速检测提供了一种有效的试剂盒。
【专利说明】一种快速检测牛鹦鹉热嗜衣原体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种特异、敏感、快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR的方法。
【背景技术】
[0002]动物衣原体病(Chlamydiosis)是由各类衣原体感染哺乳动物、禽类所发生的一类十分重要的自然疫源性传染病。鹦鹉热衣原体对各种畜、禽及其他动物均有致病性，针对奶牛养殖业，通常造成怀孕4一5个月的奶牛流产，造成巨大的经济损失，如果能早期快速诊断鹦鹉热衣原体，对其的防控具有重要意义。
[0003]婴I踏热嗜衣原体(Chlamydophilapsittaci, Cps)是一类专性细胞内寄生的人兽共患病病原体，能引起人和动物多种疾病。Cps对鸟类、家禽和家畜有很强的感染性，可引起禽类的肺炎、气囊炎、输卵管炎及受精率降低和哺乳动物流产、死产等生殖系统障碍，是一类十分重要的自然疫源性传染病，呈地方流行。牛衣原体病是由鹦鹉热衣原体感染牛引起的一种多症状性传染病，主要表现为妊娠母牛流产、死产和产弱犊；新生牛多发生肺炎、肠炎、多发性关节炎、脑炎和结膜炎；种公牛发生睾丸炎等，对奶牛养殖业造成很大危害及经济损失。
[0004]目前针对鹦鹉热衣原体疾病的检测主要通过检测病原体是否存在来作为主要依据，常用的有碘和Giemsa染色，免疫荧光法，根据抗原抗体的酶免疫技术以及灵敏度比较高的PCR技术。然而针对PCR反应，目前主要体现在MOMP基因、rRNA基因和内源性质粒这三个目的片段，内源性质 粒的敏感性和特异性高于MOMP基因、rRNA基因的检测，能够检测敏感性达Ifg的质粒DNA，rRNA基因能够检测到IOfg的总DNA，MOMP基因的敏感性却为IOOfg的总DNA，为此我们建立基于TaqMan探针的Real time PCR技术，针对MOMP基因中的ompA(major outer membrane protein A, ompA)基因建立快速的、高灵敏的PCR检测试剂盒，从而为鹦鹉热衣原体感染检测提供强有力的技术保障。
[0005]本研究选取的是衣原体ompA基因保守的序列，设计了针对鹦鹉热衣原体种属的特异性引物和TaqMan MGB探针，通过摸索选用了优化后的实时荧光定量PCR反应条件和扩增体系，提高了检测的特异性和敏感性，建立了 TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR检测鹦鹉热衣原体的方法，并将其固相化集成快速检测试剂盒，敏感性为IOfg的总DNA，同时不与沙眼衣原体55Y120株、肺炎衣原体AR39株、沙眼衣原体、肺炎衣原体、牛结核分枝杆菌、布鲁士杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌和沙门氏菌发生交叉反应，具有较强的特异性。实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于已经被广泛应用于临床诊断，鹦鹉热衣原体的检测尚缺乏这方面的试剂盒，因此，我们建立鹦鹉热衣原体ompA基因的简单快速、准确经济、灵敏度高的TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR检测方法，为鹦鹉热衣原体感染的早期诊断提供强有力的技术支持，对鹦鹉热衣原体感染的防控具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明涉及一种特异、敏感、快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR的方法。本发明涉及的阳性株鹦鹉热衣原体SX5株(牛源)由中国农业科学研究院兰州畜收兽医研究所分离保存；沙眼衣原体55Y120和肺炎衣原体AR39株由中国医学菌种保藏管理中心提供；Hela细胞为实验室保存。
[0007]本发明涉及的敏感性检测显示:标准菌株总DNA进过稀释，最大DNA浓度为I μ g，最小DNA浓度为lfg，每个样3次重复，结果显示Ifg的总DNA在两台仪器中都无扩增曲线，说明最大灵敏度为总DNAlOfg。两台仪器都显示出良好的标准曲线，IQ5仪器的相关系数R2 = 0.996, LightCycler的相关系数R2 = 0.0.993,溶解曲线峰值单一，IQ5仪器的Tm =74.3°C, LightCycler 的 Tm = 74.1°C。
[0008]本发明涉及的特异性检测显示:对阳性鹦鹉热衣原体SX5株、沙眼衣原体55Y120株、
[0009]肺炎衣原体AR39株采用细胞培养分离，提取总DNA，并且进行梯度稀释，采用TaqMan定量PCR上级分析，结果显示阳性鹦鹉热衣原体IOfg以上的总DNA都显示出特异性扩增曲线，并且溶解曲线单一，Tm = 74.1。沙眼衣原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体、牛结核分枝杆菌、布鲁士杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乳链球菌、肺炎克雷伯杆菌和沙门氏菌均为典型阴性反应，均未见特异性的荧光扩增曲线，均无荧光值增长。结果表明，所建立的鹦鹉热衣原体TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有较强的特异性。
[0010]本发明涉及的样品检测显示:针对三大牛场流产的奶牛样本，采用鹦鹉热衣原体IHA诊断试剂盒检测，PCR和RT-QPCR分别经行血液和组织的检测，结果显示A牛场(N=164) IHA检测阳性样本47例，阳性率为28.66 %，PCR检测阳性样本54例，阳性率为32.93%, RT-QPCR检测阳性样本60例，阳性率为36.59% ;B牛场(N= 115) IHA检测阳性样本26例，阳性率为22.61%, PCR检测阳性样本29例，阳性率为25.22%, RT-QPCR检测阳性样本31例，阳性率为26.96% ；C牛场(N = 97) IHA检测阳性样本17例，阳性率为
17.53%，PCR检测阳性样本21例，阳性率为21.65%，RT-QPCR检测阳性样本23例，阳性率为 23.71%。
[0011 ] 针对所有样品经行RT-QPCR、PCR与IHA方法的敏感性与特异性检测显示RT-QPCR的敏感性达到了 99.03% (102/103)，特异性为 95.60% (261/273)。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为对 样品进行敏感性检测时，LightCycler和IQ5显示良好的标准曲线，敏感性好。
[0013]表1为针对所有样品经行RT-QPCR、PCR与IHA方法的敏感性与特异性检测显示 RT-QPCR 的敏感性达到了 99.03% (102/103)，特异性为 95.60% (261/273)。
表1样品针对RT-QPCR、PCR与IHA方法的敏感性与特异性检测
【权利要求】
1.一种特异、敏感、快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR的方法，涉及的引物如下:根据GenBank中牛鹦鹉热衣原体主要外膜A蛋白ompA基因序列，利用Primer5.0软件设计引物，上游序列为5' -GGCACCATGTGGGAAGGTGCTTG-3'，下游序列为Y -GTCATTT GGAGAGGATCCTGTG-3;，针对引物之间的基因片段利用Primer Express设计 TaqMAN 探针，序列为 5 ' -GCGCAGGATACTACGGAGATTATG-3 '，5’:端标记 FAM，3’ 端标记NFQ-MGB，扩增目标片段的长度为180bp。
2.如权利要求1所述，涉及快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqManMGB探针实时荧光定量PCR的试剂盒。
3.如权利要求2所述快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqManMGB探针实时荧光定量PCR的试剂盒研发，涉及的主要 PCR 方法:Premix Ex Taq? (Probe qPCR) 10.0 μ L ；PCR ForwardPrimer (IOuM)0.8 μ L ；PCR Reverse Primer (IOuM)0.8 μ L ；Probel.0 μ L ；总 DNA2.0 μ L ；ddH205.4 μ L ;总体系 20 μ L0 反应条件为 95°C预变性 30s ；95°C 5s, 62°C 20s, 72°C 20s, 40个循环；最后37° C降温20min，至反应结束。
【文档编号】C12Q1/68GK103981252SQ201310638514
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】梁小军, 马吉锋, 王建东 申请人:宁夏农林科学院