专利名称：一种流产鹦鹉热衣原体疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗以及这种疫苗的制备方法，确切讲本发明是一种牛流产鹦鹉热衣原 体的亚单位疫苗。
背景技术：
动物衣原体病是一种慢性传染病，广泛存在于世界各地， 一般呈现地方性或局部地区流 行，虽然该病不像一类传染病那样传播迅速，但是在发病地区所造成的危害并不亚于一些烈 性病，尤其在现代集约化条件下词养的家禽和家畜。
早在二十世纪二十年代，美国人(1923)首先报道了牛地方流行性流产综合征；到1956 年，德国人采用血清学实验和细胞培养技术，证明原联邦德国奶牛流行性流产是由衣原体感 染所致。以后欧洲许多国家，加拿大、前苏联、日本、印度也相继报道牛衣原体性流产。
1978年，首次确诊国内存在山羊和绵羊衣原体性流产。1987年至1989年，农业部组织 在22个省开展羊衣原体病调査，用间接血凝试验检测山羊、绵羊血清约18万份，检出阳性 羊1.1万份，平均阳性率6.22%，调査表明各省(市)均存在该病。
中国从八十年代， 一些省区陆续报道由衣原体引起的牛地方流行性流产综合征， 一些省 区(湖南、四川等)对牛衣原体病进行调査，从调查结果看，奶牛本病的感染率高于黄牛或 水牛。1997-1998年，兰州兽医研究所用用间接血凝试验(IHAT)对采自山东、河北、河南、 陕西、宁夏、甘肃、青海和四川等8个省区的肉用牛、肉役兼用黄牛和牦牛血清检测衣原体 抗体，结果肉用牛平均阳性检出率为32.6%;肉役兼用黄牛为15.2%;牦牛为18.7%。 2001 年，兰州兽医研究所对采自广西、安徽和江苏12个县的水牛血清IHAT检测，发现各县水牛 群均程度不同的存在衣原体感染，阳性检出率最低的为3.3%,最高为39.3%。 2002-2004年， 兰州兽医研究所从10个省部分奶牛场采奶牛血清用IHA方法检测衣原体抗体，平均阳性率 为21.4%，并且从流产较为严重的陕西、宁夏奶牛场分离到鹦鹉热衣原体。
我国从八十年代开始关注和研究猪衣原体病。近些年来，从各省家畜疫病普查表明，猪 衣原体病在我国南方和北方的规模化猪场流行比较普遍，不同年龄、不同品种的猪群均可感 染本病，尤其怀孕母猪和新生仔猪更为敏感。
抗衣原体免疫疫苗可以有效预防和控制动物衣原体病，但至今尚无此类疫苗，市场急需 各种家畜通用的新型疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种供家畜用的抗衣原体病的疫苗，本发明同时提供这种疫苗用抗 原蛋白制备的方法，特别是一种可以大量工程化生产的方法。
本发明的疫苗是用流产嗜性衣原体外膜蛋白A构成的亚单位疫苗。
外膜蛋白A (OmpA)在衣原体外膜中约占60%。 OmpA是制备衣原体疫苗的最佳抗原， 因为其含有血清特异性中和抗体决定簇，在引起保护性免疫中起关键作用。OmpA含有7个 半胱氨酸残基，并且这些半胱氨酸残基在当前发现的衣原体种中是保守的，对二硫键连接 OmpA低聚物的形成起重要作用。而这些低聚物对维持衣原体外膜的完整性是必不可少的。 衣原体的OmpA、 1或2个富含半胱氨酸的大蛋白(60-kDa) (EnvBorOmp2)和1个富含半 胱氨酸的小蛋白(12-kDa) (EnvAorOmp3)细胞间广泛的交错联结的二硫键形成巨大的分子 网格决定了 EB结构的稳定性，由于EB外表面在衣原体感染附着于宿主细胞膜过程中起重要 作用，大量衣原体血清学诊断技术和疫苗的研究都聚焦在EB的外膜蛋白上。
本发明的亚单位疫苗中的流产嗜性衣原体外膜蛋白A的制备方法是以从流产嗜性衣原体提取细菌的总DNA为模板，设计两对特异性引物进行套式聚合酶链反应，扩增得到流产嗜 性衣原体外膜蛋白A的完整基因(om/W)，将该基因克隆到原核表达载体中，获得重组表达 载体；用重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒，经PCR和酶切鉴定，筛选 出阳性克隆；将此重组质粒转化至大肠杆菌中，进行诱导表达得到疫苗用抗原蛋白。
本发明的亚单位疫苗中的流产嗜性衣原体外膜蛋白A的制备方法中所用的两对引物的两 对引物是根据衣原体外膜蛋白保守区域所得，分别是
第 一对引物的上游引物为P1 5 ， -GAG GTG AGT ATG AAA AAA CTC TTG-3'， 第一对引物的下游引物为P2 5，-CAAGGTTGTAATCTCTAGGTTTCA-3'; 第二对引物的上游引物为P5: 5，-ACG GAA TTC TTG CCT GTA GGG AAC C-3， (含五coi I酶切位点)
第二对引物的下游引物为P6: 5'-TGA GTC GAC GAA TCT GAA TTG AGC ATT CAT-3'(含Sa/I酶切位点)
本发明制备出的亚单位疫苗中的流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白A还可用于制备牛流产鹦鹉 热衣原体的检测试剂。
本发明进行套式聚合酶链反应时，所用的衣原体菌株为鹦鹉热衣原体奶牛流产流产株 SX5。
本发明由于所选用的鹦鹉热衣原体奶牛流产株SX5，研究表明连续传20代，SX5株的 omp4基因没有任何的突变，同时与其他衣原体的om/"基因同源性高度一致，说明该基因在 种间比较保守，与其它株的om/W基因同源性均超过99%。鉴于owp4基因的高度保守性， 为研制家畜衣原体亚单位疫苗提供了依据。
本发明所采用的原核表达载体为pGEX-4T-l ，感受态细胞为BL21 。
经研究表明，本发明所述的重组大肠埃希氏菌的优化培养条件是在IPTG浓度为 0.1mmol/L、诱导温度为37°C、诱导时间4h， OmpA蛋白的表达量最高，培养费用低。采用 本试验确定的工程菌的优化培养条件培养适合于用发酵罐，定时、定温连续培养，可以实现 质量控制下的OmpA蛋白的规模化生产。
由于本发明所提供的是制备衣原体外膜蛋白的方法，这种蛋白的生产方法与传统的家畜 衣原体病疫苗(弱毒疫苗和灭活疫苗)用抗原蛋白的生产方式完全不同，其优点在于
1. 本发明生产的疫苗抗原是免疫基因的表达产物，而不是活的衣原体全菌体，因此在生 产过程中完全避免了人为的动毒、散毒或灭活不彻底等安全隐患。
2. 本发明生产的疫苗与传统弱毒疫苗相比，抗原成分单一，在免疫家畜体内只产生单一 的特异性抗体，因此可以用血清学方法有效地鉴别区分疫苗免疫家畜和自然感染家畜。因此 采用本发明的疫苗可克服现阶段存在的无法区分疫苗免疫抗体与野毒感染抗体的问题，为有 效防控该病，提供有力的技术支持。
3. 本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质，与其他新型疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基 因缺失疫苗)相比不会发生可能出现基因重组问题，因此本发明不存在生物安全性问题。
4. 由于完整的o附7"基因片段较大，采用通常的一次扩增可能不能获得所需要的产物， 为解决这一问题，本发明釆用套式PCR，不但保证了获得所需产物，而且还可以提高检测的 敏感性。
5. 经相关的实验研究表明，用本发明的两对引物进行PCR所获得的产物，经多次试验 表明其敏感性高，扩增出的目的基因片段浓度大，其灵敏性明显高于进行类似设计所得出的 其它引物扩增的产物。因此可以说本发明的引物有其独特的特异性。本发明的相关实验还证 明用已有文献报道的PCR方法试验，效果并不理想。6、 本发明以大肠杆菌作为目的蛋白的表达载体，培养简单，可以用发酵罐规模化生产， 可以实现质量控制，保证所生产的疫苗安全有效。
7. 用本发明的方法生产的OmpA蛋白除可以用于制备衣原体亚单位疫苗，还可以用于建 立诊断方法。
SX5株的om/"基因序列与嗜性衣原体其他分离株EBA株，BA1株，OCLH株，B11001 株，CP/12株，C18/98株进行序列比较，SX5株om/W基因核苷酸序列与GenBank中检索到 的EBA株，BA1株，OCLH株和C18/98株的同源性均为99.7%。与B11001株和CP/12株的 同源性均为99.6%。本试验所选用的流产衣原体SX5株ow/W基因没有任何突变，同时与其 它株的ow7"基因同源性高度一致，说明该基因在种间比较保守，与其它株的omp4基因同 源性均超过99%。鉴于om/^基因的高度保守性，为研制家畜衣原体亚单位疫苗提供了依据。
图1.重组质粒pGEX-4T-om^4在￡.^//81^21(0￡3)中的表达的电泳图。
图2.表达产物的Western-blot检测图
具体实施例方式
本发明的具体实施方式
说明如下，本发明使用的主要材料包括
菌株为牛流产鹦鹉热衣原体SX5株(参见"乳牛衣原体性流产的病原鉴定及免疫原性 研究"，中国兽医科学，2006.36(4):270-273。)
表达菌￡.CO//BL21(DE3)购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。 pGEX-4T-l表达载体购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。 衣原体阳性血清本实验室制备，其效价在1:1024以上。
引物所有基因扩增和改造用的引物，均由申请人设计，由商业性生物公司合成。 酶和试剂RnaseA酶、蛋白酶K、 Ex Tag预混酶、//!> /111、 Smal、 SDS、 IPTG、无水 乙醇、DL 2000 DNA Marker、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、琼脂糖、DNA回收试剂盒等购自宝 生物工程(大连)有限公司；pMD18-T克隆载体、五.co// DH5 a感受态细胞、A型质粒小型 快速提取试剂盒均购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，T4DNA连接酶、SWI、 I限制性内切酶、丙烯酰胺、双甲基丙烯酰胺、SDS (十二烷基硫酸钠)均购自promega公司； 蛋白Marker、其它常规试剂均由国内生产。 以下为本实施例的具体试验步骤
1. 从选择的流产嗜性衣原体菌株提取总DNA，本实施例中选用菌株为牛流产嗜性衣原体 SX5，从中提取细菌总DNA，以该总DNA为模板，进行套式聚合酶链反应(nested-PCR)， 所用引物对为
一扩引物对
Pl 5'-GAGGTGAGTATGAAAAAACTCTTG-3' P25, -CAA GGT TGT AAT CTC TAG GTT TCA-3'
二扩引物对
P55'-ACGGAATTCTTGCCTGTAGGGAACC隱3，(含￡co7 I酶切位点)
P65'-TGAGTCGACGAATCTGAATTGAGCATTCAT-3，(含5W/I酶切位点)
扩增片段包括om;^l基因的完整阅读框架(长度为1170bp)。
2. 目的基因的克隆
首先将nested-PCR产物与pGEX-4T-l表达载体连接，再将连接产物加入DH5 a感受态 细胞中进行转化，可获得带有目的基因的重组质粒pGEX-4T-ompA。通过PCR鉴定和酶切鉴 定予以确认。鉴定阳性质粒pGEX-4T-ompA为带有完整ow^4基因的重组质粒。测序结果表明，阳性质粒pGEX-4T-ompA含有流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白基因o/^X的完整阅读框架， 用DNAStar软件进行分析显示，与GeneBank登录的其他分离株EBA株，BA1株，OCLH株， B11001株，CP/12株，C18/98株进行序列比较，与EBA株，BA1株，OCLH株和C18/98株 的同源性均为99.7%;与B11001株和CP/12株的同源性均为99.6%。本试验所选用的流产衣 原体SX5株ow/"基因没有任何突变，同时与其它株的om^4基因同源性高度一致，说明该 基因在种间比较保守。 2.1提取质粒
用灭菌枪头在培养板上挑取单个白色菌落，接种于5mL含氨苄抗性的的LB培养液中， 220r/m， 37。C培养12-16h。按照北京博大泰克公司生产的A型质粒小型快速提取试剂盒提取 质粒，操作步骤
1) 收集1.5-3mL菌液，8000r/m离心lmin，弃去上清，加入100nL溶液l，振荡至彻底 悬浮。
2) 加入150pL溶液2，立即轻轻颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得 清亮，随后将离心管放到冰上l-2min。
3) 加入150pL溶液3，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5min后，12000r/m离心12min。
4) 将420nL结合缓冲液加入到离心吸附柱中，然后将3)中的上清倒入A型离心吸附柱 中，混匀，12000r/m离心30s，倒掉废液收集管中的废液。
5)加入75(^L浓縮漂洗液于离心吸附柱中，静置lmin后，12000r/m离心15s，倒掉废 液收集管中的废液，重复一次。倒掉废液后，再次于12000r/m离心2min，尽量除去漂洗缓 冲液。
6) 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5mL Eppendorf离心管中，加入30pL 洗脱缓冲液，室温放置2-5min后，12000r/m离心lmin。
7) 再取20pL洗脱缓冲液，室温放置l-3min后，12000r/m离心lmin，最后合为一管。 2.2重组质粒pGEM-4T-ompA的鉴定
1) 电泳鉴定
取重组质粒5pL进行琼脂糖凝胶电泳分析，同时加入空载体作为对照，挑选泳动速度较 空载体慢的质粒进行进一步鉴定。
2) 酶切鉴定
用I和￡coR I进行双酶切，反应体系为40pL:
质粒 20pL
1 2pL
10 XH buffer 4pL
双蒸去离子水 12nL
充分混匀后，37'C水浴3h。以DNA2000 Marker为标准，进行琼脂糖凝胶电泳分析酶切 结果。
3) PCR鉴定
重组质粒1:10倍稀释后，作为模板，加入表达引物进行PCR扩增。扩增后进行琼脂糖 电泳，观察目的片段的有无，以及是否符合预期大小。
4) 测序鉴定
将通过上述步骤鉴定为阳性克隆的菌种重新接种到含有氨苄抗性的LB培养液中，220r/m 培养4h，吸取ImL菌液至无菌Eppendorf管中，并加入少量甘油，封口，寄送宝生物工程(大连)有限公司测序。
3.鹦鹉热衣原体om7"基因在大肠杆菌中的表达
将测序正确的阳性菌株lOOpL接种于10mL含氨苄的LB液体培养液中，37°C， 220r/m 振荡3h后，取20pLIPTG进行诱导，分别于第2h， 3h， 4h， 5h， 6h各取100nL样。将收集 的菌液分别放入500pLEppendorf管中，12000r/m离心3min，弃去上清，将离心得到的沉淀 溶于100nL蒸馏水中，加入100pL2XSDS Buffer中，煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳，检 测表达情况。
3.1表达产物的检测
(1) SDS-PAG
1) 制胶
将电泳玻璃板清洗、干烤好后，按照操作说明固定在配胶架上，确定在两玻璃板间不漏 液体的情况下开始配胶。先配下层的分离胶，配好混匀后迅速加入两玻璃板之间，然后马上 在其上层小心加入少量去离子水封顶(此时可用手指轻轻弹击玻璃板以排除产生的气泡，并 且要尽量保证水和胶之间的界限平行于水平桌面)。静置30min，待分离胶凝固后弃去上层封 顶水，并且倒置控干残留的液体，随即配置5%的浓缩胶，配好混匀后立即加在分离胶上层， 并快速插入梳子(小心插入，以防产生气泡)，待其凝固。
2) 安装
小心移去梳子，用去离子水冲洗加样槽几次后，放入电泳槽，然后往电泳槽中加入IX Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
3) 样品的制备及上样
取适量上述全菌菌体蛋白液12000r/m离心2min，弃去上清，之后用去离子水悬浮洗涤 离心沉淀物，同样按照上述离心条件获得菌体蛋白。然后，用适量去离子水悬浮沉淀物，并 且加入等量2XSDS上样缓冲液，使二者混匀，水浴煮沸5-8min，待冷却之后，用微量加样 器上样5-10pL/孔。加样完毕后，开始电压为80V，当溴酚蓝进入分离胶之后，即可将电压调 升至120V，继续恒压电泳直至溴酚蓝到达凝胶底层。
4) 固定
电泳结束后，关闭电源，从电泳槽中小心取出凝胶板，用蒸馏水冲洗。然后用起胶板小 心取出胶片用蒸镏水冲洗，之后加入固定液，将其置于水平摇动的摇床上固定10-15min。
5) 染色
固定完毕后，将固定液倒入回收瓶中以备下次使用。然后倒入染色液，将其置于水平摇 动的摇床上染色30-60min。
6) 脱色
染色结束后，同样将染色液倒入回收瓶中以备下次使用。然后倒入脱色液，将其置于水 平摇动的摇床上脱色l-2h。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入去离子水中终止反应。
7) 结果的观察及判定
以标准蛋白分子量Marker的条带作对照，观察并判定结果。
(2) Western-blot
1) 蛋白分离
按照上述的方法进行SDS-PAGE，待电泳结束后，取下电泳板，切下分离胶置于平皿内。
2) 转印
剪10块滤纸和1块硝酸纤维素膜(NC膜)，大小与凝胶相等，置转移缓冲液中浸泡3min。 在正极板上按5层滤纸、NC膜、凝胶、5层滤纸的顺序叠放整齐，确定各层间无气泡和保证带负极的蛋白质向正极NC膜移动后，装好电泳转移装置，加入转移缓冲液，接通电源，在 160mA转移4-6h。
3) 标准蛋白Marker染色
转移完成后，取下NC膜，切取标准分子量Marker置于氨基黑染色液中浸染3min，取出 NC膜用蒸馏水漂洗至水清亮，然后弃去蒸馏水，加入氨基黑漂洗液脱色至条带清晰且蓝色背 景脱尽。晾干备用。
4) 封闭
将切取标准分子量Marker剩余的NC膜用PBS冲洗几遍，然后将其置于盛有封闭液的玻 璃平皿内，室温下轻轻振摇5h。
5) 抗原抗体反应
封闭结束后，用PBS冲洗NC膜4-5次，加入用PBST1:50倍稀释的牛衣原体阳性血清， 37'C结合1.5h，用PBST冲洗4-5次，每次在摇床慢慢摇动5min，再加入用PBST 1:500倍稀 释的兔抗牛IgG-HRP， 37'C孵育1.5h，取出用PBST冲洗4-5次，每次10min。
6) 底物显色
抗原抗体反应全部结束后，将NC膜转移到底物显色液中染色(避光)并及时观察，以 控制染色程度，防止出现非特异性条带，当特异性条带达到最佳染色程度后，立即将NC膜 转入PBST中终止反应，室温避光保存。
7) 结果观察与判定
以标准蛋白分子量Marker为参照，在预期分子量大小出呈现黑色染色条带者为阳性，无 此条带者为阴性。
3.2表达蛋白的纯化
(1) 大量诱导表达
将测序正确的阳性菌株100pL接种于10mL含氨苄的LB液体培养液中，37°C, 220r/m 振荡过夜。将6mL的菌液转入600mL含氨苄的LB液体培养液中，37'C振荡培养至OD600 值为0.4-0.6，加入600jiLIPTG诱导，继续培养4h。将菌液于4°C 6500r/m离心15min，弃上 清，收集沉淀。
(2) 包涵体的提取
1) 洗涤
将每克湿重沉淀重悬浮于4-6mL洗涤缓冲液中，12000 r/m离心30min收集沉淀，重复 洗涤3-4次，直到上清变得清亮，最后用不含尿素和Tritonx-lOO的洗涤缓冲液洗涤沉淀一次。
2) 变性和复性
将每克湿重的沉淀物溶解到lmL提取缓冲液中，室温作用使沉淀充分溶解直至液体完全 变清亮，除去不溶性杂质，分别在变性液中各加入等体积的复性液(20讓ol/LTris-Cl、2mmol/L EDTA)，加入还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使其终浓度分别达到 lmmol/L和0.1mmol/L，室温放置20h进行复性，用20mmol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液透析24h, 每6h换液一次。PEG6000浓縮复性包涵体蛋白液，过滤除菌，4'C放置待用。
(3) 电洗脱纯化
经SDS-PAGE电泳观察，在洗涤后的沉淀中目的蛋白的含量最高。进行SDS-PAGE电泳。 待电泳进行完毕后，纵切下一小条凝胶进行常规染色及脱色，与剩余未染色的凝胶进行比对， 判断目的条带的位置，切下目的条带。将切下的目的条带放入透析袋中，按1:1比例加入蛋 白电泳缓冲液，封好透析袋，将其放于水平电泳槽的中间隔档上，使电泳槽中的电泳液刚好 没过透析袋。80V电泳6h，透析袋中的液体即为纯化的表达蛋白。将纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定后取样测定蛋白浓度。
(4)免疫初步试验衣原体抗体阴性16-18g昆明系小鼠15只，由本所实验动物场提供，
分为3组，每组5只，I和II组为免疫组，III组为对照组不免疫。纯化的OmpA蛋白浓度调 整为O.lmg/mL, I和II组小鼠分别按0.2mL /只和0.4mL /只接种，免疫后2周，用衣原体强毒 株SX5按每只小鼠0.2mL (含菌量0.5x109 ELDso)腹腔攻击。 5结果
5.1表达产物的检测结果
(1) 表达产物的SDS-PAGE分析
SDS-PAGE分析结果表明，经O.lmmol/L的IPTG诱导的基因工程菌获得表达，产生约 68ku的特异性蛋白条带，与预测的分子质量相符。按l^接种诱导表达4h的表达量最高。结 果见图1。
图1中1为蛋白质分子质量标准；2为pGEX-4T-ompA对照；3-7为pGEX-4T-ompA经 IPTG分别诱导2， 3， 4， 5， 6h的表达产物
(2) 表达产物的Western-blot分析
表达产物经SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上，进行免疫学反应，结果显示，表达的融 合蛋白能够被牛阳性血清所识别，具有良好的反应原性，结果见图2。 图2中1为蛋白质分子质量标准；2为诱导的表达产物
(3) 蛋白浓度的测定 利用紫外分光光度计测定的纯化后蛋白的浓度为0.26mg/mL。 5.2 OmpA蛋白小鼠免疫试验
为了解疫苗的免疫效果多采用模型动物实验，本发明中，因用本动物怀孕母牛效检费用 太高， 一般情况下不采用，本发明采用小鼠为动物模型，关于小鼠做为衣原体疫苗的效检实 验动物模型可参见"乳牛衣原体灭活疫苗效检小鼠模型的建立"[《中国兽医科学》2008，
38(2):120-122]—文。
试验结果见表l。
表1. OmpA蛋白免疫小鼠的攻毒试验结果
组别小鼠数免疫剂量〖(ml/只)攻毒剂量(ml/只)攻毒途径发病死亡小鼠保护率
I 50.20.2腹腔32/5
II 50.40.2腹腔14/5
III 500.2腹腔50/5
从表1可以看出，采用本发明复性纯化的OmpA蛋白免疫小鼠可以产生较好的保护力。序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所 <120〉 一种流产鹦鹉热衣原体疫苗及制备方法 <160> 4
<210> 1 <211> 24 <212> DNA
<213>第一对引物的上游引物 <400>
gaggtgagta tgaaaaaact cttg 24
<210> 2 <211> 24 <212> DNA
<213>第一对引物的下游引物 <400>
caaggttgta atctctaggt ttca 24
<210> 3 <211> 25 <212〉 DNA
<213>第二对引物的上游引物 <400>
acggaattct tgcctgtagg gaacc 25
<210〉 4 <211> 30 <212> DNA
<213>第二对引物的下游引物 <400〉
tgagtcgacg aatctgaatt gagcattcat 30
权利要求
1、一种由流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白A构成的亚单位疫苗。
2、 权利要求1所述亚单位疫苗中的流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白A的制备方 法，其特征是以从流产鹦鹉热衣原体提取细菌的总DNA为模板，设计两对特异 性引物进行套式聚合酶链反应，扩增得到流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白A的完整 基因(om/")，将该基因克隆到原核表达载体中，获得重组表达载体；用重组表 达载体转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒，经PCR和酶切鉴定，筛选出 阳性克隆；将此重组质粒转化至大肠杆菌中，进行诱导表达得到疫苗用抗原蛋 白。
3、 根据权利要求2所述的亚单位疫苗中的流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白A的 制备方法，其特征是所用的两对引物分别是:第一对弓l物的上游弓l物为PI 5，-GAGGTGAGTATGAAAAAACTCTTG-3，， 第一对弓l物的下访,弓l物为P25，-CAAGGTTGTAATCTCTAGGTTTCA-3，；第二对引物的上^f引物为P5: 5'國ACGGAATTCTTGCCTGTAGGGAACC-3'(含五coi I酶切位点)第二对引物的下游引物为P6: 5'-TGA GTC GAC GAA TCT GAA TTG AGC ATT CAT-3，(含Sa/I酶切位点)。
4、 权利要求2或3所述的亚单位疫苗中的流产鹦鹉热衣原体外膜蛋白A 的制备方法制备的流产嗜性衣原体外膜蛋白A用于制备牛流产嗜性衣原体的检
全文摘要
本发明涉及一种牛流产鹦鹉热衣原体的亚单位疫苗及这种疫苗的制备方法。本发明的疫苗是用流产嗜性衣原体外膜蛋白A(OmpA)构成的亚单位疫苗；其制备方法是以从流产嗜性衣原体提取细菌的总DNA为模板，设计两对特异性引物进行套式聚合酶链反应，扩增得到流产嗜性衣原体外膜蛋白A的完整基因(ompA)，将该基因克隆到原核表达载体中，获得重组表达载体；用重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，提取重组质粒，经PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆；将此重组质粒转化至大肠杆菌中，进行诱导表达得到疫苗用抗原蛋白。
文档编号A61K39/118GK101579521SQ20091020302
公开日2009年11月18日 申请日期2009年5月13日 优先权日2009年5月13日
发明者周继章, 宋竹青, 宫晓炜, 曹小安, 蔺国珍, 邱昌庆, 郑福英 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所