专利名称：一种检测流产鹦鹉热衣原体的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种检测微生物的试剂盒，特别是一种对猪、羊和牛进行流产鹦鹉热衣原体检测的试剂盒以及其制备和使用方法。
背景技术：
衣原体(Chiamydiaceae)是一类介于细菌和病毒之间专性细胞内寄生的革兰氏阴性微生物,大小为0.2 0.4 iim。鹦鹉热衣原体(C. psittaci)作为衣原体属中十分重要的一个种，是动物衣原体病的主要致病菌，具有广泛的宿主，家畜中以牛、羊、猪较为易感。可造成由胎儿夭折、产奶量大幅减少以及饲料、人力浪费而引起的巨大经济损失，给养殖业造成了重大危害。此外，流产鹦鹉热衣原体还可以感染人，威胁人类健康。动物衣原体病的研究始于19世纪末，Marange (1892)在阿根廷首都布宜诺斯艾利斯发现，与鹦鹉鸟接触的人会突然发病，从而最终肯定了鹦鹉鸟在人类感染和罹病中的重要作用，并提出了鹦鹉热(Psittacosis)这一新病名。目前本病已遍及世界大多数国家和地区。衣原体可以引起哺乳动物的流产、肺炎、肠炎、脑脊髓炎、多浆膜炎、多关节炎、角膜结膜炎、尿道炎及鸡的输卵管炎等。根据对北京市郊区畜禽流行病学调查发现，一些养殖场都不同程度查出了衣原体病原，引起了种猪鹦鹉热衣原体性流产和肺炎，甚至在进口的种山羊中也存在鹦鹉热衣原体。2001年，兰州兽医研究所对采自广西、安徽和江苏12个县的343份水牛血清IHAT检测，发现各县水牛群均不同程度存在衣原体感染，阳性检出率最低为3. 3%，最高为39. 3%。由于动物衣原体病感染初期多表现不明显，和其他许多病症有相似性，因此易于混淆。目前我国对动物衣原体病的检测方法主要应用生物培养和血清学试验(《畜禽衣原体病及其防治》，邱昌庆主编)。生物培养虽然准确可靠，但耗时长，操作复杂，无法进行大规模检测；血清学方法中IHA和免疫层析试纸法虽然简便易操作，但和ELISA检测方法一样都无法分辨动物衣原体自然感染还是免疫状态，还存在着一定的交叉反应和人为误差隐患，此外，ELISA检测还需要酶标仪等专门的仪器。这些都给临床检疫带来了极大困难。碘和Giemsa染色法也是本病检测常用的方法之一，参见《畜禽衣原体病及其防治》(邱昌庆主编)，但这种方法不适合直接用于临床样本的检测。随着分子生物学的发展，普通PCR方法(周继章等，2007)因其敏感、快速、无需活菌操作等优点，已经大量用于本病原检测，但需要专门的仪器、操作繁琐，不适合临床及基层生产使用。依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)虽然更加简便、快速、特异，并已用于多种病毒的检测，但应用NASBA在对一些病原的检测中存在灵敏度不够和假阳性等问题(高闪电等，2009)。因此，随着鹦鹉热衣原体引起的人畜共患病日趋严重，建立高效、快速、准确并适合基层生产的牛、羊、猪等流产鹦鹉热衣原体检测方法越来越迫切。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足，便于在基层应用，检测耗时短，成本低，操作简单方便的检测牛、羊、猪流产鹦鹉热衣原体的试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。本发明的检测流产鹦鹉热衣原体的试剂盒中包括有由外引物和内弓丨物组成的两对特异性引物，其中上游外引物F3的序列为SEQ ID Nsl ;下游外引物B3的序列为SEQ IDNa 2 ;上游内引物FIP的序列为SEQ ID Ns 3 ;下游内引物BIP的序列为SEQ ID Ns 4。为方便使用，试剂盒中还可放置甜菜碱、硫酸镁、dNTPs、ThermoPol反应缓冲液和Bst DNA聚合酶；或者还加有显色剂SYBR GREEN I。本发明的检测流产鹦鹉热衣原体的试剂盒的使用方法是a.用试剂盒中的两对特异引物配制成LAMP反应液； b.从被检样品中提取DNA;c.以DNA为模板与LAMP反应液配制成LAMP反应混合物；d.在LAMP反应混合物加入Bst DNA聚合酶进行LAMP反应；e. LAMP反应终止后进行琼脂糖电泳，根据反应产物电泳后能否呈现清晰的梯度条带判定被检样品的阳性和阴性；或者加入显色剂SYBR GREEN I直接肉眼观察，若反应液呈 现绿色，可判定样品中含有流产鹦鹉热衣原体；若反应液呈现橙色，则判定样品中不含流产鹦鹉热衣原体。对本发明中试剂盒的敏感性和特异性进行了验证。琼脂糖电泳结果表明，试剂盒检测C. psittaci的敏感性与常规套式PCR方法相同，检测限度均为4个拷贝；试剂盒特异性高，而且使用本发明的检测试剂盒检测时对沙眼衣原体、肺炎衣原体、布氏杆菌、大肠杆菌、霍乱弧菌和产气荚膜梭菌的检测结果均为阴性，不会因这些微生物的存在而影响检测的结果。由上述内容可知，本发明是利用环介导等温核酸扩增技术检测流产鹦鹉热衣原体感染，其优点是(I)本发明中的试剂盒具有高敏感性；(2)本发明中的试剂盒具有高特异性；(3)不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，只需要简单的恒温装置，如水浴锅等即可；(4)与耗时2-5h的常规PCR相比，反应时间大大缩短，一般只需要1-2小时；(5)其检测结果可根据反应液的颜色变化肉眼判定结果，简单方便；(6)可在小型实验室和基层养殖场作快速诊断用；(7)本发明可适用于对猪、羊和牛进行检测。
图I是使用显色剂进行结果判定。从左向右依次为阳性对照、阳性样品、阴性对照和空白对照管。图2是试剂盒与套式PCR方法运用琼脂糖电泳检测C. psittaci的敏感性对比结果。泳道M是DL2000Marker ;泳道P是阳性对照；泳道N是阴性对照；泳道1_9 (A)是用试剂盒分别检测 4X107，4X106，4X105，4X104，4X103，400，40，4，0. 4 个拷贝的 C. psittaciSX5株DNA模板的电泳结果，该方法可检测到4个拷贝的DNA模板；泳道1_9 (B)是用套式 0 方法分别检测4\107，4\106，4\105，4\104，4父103，400，40，4，0.4个拷贝 C. psittaciSX5株DNA模板的电泳结果，该方法也可检测到4个拷贝的DNA模板。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明不局限于实施例的内容。(一)检测样品的准备流产鹦鹉热衣原体的C. psittaci疫苗株D13，A和SX5分别从有流产症状的猪、羊和牛分离到，并经中国农业科学院兰州兽医研究所农业部兽医公共卫生重点开放实验室分离鉴定和保存；含有SX5株MOMP基因的质粒pMD-MOMP由本实验室构建；含有肺炎衣原体(C. pneumoniae)MOMP基因的质粒Cpn0695_pGEX_6p由美国德州大学健康科学中心免疫和微生物系钟光明教授惠赠；沙眼衣原体、布氏杆菌、大肠杆菌、霍乱弧菌和产气荚膜梭菌菌株由本实验室保存。( 二 )建立检测流产鹦鹉热衣原体的LAMP试剂盒，这一试剂盒可检测50份样品。I、提供两对特异引物F3、B3、FIP和BIP。其中F3为上游外引物，B3为下游外引物，FIP为上游内引物，BIP为下游内引物。引物序列如下 上游外引物F3 :5 ’ -ACCTCTAACAGCTGGTACTG-3 ’下游外引物B3 :5 ’ -TGGGTTCCATGTGGTCAAG-3 ’上游内引物FIP:5， -GAGAGCGCTAAACCAACTTGCCAACTGACACTAAGTCGGCT-3，下游内引物BIP:5， -GGCATAAACTGGTCACGAGCAATTTAGGTTGAGCGATGCGG-3，2、试剂盒中还包括如下试剂(I) 50支0. 5ml的离心管,每支离心管中装有22 U I的LAMP反应液。LAMP反应液包括 0. 2uM F3 和 B3，I. 6 ii M FIP 和 BIP，IM 甜菜碱，4mM 硫酸镁，I. OmMdNTPs, IX ThermoPolreaction buffer。以上各成分的浓度均为在反应液中的终浓度。LAMP反应液的具体配制
方法如下
5pM的引物F3/B3各Ipl 20pM 的引物 FIP/BIP各 2(^1 25mM 的 dNTPs10 5M的甜菜碱5jJ
IOOmM的硫酸续IjoJ IOx ThermoPol reaction buffer 2.5(0,1
双蒸水6.50总计220(2) 50 U I (400units) Bst DNA 聚合酶(New England Biolabs, USA)。(3)显色剂125u I 10%的荧光染料 SYBR GREEN I。(三)LAMP检测方法本发明所建立的检测流产鹦鹉热衣原体的试剂盒的使用方法如下I、衣原体DNA的提取用QIAamp DNA提取试剂盒从流产鹦鹉热衣原体参考株和病料中提取总DNA，提取方法按说明书进行。也可采用其他厂家的商品化试剂盒提取DNA。2、LAMP反应体系
LAMP 反应液22i-il 模板 DNA2jal 5对 DNA 聚合酶Ijil (8 units) 总计2503、LAMP反应程序 先将22 ill的LAMP反应液和2 U I的模板DNA混合，在94 °C反应5min，然后在冰上急冷，再加入Iu I的Bst DNA聚合酶，在62°C恒温反应lh，然后将温度升至80°C维持2min终止反应。4、LAMP反应结果判定将2. 5iU显色剂加入反应体系中，若反应液呈现绿色，可判定样品中含有流产鹦鹉热衣原体；若反应液呈现橙色，则判定样品中不含流产鹦鹉热衣原体；具体如图1，从左向右依次为阳性对照、阳性样品、阴性对照和空白对照管。另外，取2iU反应液在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在全自动凝胶成像分析仪内观察电泳结果，若反应产物电泳后呈现清晰的梯度条带判为阳性，否则判为阴性；具体如图2，A中1-8泳道均为阳性，9为阴性，P和N则分别为阳性对照和阴性对照。对本发明中试剂盒的敏感性与检测流产C. psittaci的常规套式PCR方法进行了比较。套式PCR方法第一轮扩增所用的引物是ompAl (5' GAG GTG AGTATG AAA AAA CTCTTG 3' )and ompA2 (5' CAA GGT TGT AAT CTC TAGGTT TCA 3')，扩增程序为94°C预变性 5min，接着进行 35 个循环(94°C 30s, 52°C lmin, 72°C 2min)，最后 72°C延伸 5min。第二轮扩增所用的引物是 ompASb' TAT GAA MA ACT CTT GAA ATC GGC 3' )and ompA4(5/ GATAGC GGGACA AAA AGT TAG GAT 3')，扩增程序包括 20 个循环(94 °C 30s，50°C lmin,72°C 1.5min)。所用的模板是系列稀释的 C. psittaci SX5 株 DNA，4X 107，4X 106，4X 105，4X IO4,4X 103，400，40，4，0. 4个拷贝，共9个梯度。用本发明中的试剂盒对这些不同拷贝数的模板分别进行检测，同时也用套式PCR方法进行检测，比较两种方法的敏感性。结果表明，本发明中的试剂盒与套式PCR方法均可检测到4个拷贝的DNA模板，说明试剂盒与套式PCR具有相同的敏感性(如图2所示)。试剂盒检测结果表明，C. psittaci疫苗株D13，A和SX5和含有SX5株MOMP基因的质粒pMD-MOMP均为阳性；含有肺炎衣原体(C. pneumoniae) MOMP基因的质粒Cpn0695-pGEX-6、沙眼衣原体、布氏杆菌、大肠杆菌、霍乱弧菌和产气荚膜梭菌均为阴性，说明本试剂盒能特征性的检测出C. psittaci流产株,具有高特异性。
权利要求
1.一种检测流产鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有由外引物和内引物组成的两对特异性引物，其中上游外引物F3的序列为SEQ ID Na I ;下游外引物B3的序列为SEQ ID Ns 2 ;上游内引物FIP的序列为SEQ ID Ns 3 ;下游内引物BIP的序列为SEQID Ns 4。
2.权利要求I所的检测流产鹦鹉热衣原体的试剂盒的使用方法，其特征是 a.用试剂盒中的两对特异引物配制成LAMP反应液； b.从被检样品中提取DNA; c.以DNA为模板与LAMP反应液配制成LAMP反应混合物； d.在LAMP反应混合物加入BstDNA聚合酶进行LAMP反应； e.LAMP反应终止后进行琼脂糖电泳，根据反应产物电泳后能否呈现清晰的梯度条带判定被检样品为阳性或阴性，或者在LAMP反应产物中加入显色剂后直接肉眼观察，根据样品是否变色判定被测样品为阳性或阴性。
全文摘要
本发明涉及一种检测微生物的试剂盒，特别是一种对猪、羊和牛进行流产鹦鹉热衣原体检测的试剂盒以及其制备和使用方法。本发明的检测流产鹦鹉热衣原体的试剂盒中包括有由外引物和内引物组成的两对特异性引物，其中上游外引物F3的序列为SEQ ID №1；下游外引物B3的序列为SEQ ID №2；上游内引物FIP的序列为SEQ ID №3；下游内引物BIP的序列为SEQ ID №4。本发明中的试剂盒具有高敏感性和高特异性，测试方法简单方便，并可适用于对猪、羊和牛进行检测。
文档编号C12Q1/04GK102787162SQ20111014318
公开日2012年11月21日 申请日期2011年5月20日 优先权日2011年5月20日
发明者周继章, 宫晓炜, 曹小安, 蔺国珍, 邱昌庆, 郑福英 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所