包含鹦鹉热衣原体的猫疫苗及其制备方法

专利名称：包含鹦鹉热衣原体的猫疫苗及其制备方法
背景技术：
猫衣原体病是一种常见的被称为猫肺炎(FPn)的猫结膜和呼吸系统疾病。这种高度接触传染的疾病的特征在于打喷嚏和咳嗽，并伴有眼部的脓性粘液分泌和鼻涕。所有年龄组的猫均易感。尽管死亡率不高，但被感染的小猫和老猫均严重衰弱。猫衣原体病因其强传染性而一直是宠物医院、诊所和catteries所遇到的主要问题。一些观点认为鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)持续感染生殖道是catteries不育的原因之一。
用经修饰的鹦鹉热衣原体活组合物所作的疫苗研究产生了有争议的结果。Cello(《美国兽医医学联合会杂志》158卷，932-938页，1971)指出，这种疫苗经证实对猫并无明显保护作用。Shewen等人(《加拿大兽医研究汇编杂志》44卷，244-251页，1980)指出有部分保护作用，而Mckercher(《美国兽医研究杂志》13卷557-561页，1952)及其他人则指出有几乎完全的保护作用。不过，由于被免疫猫接受的均是活的鹦鹉热衣原体，其中有些疫苗衣原体可被排出至其他猫体内，故预计会有回复突变现象的发生。
灭活的衣原体疫苗研究产生了混乱的结果，在被免疫接种的猫体内有难以接受的局部和全身反应。用4种灭活疫苗制品和1种商品化的经修饰的活疫苗所做的对比攻击研究证实，灭活制品对猫的衣原体感染实质上不提供任何保护作用。(Shewen等人，《加拿大医学汇编杂志》44卷244-251页，1980)。Chu等人描述了一种灭活的鹦鹉热衣原体疫苗(美国专利号5,242,686)，但这种疫苗未经纯化，施用于猫时产生不能接受的局部反应(COMPENDIUM)。
已知经修饰的活衣原体疫苗可被排至其他动物，可与野生型鹦鹉热衣原体重组而回复毒力，目前上市的灭活衣原体疫苗既无效又会导致不能接受的局部反应，因而需要一种有效，无不良反应的衣原体疫苗。本发明的目的就是提供灭活的猫衣原体疫苗组合物，它有较强的免疫原性但抗原的量不高。本发明的另一目的是提供产生适当纯化的鹦鹉热衣原体以生产单价制品形式或与其它猫抗原组合形式的无反应性的有效疫苗的简单方法。
本发明公开了一种灭活的，免疫原性有效的鹦鹉热衣原体，它以极少的量掺入衣原体疫苗(低抗原负荷或低抗原量)，它纯化自其生长的细胞，当做成疫苗后用于猫时是非反应性的但很有效。在这种疫苗中，免疫原性有效的，弱抗原性的，纯化的鹦鹉热衣原体将与有效量的佐剂及其药物可接受的载体或稀释剂混合。鹦鹉热衣原体生产的纯化过程涉及好几个步骤，其中包括使用卵黄囊膜组织，洗净卵黄物质，接种至诸如Buffalo绿猴(BGM)细胞系(ATCC No._)一类的哺乳动物细胞系中，在衣原体对细胞的破坏(致细胞病变效应或CPE)完成后，从疫苗制品中去除细胞及其碎片，然后灭活之。本发明的主要要求之一是，用于生产鹦鹉热衣原体的细胞系应在用鹦鹉热衣原体感染后的7天内被破坏(证实衣原体感染的7天内CPE至少为80％)。
附图简述

图1是临床评分的分组总结图(平均分/天将进一步报道在表1中，它显示当用在疫苗中时，微量的鹦鹉热衣原体(少于50μg/剂)产生的保护作用与用大量的鹦鹉热衣原体(50-1000μg/ml，如Chu等人所述一样。)发明详述本发明提供了一种疫苗组合物，它包含与有效量的佐剂混合的微量纯化的，灭活的，有效致免疫量的鹦鹉热衣原体；以及药物可接受的载体或其稀释剂，所述疫苗组合物可与其它猫抗原联合使用。该疫苗组合物施用于猫时无反应性但很有效。
如本文所用，术语“有效致免疫量”指疫苗中鹦鹉热衣原体能保护猫在接种后不受鹦鹉热衣原体感染，术语“微量”指加入疫苗中的鹦鹉热衣原体的量少于50μg/剂。术语“纯化的”指消除最终疫苗中卵黄物质的存在的过程。这些过程包括但不局限于将已用盐水洗净卵黄物质，研碎并重新悬浮于磷酸盐缓冲液后的卵黄囊膜接种于组织培养，使用被鹦鹉热衣原体破坏的细胞系，去除细胞及其碎片，再灭活鹦鹉热衣原体。
本发明还包括一种制备抗衣原体感染的疫苗组合物的方法，所述方法包括在卵黄囊中培养鹦鹉热衣原体，从上述卵黄囊中收获卵黄囊膜并冷冻作为主导种，将该主导种或其传代物接种至贴壁生长的高度易感的细胞系中，直至至少80％的细胞被鹦鹉热衣原体破坏，收获被破坏的易感细胞系和含有鹦鹉热衣原体以及所述细胞系的培养基，从鹦鹉热衣原体中去除被破坏的细胞系，灭活鹦鹉热衣原体，将灭活的鹦鹉热衣原体与佐剂及生理可接受的载体混合。
鹦鹉热衣原体的发育周期有着完全不同的繁殖形式(始体)和传染形式(原体)。当用最常用于培养衣原体的细胞系(如狗肾细胞，McCoy细胞和CRFK细胞)培养鹦鹉热衣原体时，该衣原体并不在单层细胞上产生完全的致细胞病变效应。这使得生产过程中的最佳收获时间难以确定。此外还产生低免疫原性衣原体，因此需重复多次从细胞中收获或收获后高度浓缩。在一些情况下(如美国专利号5,242,686所述)衣原体需在传代培养物中灭活。这些过程产生的疫苗有较高的抗原负荷(高抗原量含有50-1000μg/剂)并在接种后使猫发生不良反应。象Buffalo绿猴细胞系这类对鹦鹉热衣原体高度易感的细胞被感染时，当培养中感染性衣原体数量很多时，将导致单层细胞被彻底破坏。此时经过滤，离心或超滤就能轻易地从细胞及其碎片中纯化这些衣原体，所收获的微量纯化鹦鹉热衣原体(＜50μg/剂)当配入含有佐剂及药物可接受载体的疫苗中时具有有效的免疫原性。
根据本发明，某种象鹦鹉热衣原体Cello株这样的衣原体分离物最初是在受精的鸡蛋的卵黄囊膜上繁殖。该鹦鹉热衣原体分离物被接种至受精鸡卵的卵黄囊中37℃孵育5-10天。从第5天开始每天用烛光检查鸡蛋的存活情况。当25％的鸡蛋死亡的这一天，收获仍然存活的鸡蛋的卵黄囊，用磷酸缓冲盐水洗去多余的卵黄蛋白并无菌搅拌，将搅拌混合过的膜重新悬浮于磷酸缓冲盐水，分成1ml/份的等份试样冻存于-70℃作为种子材料。用同样的程序将该种子传代5代以上，以制备可用于接种组织培养细胞的生产种子。
制备鹦鹉热衣原体疫苗抗原首先要制备组织细胞培养物。在Dulbecco′s MEM培养基中培养，Buffalo绿猴细胞，该培养基含有高葡萄糖(DMEM/H)，5％胎牛血清，10mM HERPES缓冲液及新霉素。当出现细胞融合时用加新霉素的DMEM/H中的鹦鹉热衣原体感染细胞。用小体积的培养基就可使鹦鹉热衣原体吸附至细胞上，再加入更多的DMEM/H培养基。37℃将被感染的细胞孵育5-7天。一般而言，感染后第6天90-100％的单层细胞被破坏。此时旋转容器去除任何残留的细胞就可收获鹦鹉热衣原体(收获液体)。用5μ孔径的滤膜或经离心可将细胞及其碎片从收获液中去除。然后这种纯化的收获液被灭活。灭活试剂包括，但不限于二乙烯亚胺，福尔马林，硫柳汞和β丙烯内酯。将pH调至中性，用磷酸缓冲盐水将纯化的收获液稀释至某一致免疫有效量以便与佐剂配制。鹦鹉热衣原体的致免疫有效量通常低于50μg/剂，优选低于10μg/剂，任一种佐剂均可应用，本发明中所用佐剂的非限制性例子是聚合物和共聚物，丙烯酸聚合物和共聚物，聚丙烯酸如Carbopol，表面活性剂如十六烷基胺，皂苷，QuilA，氢氧化铝，磷酸铝，多肽如胞壁酰二肽，油乳剂，免疫调节物如白细胞介素和干扰素，干扰素诱生剂，乙烯顺丁烯二酸酐共聚物如EMA-31,NEOCRYLA640和POLYGEN(由MVP实验室提供)。也可使用上述佐剂或佐剂系统的任意混合。
已发现上述佐剂在总疫苗剂量中的有效作用量介于0.01％和50％体积比(v/v)之间。优选将佐剂浓度调至1％-15％。更优选，所用POLYGEN浓度为1％-5％，所用Carbopol浓度为0.1％-0.5％。
本发明的疫苗组合物还包括一种药物可接受的载体或稀释剂，并可包含其它猫抗原，如猫鼻气管炎抗原，猫白血病抗原，猫萼状病毒抗原以及猫总白细胞减少症抗原，猫免疫缺陷病毒抗原，猫传染性腹膜炎抗原，兔弓形虫(Toxoplasma gondii)抗原和狂犬病抗原。表1临床评分值分组总结-平均分/天
表2五方猫疫苗的效应检验结果，这种五方猫疫苗含有猫鹦鹉热衣原体，猫鼻气管炎，猫白血病，猫萼状病毒和猫总白细胞减少病毒
表2(续)
C.M.=累计均值AV.M.S.=一般均值“T”=疫苗组与对照组临床值比较的统计计算(单侧，MannWhitney对Wilcoxon′s的两样本检验法的修改方法)由9 CFR 115.130,113.149,113.131,115.150,SAM 310和SAM 311限定。T≥31就认为有保护。
表2证实，根据本发明制备的多组分疫苗是有效的，所述疫苗含有灭活的猫鼻气管炎抗原，猫萼状病毒，猫总白细胞减少病毒，猫白血病病毒和猫鹦鹉热衣原体。
作为本发明的其它实施方案，疫苗组合物可以缓释产品形式给药，如配制成乳化物-乙二醇化物共聚物，缓释微粒和植入形式。
本发明还提供一种防止衣原体在猫群中传染的方法，它包括给猫施用致免疫有效量的上述疫苗组合物。本发明的给药途径是不经肠道的(皮下，肌内，腹膜内和皮内)或口服/鼻服。优选的给药途径是皮下和肌内。已发现一种有效的处理方案，即至少给予两次疫苗组合物，且每次给药的间隔约为2-4周，优选地为约14-30天。
以下实施例只为说明本发明，并非限制本发明的范围。
实施例实施例1单价的猫鹦鹉热衣原体取冻存的Buffalo绿猴细胞解冻，加入含DMEM/H,5％胎牛血清，10mM HERPES缓冲液和30μg/ml新霉素的培养基中，400-600xg离心10-15分钟。用新鲜培养基悬浮离心过的细胞并移入摇瓶。37℃摇瓶培养至细胞生长而融合。将细胞传代直至获得生产所需的摇瓶数。通常为50-500摇瓶数不等。待传代摇瓶中的BGM细胞长到3-5天且至少有95％融合时，去除生长培养基，以0.01至0.1的感染复数(MOI)加入鹦鹉热衣原体种。用于衣原体生长的培养基为DMEM/H加30μg/ml新霉素。将摇瓶再置36-38℃温育1小时使衣原体被细胞吸附，然后每瓶另加入200ml培养基。继续在36-38℃温育5-7天或直至CPE＞80％。振荡摇瓶使任何残留的细胞离壁就收获到摇瓶液，将摇瓶液转至另一容器。经5微米聚丙烯滤膜过滤去除细胞碎片就得到澄清的(纯化的)收获液。将其用0.01M二乙烯亚胺(BEI)于2-8℃处理72小时灭活，然后用硫代硫酸钠中和BEI至终浓度0.02M。
纯化，灭活的鹦鹉热衣原体被稀释至三个不同的抗原水平(三种不同的抗原量)。所检测的最高抗原量为100μl/剂相当于约100μg/剂，中等抗原量为50μl/剂约等同于50μg/剂而最小抗原量为25μl/剂或约25μg/剂。所有抗原量均用磷酸缓冲盐水稀释至每份制剂0.95ml。再在每份制剂中加入0.05ml POLYGEN作佐剂以制备最终的疫苗。将1ml剂量这样的疫苗施用于每5只一组的血清阴性猫体内，每次给药间隔3周。第1剂量在第0天时给，第二剂量给于第21天。另有一组5只年龄和环境相当的血清阴性猫，不施用疫苗而作为无疫苗对照组。所有猫在第2剂量的加强注射之后2-8周时用毒性鹦鹉热衣原体经鼻内和经口内攻击。对所有猫连续28天每天监控鹦鹉热衣原体病的临床征兆，包括体温，眼分泌物，结膜炎，鼻渗出物，喷嚏，咳嗽，呼吸困难，厌食，脱水和抑郁。数据的分析采用一种加权计分系统。病兆越严重给的数值越高。所有数据每4天作一次统计分析并列于表1，图示于图1。
表1和图1所列结果清楚地证实，根据本发明制备的鹦鹉热衣原体即使抗原量少至25μg/剂也有效。既然如此低含量抗原疫苗提供的保护作用等同于高抗原含量疫苗，可以预期按本发明的方法制备低于25μg/剂水平的疫苗时也有保护作用。实施例2将根据本发明实施例1制备的灭活猫鹦鹉热衣原体与其他4种灭活猫抗原混合以制备多组分疫苗。将以POLYGEN为佐剂的35μl鹦鹉热衣原体(106.0TCID50/ml)与以下成分混合猫白血病抗原，抗原剂量相当于1.25 ELISA相对效力单位/剂，POLYGEN为佐剂；猫鼻气管炎抗原，108.0TCID50/剂，POLYGEN为佐剂；猫萼状病毒，107.8TCID50/剂，POLYGEN为佐剂；猫总白细胞减少病毒，105.9TCID50/剂，POLYGEN为佐剂。对该五方疫苗的预防接种/攻击效应检验在猫群中进行。试验开始时，对所有猫抽取血清和全血样本。血清用于筛查猫鼻气管炎，猫萼状病毒和猫总白细胞减少病毒的抗体滴度。所有猫对这些病毒的抗体滴度最初均低于1∶2。用于FeL V试验程序的猫对p27抗原呈阴性反应。13-15周龄的5组猫群(n为74)，均接种1.0ml五方疫苗并在3周后加强接种一次，约1/2的猫皮下接种而另1/2肌内接种。
评价8只被接种猫(4只皮下和4只肌内)及一只对照猫在接种和加强注射后对猫总白细胞减少病毒的血清学应答。1∶8的血清学应答被认为是对该组分有保护作用。接种后的结果列于表2。
12只五方疫苗接种猫(6只皮下，6只肌内)和4只未接种对照猫用毒性猫鼻气管炎病毒攻击。攻击前已取咽拭子和血样，攻击后监测所有猫的病兆。记录临床病兆和体温并以均分值分析，结果列于表2。对接种组和对照组的临床分值的显著性差异统计分析证实疫苗有效。
12只五方疫苗接种猫(6只皮下，6只肌内)和4只对照猫用毒性猫萼状病毒攻击。攻击前已取咽拭子和血样，另监测猫的体温和临床病兆。记录临床征兆，打分并分析，结果列于表2。对接种组和对照组之间临床分值的显著性差异统计分析证实了疫苗的效力。
20只五方疫苗接种猫(10只皮下，10只肌内)和10只对照猫以毒性猫鹦鹉热衣原体攻击。按实施例1所述对其临床病兆监测并打分。接种组和对照组平均分之间的显著性差异统计分析证实了疫苗的此项效力。该攻击试验的结果简要示于表2。
22只五方疫苗接种猫(11只皮下，11只肌内)和9只对照猫以毒性FeL V攻击。此攻击要求猫首先应连续2天接受免疫抑制处理和攻击处理。攻击后从第3周至第12周检查猫的病毒血症，方法是用间接免疫荧光试验(IFA)查血中p27抗原。按Shibley等人(JAVMA 1991年199卷1402-1406页)所述测保护作用，结果示于表2。
从表2可明显看出该多组分疫苗的所有五种组分，包括本发明的猫鹦鹉热衣原体组分均有功效。还应注意到对鹦鹉热衣原体疫苗或含有鹦鹉热衣原体的多组分疫苗所做的此研究或其他研究中，无任一疫苗被证实有局部或全身性不良反应。低抗原含量的鹦鹉热衣原体是无不良反应性的主要原因。
尽管本发明描述了上述特定实施方案，但也应认识到关于本发明还可做各种修饰和变化，这对于本领域的技术人员是显而易见的，而且这些修饰和变化也包括在如下列权利要求书所限定的本发明的范围之内。
权利要求
1．一种灭活的，致免疫有效且无不良反应的鹦鹉热衣原体疫苗，所述疫苗含微量鹦鹉热衣原体。
2．根据权利要求1的灭活的，致免疫有效且无不良反应的鹦鹉热衣原体疫苗，其中鹦鹉热衣原体的微量为少于50μg/剂。
3．根据权利要求1的灭活的，致免疫有效且无不良反应的鹦鹉热衣原体疫苗，进一步包含除鹦鹉热衣原体以外的另一种猫抗原。
4．根据权利要求3的灭活，致免疫有效且无不良反应的鹦鹉热衣原体疫苗，其中另一种猫抗原选自猫鼻气管炎，猫萼状病毒，猫白血病病毒，兔弓形虫，狂犬病，猫总白细胞减少病毒，猫免疫缺损病毒和猫传染性腹膜炎病毒。
5．制备抗衣原体感染的疫苗的方法，包括a)在卵黄囊中培养鹦鹉热衣原体；b)从上述卵黄囊收获卵黄囊膜并冻存之以作为主导种；c)在贴壁生长的高度易感细胞系中培养所述主导种或其传代物，直至至少80％的细胞被鹦鹉热衣原体破坏；d)收获破坏的易感细胞系和含有该细胞系伴随的鹦鹉热衣原体的细胞培养物；e)去除破碎细胞系，留下鹦鹉热衣原体；f)灭活鹦鹉热衣原体；g)将灭活的鹦鹉热衣原体与佐剂和生理可接受的载体混合。
6．权利要求5的方法，其中所述高度易感细胞系是Buffalo绿猴细胞。
7．权利要求5的方法，其中所述灭活作用包括加入有效量的灭活剂以灭活鹦鹉热衣原体但仍保留其免疫原性。
8．权利要求7的方法，其中所述灭活剂选自二乙烯亚胺，β丙烯内酯，福尔马林，Merthiolate，硫柳汞，戊二醛和去污剂。
9．权利要求7的方法，其中灭活剂是二乙烯亚胺。
10．权利要求5的方法，其中佐剂选自聚合物和共聚物，丙烯酸聚合物和共聚物，聚丙烯酸如Carbopol，表面活性剂如十六烷基胺，皂苷，QuilA，氢氧化铝，磷酸铝，多肽如胞壁酰二肽，油乳剂，免疫调节物如白细胞介素和干扰素，干扰素诱生剂，乙烯顺丁烯二酸酐共聚物如EMA31,NEOCRYL A640和POLYGEN及其混合物。
11．权利要求5的方法，其中佐剂是POLYGEN。
12．权利要求5的方法，其中生理可接受载体选自磷酸缓冲盐水，盐水和极限必需培养基。
13．一种预防猫衣原体感染的方法，包括给予猫致免疫有效量的权利要求3的疫苗。
14．一种预防猫衣原体感染的方法，包括给予猫致免疫有效量的权利要求5的疫苗。
全文摘要
本发明涉及猫疫苗,疫苗中包含灭活的无不良反应的鹦鹉热衣原体,用以预防和治疗猫的衣原体疾病。
文档编号A61K39/118GK1223589SQ97196034
公开日1999年7月21日 申请日期1997年4月21日 优先权日1997年4月21日
发明者R·A·阿特尔顿, N·施梅尔, J·A·哈尔斯特鲁姆, J·K·莱恩, K·J·亨尼西 申请人:美国拜尔公司, 拜尔公司