专利名称:鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白及其编码基因与制备方法和应用，特别是涉及鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白及其编码基因与制备方法和在制备疫苗中的应用。
背景技术：
鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci，Cps)能感染各种鸟类、家禽和家畜，引起多种疾病。Spears(1979)曾根据感染的动物种类将29株Cps菌株分为八个生物型，即牛型、羊型、小鼠型、豚鼠型、兔型、猫型和鹦鹉型。KDE Everett等(1999)以16S和23SrRNA基因全长序列分析为依据，提出了一套新的衣原体分类体系，将原来鹦鹉热衣原体Cps重新分为流产嗜衣原体(Chlamydophila abortus)、鹦鹉嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、豚鼠嗜衣原体(Chlamydophila caviae)和猫嗜衣原体(Chlamydophila falis)四个种，均归为副衣原体科。Cps是比较常见的导致牛、羊和其它哺乳动物流产的病原体，在患病的母畜中，可通过胎盘屏障，引起宫内感染，严重时会对畜牧业造成重大损失。调查表明，我国引种频繁的国营农牧场、集约化饲养的大、中型畜禽场的Cps感染率在8-50％之间，动物群的流产率和死胎率远高于安全场，Cps感染以及局部爆发流行已对我国畜牧业形成严重威协，爆发流行时经济损失惨重。因此，对Cps的防治，具有十分重要的意义。
预防Cps感染最好的办法是免疫接种，目前在我国普遍使用的Cps疫苗是从接种的鸡胚中提取并灭活的Cps菌体疫苗，这种疫苗虽然也能起到一定的保护作用，但存在许多弊端，如不易大规模生产、成本高不易推广、存在变态反应原等。
随着分子生物学的发展，人们对Cps抗原的结构和功能有了更深入的了解，发现Cps主要外膜蛋白(MOMP)是其种特异性抗原，又是其最主要的保护性抗原。例如利用限制性片段长度多态性方法(RFLP)，两家实验室分别对36株和20株反刍动物来源的Cps MOMP基因进行了分析，得出一致结论无论来源如何，所有对小鼠有侵袭力的菌株，其MOMP基因的酶切图谱表现出严格的均一性，而对小鼠无侵袭力的菌株却有着不同的酶切图谱，说明感染不同反刍动物的Cps所编码的MOMP毒力基因基本一致。进一步研究发现Cps的脂多糖(LPS)抗原在机体的免疫应答中不起保护作用，而MOMP是Cps最主要的保护性抗原，用从Cps中提取的LPS和MOMP免疫小鼠，然后用Cps致死剂量进行腹腔接种，结果LPS免疫组小鼠全部死亡，MOMP免疫组得以存活。为确定MOMP作为疫苗的可能性，有人进行了灭活的全菌疫苗和提纯的MOMP亚细胞单位疫苗免疫母羊的效果比较，结果两种疫苗免疫组存活羔羊和流产的比例分别是15∶1和16∶1，而未免疫组的比例是8∶9；另外，感染后恢复期羊血清在免疫印迹实验中显示出MOMP抗体的存在，进一步说明了MOMP作为疫苗的保护性作用。
发明内容
本发明的发明人对我国流行的10株Cps MOMP基因进行了克隆和测序，证明我国流行的Cps MOMP基因基本一致，具有高度保守性。在此基础上，对Cps MOMP保护性抗原进行了克隆表达，获得了较高的产物表达率。
本发明的目的是提供Cps的一种重组主要外膜蛋白及其编码基因。
本发明所提供的Cps重组主要外膜蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
序列表中序列2的蛋白质由302个氨基酸残基组成。
Cps重组主要外膜蛋白的编码基因，是序列表中序列1的DNA序列。
序列1的基因由1058个核苷酸组成，其中自5’到3’端第79位到984位核苷酸为该基因的读码框。
含有序列1DNA序列的表达载体及转基因细胞系均属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供Cps重组主要外膜蛋白的制备方法。
鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白的制备方法，包括以下步骤1)利用PCR方法对鹦鹉热全DNA进行扩增，得到目的片段，其引物是15’-ACG CCA TGG ACC CAG CTG AAC CAA GTT T-3’；25’-ACG AAG CTT GAT TGT GGC TTC CCC TAA-3’；2)目的片段导入pET32a(+)载体；3)转入大肠杆菌DH5a中进行增殖，提取质粒后，再转入表达型菌体BL21(DE3)中；4)挑取阳性菌落培养，经IPTG诱导表达，收集菌体；5)超声破碎得到包含体；6)纯化得到目的蛋白。
利用本发明提供的基因，可以得到较高的表达产物收获率，每100ml培养液可收获重组蛋白17mg，该重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。
本发明的又一个目的是提供一种能够有效预防鹦鹉热的疫苗。
本发明所提供的预防鹦鹉热感染的疫苗，其活性成分是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
为了使疫苗的效果更好，所述疫苗中还可以加有佐剂。加入的佐剂可以是10号矿物油佐剂或福氏佐剂。
本发明疫苗的免疫剂量一般为0.5-1mg/Kg体重。
用本发明Cps重组MOMP为活性成分的疫苗免疫的大耳白家兔产生了对鹦鹉热衣原体的特异性抗体，第三针免疫后的效价可达1∶10000，用Cps重组MOMP免疫Balb/c小鼠，MTT方法检测脾淋巴细胞对Cps的特异性增殖反应，结果表明，免疫组脾淋巴细胞对Cps的增殖指数明显高于佐剂对照组(P＜0.01)。Cps重组MOMP在家兔和小鼠体内可诱导Cps特异性的体液免疫和细胞免疫应答。说明其具有较好的免疫原性，市场应用前景非常广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
实施例1、鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白的制备1、利用PCR方法对鹦鹉热全DNA进行扩增，其引物是15’-ACG CCA TGG ACC CAG CTG AAC CAA GTT T-3’；25’-ACG AAG CTT GAT TGT GGC TTC CCC TAA-3’。
2、将目的片段从T载体上切下，与经相同酶切的pET32a(+)载体相连。
3、转入大肠杆菌DH5a中进行增殖，提取质粒后，再转入表达型菌体BL21(DE3)中。
4、挑取阳性菌落，菌液和培养液的比例为1∶50，同时加入Amp(1∶1000)，37℃、250rpm摇床培养4小时，至菌液OD600＝0.7-0.9，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养5小时，离心集菌。
5、用超声缓冲液(50mM NaH2PO4pH7.8，300mM NaCl)重悬菌体沉淀至适当浓度，超声破碎60分钟，30秒间歇20秒，超声次数40次，功率35％。
6、10000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)，沉淀即为包含体。
7、生理盐水重悬沉淀，10000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。
8、生理盐水重悬沉淀8000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。
9、生理盐水重悬沉淀，超声破碎60分钟，10000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。
10、生理盐水重悬沉淀，8000rpm离心15分钟，弃上清(需经SDS-PAGE证实不含目的蛋白后再弃掉)。
11、含8M尿素的缓冲液B(NaH2PO40.1M，Tris-HCl pH8.0，0.01M)重悬沉淀，37℃摇床250rpm助溶3小时。
12、12000rpm离心20分钟，上清即为含重组蛋白的缓冲液，置含6M尿素的PBS缓冲液中透析4小时以上。
13、转置含4M尿素的PBS缓冲液中透析4小时以上。
14、转置含3M尿素的PBS缓冲液中透析4小时以上。
15、转置含2M尿素的PBS缓冲液中透析4小时以上。
16、转置含1M尿素的PBS缓冲液中透析4小时以上。
17、转置含0.5M尿素的PBS缓冲液中透析4小时以上。
18、获得Cps重组MOMP，生产量为每100ml培养液可收获重组蛋白17mg。
实施例2、以本发明Cps重组MOMP为活性成分的疫苗对家兔的免疫评价将实施例1所得的Cps重组MOMP稀释至10μg/ml后用以包被酶联板比较合适。用此酶联板测定血清效价。取血清检测为阴性的大耳白家兔6只，随机分成实验组和对照组。大耳白家兔，30日龄，雄性，体重相近约2kg/只，由本院实验动物中心提供。实验组用本发明Cps重组MOMP免疫，将制备的Cps重组MOMP与10号矿物油佐剂充分搅拌混匀，制成乳状胶溶液，腹部皮下多点注射家兔3只，每只注射2mg，间隔20d同样剂量和部位追加1针，30d时再追加1针，共追加2针，对照组大耳白家兔3只，仅注射10号矿物油佐剂，共免疫3次。比较实验组及对照组大耳白家兔血清的OD值。结果是免疫前采取的血清1∶200稀释后检测，均为阴性；免疫后的血清1∶200稀释后检测，对照组的动物均为阴性，实验组的动物均为阳性，其平均效价为1∶10000。说明本发明的Cps重组MOMP可以在家兔体内诱导产生体液免疫反应。
实施例3、以本发明Cps重组MOMP为活性成分的疫苗对小鼠的免疫评价将实施例1所得的Cps重组MOMP与10号矿物油佐剂充分搅拌混匀，制成乳状胶疫苗。将Balb/c小鼠随机分两组，实验组9只，腹部皮下多点注射疫苗0.25mg/只，间隔2周，同样剂量和部位追加免疫1针，共追加2针；对照组3只，仅注射10号矿物油佐剂0.25mg/只。第3针免疫后10天活杀取脾脏进行脾淋巴细胞分离和抗原特异性淋巴细胞增殖反应，具体方法为每组小鼠断颈处死后取脾脏，置于5％FCS RPMI1640培养液中，经研磨、过滤、洗涤2次，活细胞记数调整细胞浓度为2×105/ml，接种96孔细胞培养板，100μl/孔。然后加入抗原，抗原分别为Cps重组MOMP和Cps菌体蛋白，Cps重组MOMP和Cps菌体蛋白浓度均为10μg/ml，每孔加100μl，每个样品设3个复孔，37℃ 5％CO2孵箱培养7天。对照不加抗原，每孔加100μl，每样品设3个复孔，在37℃ 5％CO2孵箱培养72小时。检测时，每孔弃120μl上清，加四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液10μl，37℃ CO2孵箱6小时，离心去上清。每孔加助溶剂(DMSO)100μl，静置10分钟，酶联仪测OD值(570nm)。计算增殖指数(增殖指数＝实验组OD值/对照组OD值)，结果用SPSS软件进行方差统计学分析。结果表明，Cps重组MOMP免疫小鼠后，用Cps重组MOMP和Cps菌体蛋白测定的增殖指数，明显高于佐剂对照组(P＜0.01)，而免疫组Cps重组MOMP和Cps菌体蛋白之间的增殖指数差异不显著，Cps重组MOMP免疫小鼠能诱导淋巴细胞增殖反应，说明本发明的鹦鹉热衣原体重组主要外膜蛋白可以在小鼠体内诱导产生细胞免疫反应。
序列表<160>2<210>1<211>1058<212>DNA<213>衣原体属鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci，Cps)<400>1atgaaaaaac tcttgaaatc ggcattatta tttgccgcta cgggttccgc tctctcctta 60caagccttgc ctgtagggaa cccagctgaa ccaagtttat taatcgatgg cactatgtgg 120gaaggtgctt caggtgatcc ttgcgatcct tgctctactt ggtgtgatgc tatcagcatc 180cgcgcaggat actacggaga ttatgttttc gatcgtgtat taaaagttga tgtgaataaa 240actttcagcg gcattggcaa gaaacccaca ggatcctctc caaatgactt taaaaatgct 300gaagatagac ccaacgtcgc ttatggcaga catttgcaag actccgaatg gtttacaaat 360gcagctttct tagcgttaaa tatctgggat cgttttgata ttttctgcac attaggcgct 420tctaatgggt acttcaaagc tagttctgcg gcattcaatc tcgttggttt gattggtgtt 480aaaggaaact ccttaacaaa tgaccaactt cccaacgtag ccatcactca aggcgttgtt 540gagttttaca cagatacaac gttctcttgg agcgtaggtg cacgtggagc tctatgggaa 600tgtggttgcg caactttagg agctgaattc caatacgctc aatctaatcc taaaattgaa 660atgttgaatg taatctccag cccagcacaa tttgtggttc acaagcctag aggatacaag 720ggaacgtccg ccaactttcc tttacctgca aatgcaggca cagaggctgc tacggatact 780aaatctgcaa cactcaaata tcatgaatgg caagttggtc tagcactctc ttacagattg 840aacatgttag ttccttacat tggcgtaaac tggtcacgag caacttttga tgccgacact 900atccgcatcg ctcaacctaa attggcctct gctgttatga acttgaccac atggaaccca 960acccttttag gggaagccac aatccttgat acttccaata aattcagtga cttcttacaa 1020atcgcttcga ttcagatcaa caagatgaaa tctagaaa 1058<210>2
<211>302<212>PRT<213>衣原体属鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci，Cps)<400>2Asn Pro Ala Glu Pro Ser Leu Leu Ile Asp Gly Thr Met Trp Glu1 5 10 15Gly Ala Ser Gly Asp Pro Cys Asp Pro Cys Ser Thr Trp Cys Asp20 25 30Ala Ile Ser Ile Arg Ala Gly Tyr Tyr Gly Asp Tyr Val Phe Asp35 40 45Arg Val Leu Lys Val Asp Val Asn Lys Thr Phe Ser Gly Ile Gly50 55 60Lys Lys Pro Thr Gly Ser Ser Pro Asn Asp Phe Lys Asn Ala Glu65 70 75Asp Arg Pro Asn Val Ala Tyr Gly Arg His Leu Gln Ser Glu Trp80 85 90Phe Thr Asn Ala Ala Phe Leu Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe95 100 105Asp Ile Phe Cys Thr Asp Leu Gly Ala Ser Asn Gly Tyr Phe Lys110 115 120Ala Ser Ser Ala Ala Phe Asn Leu Val Gly Leu Ile Gly Val Lys125 130 135Gly Asn Ser Leu Thr Asn Asp Gln Leu Pro Asn Val Ala Ile Thr140 145 150Gln Gly Val Val Glu Phe Tyr Thr Asp Thr Thr Phe Ser Trp Ser155 160 165Val Gly Ala Arg Gly Ala Leu Trp Glu Cys Gly Cys Ala Thr Leu
170 175 180Gly Ala Glu Phe Gln Tyr Ala Gln Ser Asn Pro Lys Ile Glu Met185 190 195Leu Asn Val Ile Ser Ser Pro Ala Gln Phe Val Val His Lys Pro200 205 210Arg Gly Tyr Lys Gly Thr Ser Ala Asn Phe Pro Leu Pro Ala Asn215 220 225Ala Gly Thr Glu Ala Ala Thr Asp Thr Lys Ser Ala Thr Leu Lys230 235 240Tyr His Glu Trp Gln Val Gly Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn245 250 255Met Leu Val Pro Tyr Ile Gly Val Asn Trp Ser Arg Ala Thr Phe260 265 270Asp Ala Asp Thr Ile Arg Ile Ala Gln Pro Lys Leu Ala Ser Ala275 280 285Val Met Asn Leu Thr Thr Trp Asn Pro Thr Leu Leu Gly Glu Ala290 295 300Thr Ile302
权利要求
1.鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
2.鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白的编码基因，是具有序列表中序列1的DNA序列。
3.含有权利要求
2所述基因的表达载体。
4.含有权利要求
2所述基因的转基因细胞系。
5.鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白的制备方法，包括以下步骤1)利用PCR方法对鹦鹉热全DNA进行扩增，得到目的片段，其引物是15’-ACG CCA TGG ACC CAG CTG AAC CAA GTT T-3’；25’-ACG AAG CTT GAT TGT GGC TTC CCC TAA-3’；2)目的片段导入pET32a(+)载体；3)转入大肠杆菌DH5a中进行增殖，提取质粒后，再转入表达型菌体BL21(DE3)中；4)挑取阳性菌落培养，经IPTG诱导表达，收集菌体；5)超声破碎得到包含体；6)纯化得到目的蛋白。
6.一种预防鹦鹉热感染的疫苗，其活性成分是权利要求
1所述的重组主要外膜蛋白保护性抗原。
专利摘要
本发明公开了鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白及其制备方法与应用，本发明所提供的鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，其编码基因是具有序列表中序列1核苷酸序列的DNA。本发明鹦鹉热衣原体的一种重组主要外膜蛋白的制备方法，包括以下步骤1)扩增目的片段；2)目的片段导入pET32a(+)载体；3)转入大肠杆菌DH5a中进行增殖，提取质粒后，再转入表达型菌体BL21(DE3)中；4)挑取阳性菌落培养，经IPTG诱导表达，收集菌体；5)超声破碎得到包含体；6)纯化得到目的蛋白。本发明的抗原具有非常好的免疫原性，可广泛用于预防鹦鹉热疫苗的制备。
文档编号A61K39/118GKCN1194008SQ02146790
公开日2005年3月23日 申请日期2002年11月8日
发明者端青, 朱虹, 张浩杰, 刘向伟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan