专利名称：一种低温木聚糖酶XynAHJ2及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种低温木聚糖酶XynAHJ2及其基因。
背景技术：
半纤维素是自然界中的第二丰富多聚糖。木聚糖是半纤维素的重要组分， 其主要存在于蕨类、裸子植物和被子植物中，如农业副产物中的玉米芯、麦麸、米糠、 秸秆和甘蔗渣等。木聚糖酶可将木聚糖降解成低聚糖、木糖和木糖衍生物，包括内切-1，4-β- -木聚糖酶(endo-l，4-0-D_xylanase，EC 3. 2. 1. 8)禾口 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，EC 3· 2· 1· 55)等(Collins et al. FEMS Microbiol Rev, 2005, 29: 3 - 23.)。根据氨基酸序列同源性，木聚糖酶主要归类于糖苷水解酶第10、11、 39、43、52、62 和 67 家族(Finn et al. Nucleic Acids Res, 2008, 36: D281-D288·)。内切-1，4_β-D-木聚糖酶被认为是木聚糖酶中最重要的酶，主要归类于糖苷水解酶第10和11家族，具有广泛的应用性，如内切-1，4-β-D-木聚糖酶在饲料行业中可改善饲料性能并消除或降低抗营养作用、在造纸和纸浆工业中可作为生物漂白剂、在酿酒行业中可提高发酵效率并增加酒精的产率、在食品行业中可改善食品性能等。低温木聚糖酶可用于低温到中温的生境或加工过程，如水产生境常常为10-25°C、食品行业中的醒面和杆面过程需要在35°C以下进行等。将中温或者高温加工的过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用(Beg et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2001，56: 326 - 338. )0 但是，目前所获得的木聚糖酶，多为中温或高温酶(Wang et al. Bioresour Technol, 2011， 102: 3330 - 3336.)，这些木聚糖酶在低温下(0 - 20°C )几乎都没有酶活。
发明内容
本发明的目的是提供一种低温木聚糖酶XynAHJ2。本发明的再一目的是提供编码上述低温木聚糖酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明所述低温木聚糖酶XynAHJ2可得自芽孢杆菌(Macillus sp. )，BaciIlus sp. ATCC 31195。XynAHJ2 的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。本发明的木聚糖酶XynAHJ2的最适pH值为6. 5，在pH5. 5-10.0的范围内维持50% 以上的酶活性；经PH6. 0-10.0的缓冲液处理lh，酶活剩余50%以上；最适温度为35°C， 在10°C和20°C分别具有约40%和60%的酶活，具有低温酶的低温催化特性；37°C时半衰期 >60min，45°C时半衰期约为％iin，属于低温酶的温度不稳定特性；能有效地水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚糖、麸皮、玉米粉、豆粕和棉粕。本发明提供了编码上述低温木聚糖酶的基因U/7AY/J ，该基因序列如SEQ ID N0.2所示。本发明通过PCR的方法分离克隆了低温木聚糖酶基因xynAHJ2,其全长990bp， 起始密码为ATG，终止密码为TAG，编码3 个氨基酸。经BLAST比对，该木聚糖酶基因 ^7/^ 忍编码的氨基酸序列与GenBank中Geobacillus sp. Y412MC10来源的潜在木聚糖酶 (ACX65537)具有最高的一致性，为66. 5% ；与确证活性的Pami力aciBm sp. HPL-001来源内切-1，4-β-D-木聚糖酶(ACJ06666)的一致性为65. 3%。说明木聚糖酶XynAHJ2是一种新的内切-1，4-β -D-木聚糖酶。本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶基因炒/^汉忍的重组载体，优选为 PET-^FW///么将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pET48a ( + )上的和损ol限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒ρΕΤ-υ Α /么本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶基因^^AY/J 的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株么本发明的制备低温木聚糖酶XynAHJ2的方法按以下步骤进行
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；
3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XynAHJ2。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21 (DE3 )，得到重组菌株BL21 (DE3) /xynAHJ2。本发明的木聚糖酶XynAHJ2最适pH在中性范围(pH6. 5)，pH稳定性在中性pH内最佳，最适温度较低(35°C)且在较低温度(10°C)具有较高活性(剩余约40%酶活)，有效地水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚糖、麸皮、玉米粉、豆粕和棉粕，表明XynAHJ2在食品和水产饲料添加剂方面具一定的应用前景。
图1 在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白质Marker ；1 纯化的重组木聚糖酶；2 含有重组木聚糖酶基因的大肠杆菌培养上清液。图2 重组木聚糖酶的最适pH。图3 重组木聚糖酶的pH稳定性。图4 重组木聚糖酶的最适温度。图5 重组木聚糖酶的热稳定性。
具体实施例方式试验材料和试剂
1、菌株及载体芽孢杆菌(泡以7ΛΛ5 sp.)同文献报道菌种性质，如feciBm sp. ATCC 31195 ；大肠杆菌表达载体pETj8a ( + )及菌株fecAericAia coli BL21 (DE3)可购于 Novagen 公司。2、酶类及其它生化试剂限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；燕麦木聚糖、桦木木聚糖和山毛榉木聚糖购自Sigma公司；其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基
LB 培养基=Peptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g，加蒸馏水至 1000ml，pH 自然 (约为7)。固体培养基在此基础上加2. 0% (w/v)琼脂。
说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1 木聚糖酶基因xynAHJ2的克隆
提取芽孢杆菌基因组DNA 将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入ImL溶菌酶，37°C处理60min，再加入裂解液，70°C水浴裂解60min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下IOOOOrpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置 5min后，4°C下IOOOOrpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于_20°C备用。根据糖苷水解酶第10家族的保守序列(G-H-T-L-[V/I/L]-W-H和W-D-V-V-N-EH^ 计合成了简并引物GHlOF和GHlOR (表1)。
表1.木聚糖酶基因xynAHJ2克隆弓丨物
权利要求
1.一种低温木聚糖酶XynAHJ2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种编码权利要求1所述的低温木聚糖酶基因么其特征在于其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
3.一种包含权利要求2所述低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组载体。
4.一种包含权利要求2所述低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组菌株。
全文摘要
本发明涉及一种低温木聚糖酶XynAHJ2及其基因。本发明提供了一种来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)的木聚糖酶XynAHJ2，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本发明提供了上述木聚糖酶的编码基因xynAHJ2，低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组载体和低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组菌株。本发明的木聚糖酶具有以下性质最适pH6.5；最适温度35℃，在10℃和20℃分别具有约40%和60%的酶活；良好的pH稳定性；较好的在低温下水解各种底物的能力；可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。
文档编号C12N15/63GK102220304SQ20111014255
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者周峻沛, 唐湘华, 李俊俊, 潘璐, 董岩岩, 许波, 高雅洁, 黄遵锡 申请人:云南师范大学