一种基于万能碱基的dna测序方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，公开了一种基于万能碱基的DNA测序方法。本发明利用万能碱基构建四种带有不同的荧光基团的n聚核苷酸；然后利用万能碱基构成的n聚核苷酸和DNA连接酶对DNA模板链进行测序延伸反应；测序延伸反应结束后，读取荧光信息，再用RNA酶切除带有荧光基团的万能碱基；多次循环测序反应，直至得到DNA模板的完整序列。本发明无需要构建4n的寡聚核苷酸库，方法简单可靠，成本优势明显；本方法适用于短片段DNA的大规模实验室测序和基于循环芯片测序技术的高通量DNA测序。
【专利说明】—种基于万能碱基的DNA测序方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种基于万能碱基的DNA测序方法。
【背景技术】
[0002]DNA序列被称之为生命密码。有效而准确地获取这些密码，是生命科学研究的基本信息获得手段和赖以发展的根本基础。英国生化学家Sanger在20世纪70年代中期发明的双脱氧链末端终止法测序技术是目前应用最广泛的测序技术。Sanger测序法的原理是利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-0H基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
[0003]针对基因组测序，目前发展了多种方法，从最先开始的基于Sanger测序法的凝胶电泳测定技术包括后来改进的毛细管电泳测序技术，到非凝胶电泳测序技术的DNA杂交测序(SBH, sequencing by hybridization)和合成测序法(SBS, sequencing by synthesis)。2005年前后，高通量测序技术进入市场，彻底改变了测序的规模化进程。高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。依靠后期强大的生物信息学分析能力 ，对照一个参比基因组(reference genome),高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序。
[0004]目前，代表世界合成测序发展水平的主流测序仪器包括Illumina测序仪、Roche454测序仪、AB SOLiD测序仪和HeliScope测序仪。所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略一循环芯片测序法(cyclic-array sequencing)。所述循环芯片测序法为:首先将基因组DNA随机分割成小片段DNA分子，然后在这些小片段DNA分子的末端连接上普通的接头，最后用这些小片段DNA分子制成芯片；每一个芯片簇(colony)中都含有一个小片段DNA分子的许多个拷贝；许多这样的簇集合在一起就形成了芯片，这样一次测序反应就可以同时对众多的簇进行测序；然后与Sanger法类似，通过对每一个延伸反应产物末端荧光颜色进行识别来读取出DNA序列；重复上述步骤就能获得完整的序列。上述方法有一个共同点，真正的测序反应本身和传统测序法一样，是由重复的聚合酶或连接酶酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成。
[0005]万能碱基(Universal Bases)是一类重要的化合物，它可以没有选择性地与所有的天然基地配对，所产生的DNA双链与完全天然碱基组成的DNA双链具有相似的稳定性。20世纪90年代以来，一些化合物作为万能碱基进行了研究，包括硝基吡咯类化合物、唑甲酰胺类化合物、芳香三唑类化合物。万能碱基在PCR引物和微阵列探针中已经得到了实际应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种基于万能碱基的DNA测序方法。
[0007]为实现上述发明目的，本发明技术方案为:
[0008]一种基于万能碱基的DNA测序方法，包括如下步骤:
[0009](1)利用万能碱基构建如式I所示n聚核苷酸，其中N为天然碱基A、T、G、或C，U为万能碱基，F为荧光基团，n大于3 ;当N分别为不同的天然碱基时，得到四种n聚核苷酸；
[0010]所述四种n聚核苷酸分别带有不同的荧光基团；所述四种n聚核苷酸的万能碱基为3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、3-甲酰胺基-5-硝基吲哚、或4-硝基-1-氢咪唑；
[0011]
【权利要求】
1.一种基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)利用万能碱基构建如式I所示η聚核苷酸，其中N为天然碱基A、T、G、或C，U为万能碱基，F为荧光基团，η大于3 ;当N分别为不同的天然碱基时，得到四种η聚核苷酸； 所述四种η聚核苷酸分别带有不同的荧光基团；所述四种η聚核苷酸的万能碱基为3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、3-甲酰胺基-5-硝基吲哚、或4-硝基-1-氢咪唑；.-」=-.:7—-
2.根据权利要I所述基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，所述荧光基团为Cy3> Cy5> Fluorescein、Alexa594、Atto488、或 Oregon Green488。
3.根据权利要I所述基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，所述DNA连接酶为T4连接酶和\或13连接酶。
4.根据权利要I所述基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，所述洗液清洗为利用四种洗液依次清洗，所述四种洗液分别为:洗液1:0.2%SDS/1XSSC ;洗液2 =IXSSC ;洗液3:0.1XSSC ;洗液4:超纯水。
5.根据权利要I所述基于万能碱基的DNA测序方法，其特征在于，所述切割缓冲液为:10mM Tris,5mM ED TA,2mM DTT，pH7.0。
【文档编号】C12Q1/68GK103667469SQ201310638103
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】梁峰, 张丕明, 陈荣生 申请人:武汉科技大学