一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体、构建方法、重组工程菌及其表达方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体、构建方法、重组工程菌及其表达方法，该重组载体将人半乳糖凝集素1和猪肠三叶肽的基因插入表达质粒中构建而成。本发明通过在重组质粒上插入了人galectin-1基因，从而使肠三叶肽TFF3能够实现在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达，解决了目前大肠杆菌表达目标基因往往会形成不溶性、无活性的包涵体的技术问题，为实现工业化生产可溶性肠三叶肽TFF3提供了理论和实践基础。
【专利说明】一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体、构建方法、重组工程菌及其表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体，同时还涉及该重组载体的构建方法，包含该重组载体的重组工程菌及其表达猪肠三叶肽的方法，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成:(1)宿主:表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。(2)载体:载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核(细菌)表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。(3)辅助成分:有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。其中，原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。
[0003] 原核蛋白表达系统以大肠杆菌(E.coli)表达系统为代表，其最早被采用进行研究的，是目前掌握最为成熟的表达系统，也是生产重组蛋白的最常用的系统。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、细胞繁殖快速、诱导表达相对简便、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。对于表达不同的蛋白，需要采用不同的表达载体。表达载体质粒上的元件包括:启动子、多克隆位点、终止密码、复制子、筛选标记或报告基因等。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。
[0004]近几年来，国内外大肠杆菌表达系统研究的重点已从构建各种表达载体，建立新的表达系统转移到完善现有的表达系统，解决表达系统中还存在的缺陷等方面。这些研究工作主要包括重组蛋白质的正确折叠，构象形成和分泌，菌体表面表达技术及其应用，重组蛋白质修饰加工研究等内容。
[0005]值得重视的是，在大肠杆菌中表达的目标基因往往会形成不溶性、无活性的包涵体，这使大肠杆菌表达系统的应用范围受到了很大限制，虽然到目前为止大肠杆菌细胞内可溶性表达问题还没有完全解决，但也取得了不少研究结果和进展。包涵体是由于在新合成的大量目标蛋白质的折叠过程中，大肠杆菌细胞内参与折叠的蛋白因子的量不能满足需要，无法形成正确的构象而产生的。由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工体系相当不完善，因此不能对重组蛋白质进行修饰加工，这是大肠杆菌系统与其它表达系统相比存在的一个比较突出的缺陷。因此关于表达产物的构象、分泌、定位和修饰加工研究是大肠杆菌表达系统研究的重点方向。
[0006]肠三叶肽TFF3是三叶肽家族中最重要的小分子多肽，又称为肠三叶因子(ITF)，主要分布于肠道。它由59个氨基酸残基构成，分子量约6.7KDa，属于三叶肽家族，由于具有特殊的“三叶草”空间 结构，不仅能促进肠粘膜细胞的增殖，还能与肠粘液中的糖蛋白发生结合，起到稳定肠粘液和维护肠粘液屏障的作用，因而其在肠道损害修复以及再生方面具有非常重要的意义。肠三叶肽TFF3是一种具有重要的潜在药用价值的小蛋白分子，因此采用基因工程的方法获取TFF3，对肠三叶肽的研究并加以有效地利用就有非常重大的意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体，采用该表达载体的大肠杆菌表达系统能够表达可溶性猪肠三叶肽。
[0008]本发明的目的还在于提供一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法。
[0009]本发明的目的还在于提供一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的重组工程菌。
[0010]本发明的目的还在于提供一种利用重组工程菌诱导表达可溶性猪肠三叶肽的方法。
[0011]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体，将人半乳糖凝集素I和猪肠三叶肽的基因插入表达质粒中构建而成。
[0012]所述的表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体包括如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0013]GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGTGGTCTGGTCGCCAGCAACCTGAATCTCAAACCTGGAGAGTGCCTTCGAGTGCGAGGCGAGGTGGCTCCTGACGCTAAGAGCTTCGTGCTGAACCTGGGCAAAGACAGCAACAACCTGTGCCTGCACTTCAACCCTCGCTTCAACGCCCACGGCGACGCCAACACCATCGTGTGCAACAGCAAGGACGGCGGGGCCTGGGGGACCGAGCAGCGGGAGGCTGTCTTTCCCTTCCAGCCTGGAAGTGTTGCAGAGGTGTGCATCACCTTCGACCAGGCCAACCTGACCGTCAAGCTGCCAGATGGATACGAATTCAAGTTCCCCAACCGCCTCAACCTGGAGGCCATCAACTACATGGCAGCTGACGGTGACTTCAAGATCAAATGTGTGGCCTTTGACGAGAACCTGTACTTCCAGGGTCACCACCACCACCACCACGGATCCGAATTCGAGCTCGTCGA
【权利要求】
1.一种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体，其特征在于，将人半乳糖凝集素I和猪肠三叶肽的基因插入表达质粒中构建而成。
2.根据权利要求1所述的表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体，其特征在于，包括如SEQID N0.1所示的核苷酸序列。
3.—种表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取猪肠道黏膜总RNA,反转录成cDNA,设计引物PrimerF、Primer R,扩增猪肠三叶肽TFF3基因； 2)以人cDNA为模板,设计引物Primera、Primer b,扩增人半乳糖凝集素I基因片段；将扩增产物与质粒PMD-19T酶切，连接过夜，得到重组质粒pMD19T-Galectin-l ； 3)将重组质粒pMD19T-Galectin-l转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落，然后提取阳性菌落中的重组质粒pMD19T-Galectin-l并酶切，回收酶切产物； 4)将酶切产物与质粒pET28a双酶切，并连接过夜，得到重组质粒pET28a-Galectin_l；随后转化大肠杆菌DH5a，挑取大肠杆菌DH5a菌落培养，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性菌落； 5)培养步骤4)的阳性菌落，提取质粒pET28a-Galectin-l； 6)以质粒pET28a-Galectin_l 为模板，设计引物 Primer F1、Primer R2,进行 PCR 扩增； 7)以步骤6)的PCR扩增产物为模板，设计引物PrimerFUPrimer R3，进行PCR扩增； 8)以步骤7)的PCR扩增产物为模板`，设计引物PrimerFUPrimer R4，进行PCR扩增； 9)将步骤8)的扩增产物和质粒pET28a双酶切，连接，转化大肠杆菌DH5α ;然后挑取大肠杆菌DH5 α菌落培养，并进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性克隆； 10)提取步骤9)阳性菌落的质粒，然后与步骤I)的猪肠三叶肽TFF3基因双酶切，并连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，大肠杆菌DH5a阳性克隆中的质粒即为表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体。
4.根据权利要求3所述的表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法，其特征在于，所述引物Primer F、Primer R为:
Primer F:5’ -GTCCCAGCCAAGCTTGGGGAGTATGTGGGCCTGTCG-3’ ；
Primer R:5’ -GTCCAAGCCCTCGAGTCAGAAGGTGCATTCTGTTTC-3’。
5.根据权利要求3所述的表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法，其特征在于，所述引物Primer a、Primer b为:
Primer a:5’ -CGCGGATCCGCTTGTGGTCTGGTCGCCAGCAACCTGAATCTC-3’
Primer b:5’ -CGCCCCAAGCTTGGGTCAGTCAAAGGCCACACATTTGATCTTGAAGTC-3’。
6.根据权利要求3所述的表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法，其特征在于，所述引物 Primer Fl> Primer R2 为:
Primer Fl:5’-GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGT-3’
Primer R2:5’ -ACCCTGGAAGTACAGGTTCTCGTCAAAGGCCACACATTT-3’。
7.根据权利要求3所述的表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法，其特征在于，所述引物 Primer Fl> Primer R3 为:
Primer Fl:5’-GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGT-3’Primer R3:5’ -GTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTGGAAGTACAGGTTCTCGTCAAAGGC-3’。
8.根据权利要求3所述的表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的构建方法，其特征在于，所述引物 Primer Fl> Primer R4 为:
Primer Fl:5’-GATATACCCATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCCGCTTGT-3’
Primer R4:5’-TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGAGCTCGAATTCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCCTGGAAGTA-3，。
9.一种包含权利要求1表达可溶性猪肠三叶肽的重组载体的重组工程菌，其特征在于，所述重组载体的宿主为大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS.
10.一种利用权利要求9重组工程菌诱导表达可溶性猪肠三叶肽的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将重组工程菌以1%的接种量接种到Kana+/LB培养基中，在220rpm、37°C条件下进行振荡培养至A600为0.6~1.0，加入IPTG，使终浓度为1.0mmol/L，在30°C条件下诱导表达8h ； 2)诱导结束后，离心收集菌体沉淀，超声破碎，然后离心取上清液，将上清液过滤并纯化即得。
【文档编号】C12N15/70GK103725706SQ201310739492
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】杨国庆, 姚雅楠 申请人:河南农业大学