淡水美丽胶网藻Heynigia riparia SX01及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物质能源【技术领域】，具体涉及一株淡水美丽胶网藻HeynigiaripariaSX01及其在高密度发酵法生产藻类生物制品中的应用。本发明保藏号为CCTCCM2013610的美丽胶网藻株HeynigiaripariaSX01，能够在光异养化能异养光切换培养模式下实现高密度生物质发酵及油脂累积，适合高品质生物柴油的生产；该藻株为胶网藻藻种中首次发现能够进行光诱导下营养方式的切换培养，并能够应用高密度发酵法生产微藻油质，在生物能源领域具有极大的应用前景。
【专利说明】淡水美丽胶网藻Heynigia riparia SX01及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物质能源【技术领域】，具体涉及一株淡水美丽胶网藻株Heynigiariparia SXOl及其在高密度发酵法生产藻类生物制品中的应用。
【背景技术】
[0002]生物柴油即脂肪酸的甲酯，是一种可生物降解、环境友好的可再生能源。自1988年来，许多欧洲国家就已经开始将生物柴油作为传统石化柴油的替代品加以利用。但是由于生物柴油生产的原料成本 较高，而阻碍了生物柴油的规模化应用。目前，在化石能源危机以及环境污染的双重背景下，寻求合适的、低成本原料来积极发展可再生能源是可持续发展的总体趋势。
[0003]藻类具有光合效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产量高等优点，另外，某些优势藻种可以大量累积油脂，因此藻类被认为是21世纪最具发展潜力的生物柴油制备的原材料。
[0004]美国，澳洲、日本、西欧、印度和南非的政府或企业投入巨资进行微藻生物柴油的研究。美国著名实验室和科学家组成的“National Alliance”的联盟,该联盟中的LiveFuels公司宣布了由国家能源局支持的“微型曼哈顿计划”，即微藻能源计划，计划在2010年实现微藻制备生物柴油的工业化。日本国际贸易和工业部曾资助了一项名为“地球研究更新技术计划”的项目。该项目利用微藻来生物固定CO2,并着力开发密闭式光生物反应器技术，通过微藻吸收火力发电厂烟气中的CO2来生产生物质能源。2008年，英国碳基金公司启动了目前世界上最大的藻类生物燃料项目，投入2600万英镑用于发展相关技术和基础设施，该项目预计到2020年实现商业化。荷兰AlgaeLink公司是一家拥有工业化藻类培养设备和藻油加工技术的跨国公司，该公司向全球销售其反应器，并提供相关技术支持。2008年4月该公司与荷兰航空公司签订了利用藻油开发航空燃油的协议。此外，以色列一家公司于2007年对外展示了利用海藻吸收CO2，将太阳能转化为生物质能的技术，每5千克藻类可生产I升燃料。
[0005]近年来，微藻生物柴油技术也引起了我国政府科研机构和企业的重视，被列为科技部863计划、973基础规划、十二五生物技术发展规划的重点项目之一。各高校和科研院所积极开展了这方面的研究，主要集中于藻种的筛选、微藻培养生物反应器设计及下游加工技术。目前，一些企业及研究机构也正在进行微藻生产生物柴油的中试培养。新奥科技发展有限公司的“C02—微藻一生物柴油”关键技术研究项目已经通过中试，并在内蒙古达拉特旗建设280hm2的微藻养殖基地。2009年，中国石化股份有限公司与中科院联合启动了“微藻生物柴油成套技术”项目，目标计划到2015年完成万吨级工业生产装置。
[0006]虽然微藻生物柴油目前在技术上是可行的，但是与化石柴油相比，微藻生物柴油的生产面临着两大“瓶颈”，使得微藻生物柴油的规模化生产严重受阻。其一是微藻生物柴油生产成本高，故产品价格也较高，还无法适应当前的市场需求，且因微藻的大规模培养水平尚有限，这也使得微藻生物柴油的价格居高不下；二是微藻生物质自养培养细胞密度低导致后续加工处理过程成本高。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一株优势富油微藻以及适合该藻株高密度发酵累积油脂制备生物柴油的技术。该藻株在光切换发酵模式下，可以实现高密度发酵，同时在该光切换培养模式下可以实现油脂的大量累积；本发明获得的藻株油脂组成主要为C16-C18 099%)的油脂，适合高品质生物柴油的制备；该发明为微藻生物柴油的生产提供了新的富油藻种以及适合该藻种的发酵技术，为生物柴油的高品质生产提供了新藻种以及新的技术。
[0008]本发明首先公开了一株美丽胶网藻株Heynigia riparia SX01,其保藏号为:CCTCC M2013610。
[0009]本发明从取自陕西省西安市的一份酸性水样中分离筛选到一株淡水微藻，Heynigia riparia SX01,该菌株已于2013年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为 CCTCC M2013610。
[0010]在BG-1l基础营养盐培养基上培养时，该藻株细胞呈圆形或卵形，直径在3~10 μ m之间，每个细胞内有一个周生、杯状或片状的色素体,具有I个细胞核；细胞壁较薄；单细胞或多细胞群体。普通培养条件下，测定该微藻细胞中蛋白含量30~50wt%，油脂含量22~57wt%，多糖含量5~20wt%，富含绿叶素。该菌株存在光异养化能异养光切换培养模式，细胞内可以累积大量脂滴，脂质含量最高可达57wt%。
[0011]经形态学鉴定 和18S rRNA, ITS-2以及rbcL扩增序列发育树分析，确定该藻株为美丽胶网藻，命名为Heynigia riparia SXOl(按照国际命名规则:属名+种名+株名对该藻株进行命名，属名、种名、株名分别为Heynigia、riparia和SX01,因此该藻命名为Heynigiariparia SX01)，中国典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC M2013610。
[0012]优选的,所述美丽胶网藻株Heynigia riparia SXOl存在光诱导下营养方式的切换。
[0013]更优选的，所述光诱导下营养方式的切换为光异养化能异养光切换培养模式。
[0014]本发明Heynigia riparia SXOl藻株的光异养化能异养光切换模式,是指微藻在培养过程中既添加外源碳源，又通过每天光照和黑暗条件的交替，发酵培养藻株。
[0015]优选的，所述美丽胶网藻Heynigia riparia SXOl的藻细胞内，脂质含量小于等于57wt%0
[0016]更优选的，所述美丽胶网藻Heynigia riparia SXOl的藻细胞内，脂质含量为22 ~57wt%。
[0017]更优选的,所述美丽胶网藻Heynigia riparia SXOl中，C16、C18脂肪酸的含量>99wt%0
[0018]该藻株适合培养温度和pH范围较广,适宜培养温度范围为10~45°C,适宜pH值范围为4.0~11，能够利用葡萄糖进行光异养，化能异养，以及光异养化能异养光切换培养，为首次发现能够进行光诱导下营养方式的切换，并在切换培养模式下获得高密度生物质发酵及油脂累积。
[0019]本发明第二方面公开了美丽胶网藻株Heynigia riparia SXOl高密度发酵的方法，具体步骤如下:
[0020]I)种子液制备:无菌条件下挑取平板上的Heynigia riparia SXOl单藻落于灭菌的BG-1l液体培养基中培养至对数生长期，获得种子液。
[0021]2)发酵培养:将步骤I)对数生长期的微藻种子液接种到灭菌的BG-1l液体培养基中进行发酵培养，发酵培养的条件为--温度10~45°C，培养基pH值4.0~11.0，光照强度2500~150001ux，光暗比为O~24:24~0，葡萄糖添加量为O~40g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，培养5~15天后发酵结束，获得发酵液。
[0022]种子液培养条件与发酵培养条件基本相同。
[0023]优选的，步骤I)所述种子液的培养条件为:种子液培养条件为温度10~45°C，培养基初始pH值4.0~11，光照强度2500~150001ux，光暗比为O~24:24~0，葡萄糖添加量为O~40g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm。
[0024]优选的,步骤2)所述种子液的接种量为5~15v/v%。
[0025]本发明所述光暗比为O~24:24~0，是指光照时间为A小时，黑暗时间为B小时，A:B为O~24:24~0，并且A+B=24小时。
[0026]优选的，步骤2)所述发酵培养的条件为温度25_35°C，培养基pH值5_8，光照强度6000~90001ux，光暗比为9~18:6~15，葡萄糖添加量为10~25g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，培养9~14天后发酵结束，获得发酵液。
[0027]更优选的，步骤2)所述发酵培养的条件为:温度28°C，培养基pH值8.0，光照强度75001UX，光暗比为12:12，葡萄糖添加量为20g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为
0.33vvm,培养9~14天后发酵结束，获得发酵产物。
[0028]优选的，自养培养的发酵时间优选为14天。光异养、化能异养、光异养化能异养光切换模式下的发酵培养时间优选均为9天。光异养、化能异养、光异养化能异养光切换模式发酵培养时葡萄糖优选添加量为20g/L。
[0029] 本发明第三方面公开了美丽胶网藻株Heynigia riparia SXOl高密度发酵生物制品的加工工艺，工艺步骤如下:
[0030]A.采用前述美丽胶网藻株Heynigia riparia SXOl高密度发酵的方法制备获得发酵液；
[0031]B.对发酵液进行固液分离，收集微藻细胞，并采用无菌BG-1l液体培养基洗涤；
[0032]C.将步骤B收集的微藻细胞真空冷冻干燥获得藻粉；
[0033]D.将步骤C制备的藻粉通过三氟化硼催化法制备脂肪酸甲酯；
[0034]优选的，步骤B所述固液分离的方法为低速离心，离心速度为4000~15000rpm。
[0035]优选的，步骤C还包括对藻粉进行微藻生物量，微藻产率，蛋白含量以及油脂含量的检测步骤。
[0036]微藻生物量及微藻产率的检测为常规分析过程，具体方法可参考现有技术。蛋白含量的检测为将真空干燥后的藻粉采用VARIO ELIII型元素分析仪测得氮含量然后乘以蛋白平均含氮量得到蛋白质含量。油脂含量的测定为将真空干燥后的藻粉采用氯仿甲醇法分析油脂含量。
[0037]优选的，步骤D还包括脂肪酸甲酯组成的分析，为通过气象色谱质谱技术分析脂肪酸甲酯的种类和相对含量。[0038]本发明最后一方面公开了美丽胶网藻株Heynigia riparia SXOl在生物能源领域的应用。
[0039]优选的，为美丽胶网藻株Heynigia riparia SXOl生产生物柴油的应用。
[0040]有益效果:本发明提供的淡水美丽胶网藻Heynigia riparia SXOl能够在光异养化能异养光切换培养模式下实现高密度生物质发酵及油脂累积，发酵藻粉生物量为14g/L，蛋白质含量40%，油脂含量57%，脂肪酸组成主要为C16-C18 (>99%)，适合高品质生物柴油的生产；该藻种为首次 发现的能够进行光诱导下营养方式的切换的新种，并能够应用高密度发酵法生产微藻油质。
[0041]本发明藻株保藏信息如下:
[0042]藻株名称:Heynigiariparia SXOl ；
[0043]保藏号为:CCTCCM2013610
[0044]保藏日期:2013年11月27日；
[0045]保减单位名称:中国典型培养物保减中心；
[0046]保藏单位简称:CCTCC ；
保藏单位地址:武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]图1:淡水美丽胶网藻Heynigia riparia SXOl的藻细胞扫描电镜照片
[0048]图2:淡水美丽胶网藻Heynigia riparia SXOl的藻细胞普通光学显微镜照片
[0049]图3:淡水美丽胶网藻Heynigia riparia SXOl的藻细胞内部脂肪滴染色显微照片
[0050]图4:淡水美丽胶网藻Heynigia riparia SXOl所含脂肪酸甲酯组成的HPLC分析【具体实施方式】
[0051]通过以下具体实施例对本发明进行进一步的阐述，以下实施例仅用于说明，而不用于限制本发明的保护范围。
[0052]本发明通过筛选获得了一株优良富油新藻种，该藻种可以通过营养方式切换实现高密度生物质发酵及脂质累积，为微藻生物柴油的工业化生产提供了新藻藻种及新技术。
[0053]实施例1
[0054]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌BG-1l培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。
[0055]配制BG-1l培养基500mL，按15v/v%接种量接入已扩大培养的细胞培养液。初始pHll，温度25°C，光暗比8:16(白天:夜晚)，光照强度150001ux，葡萄糖添加量2g/L，通入Ivvm的无菌空气，CO2含量为0.03% (v/v),培养15天。
[0056]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为800mg/L,生物量产率为56mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为22%，蛋白含量40%以上。生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16-C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的99wt%，微藻细胞的扫描电镜照片、光学显微镜照片，以及脂肪滴染色照片见图1-3。
[0057]实施例2光异养化能异养光切换模式[0058]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌BG-1l培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。
[0059]配制BG-1l培养基500mL，按5v/v%接种量接入已扩大培养的细胞培养液。初始PH7.0，温度45°C，光暗比12:12(白天:夜晚)，光照强度25001ux，葡萄糖添加量40g/L，通入Ivvm的无菌空气(CO2含量为0.03% (v/v),培养5天。
[0060]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为
8.2g/L，生物量产率为0.9g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为46%。蛋白含量36%以上。生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16-C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的99wt%以上，脂肪酸甲酯组成的HPLC图谱如图4所示。
[0061]实施例3光异养化能异养光切换模式
[0062]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。
[0063]配制BG-1l培养基500mL，按10v/v%接种量接入已扩大培养的细胞培养液。初始ρΗ8.0，温度28°C，光照暗比12:12(白天:夜晚)，光照强度75001ux，葡萄糖添加量20g/L,通入0.33vvm的无菌空气(CO2含量为0.03% (v/v),培养9天。
[0064]离心收集藻细胞 ，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为14g/L，生物量产率为1.56g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为57%。蛋白含量40%以上。通过经典三氟化硼催化法(参考文献:Morrison, ff., Smith, L.Μ., 1964.Preparationof fatty acid methyl esters and dimethylacetals from lipids with boronfluoride-methanol.Journal of lipid research.5，600-608.)制备脂肪酸甲酯。生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16-C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的99wt%。
[0065]实施例4
[0066]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。
[0067]配制BG-1I培养基500mL，按10v/v%接种量接入已扩大培养的种子液。初始PH4.0，温度28°C，光照暗比12:12(白天:夜晚)，光照强度75001ux，通入0.2vvm的无菌空气(CO2含量为0.03% (v/v)，培养15天。
[0068]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为
0.8g/L，生物量产率为0.06g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为22%。蛋白含量40%以上。生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16-C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的95wt%以上请补充C16-C18的短链脂肪酸含量。
[0069]实施例5
[0070]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。
[0071 ] 配制BG-1I培养基500mL，按10v/v%接种量接入已扩大培养的种子液。初始pH5.0，温度35°C，光照暗比24:0 (白天:夜晚)，光照强度7500lux，葡萄糖添加量为20g/L，通入0.33vvm的无菌空气(CO2含量为0.03% (v/v),培养9天。
[0072]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为
5.5g/L，生物量产率为0.6g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为41%。蛋白含量40%以上。生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16-C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的99wt%。
[0073]实施例6
[0074]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。 [0075]配制BG-1I培养基500mL，按10v/v%接种量接入已扩大培养的种子液。初始PH8.0，温度10°C，光照暗比0:24(白天:夜晚)，葡萄糖添加量为20g/L，通入0.33vvm的无菌空气(CO2含量为0.03% (v/v)，培养9天。
[0076]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为
5.5g/L，生物量产率为0.61g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为43%。蛋白含量40%以上。生物柴油脂肪酸甲酯的组成主要为C16-C18的短链脂肪酸，占总脂肪酸甲酯组成的99wt%以上。
【权利要求】
1.一株美丽胶网藻株 Heynigia riparia SX01，其保藏号为:CCTCC M2013610。
2.美丽胶网藻株Heynigiariparia SXOl高密度发酵的方法,具体步骤如下: 1)种子液制备:无菌条件下挑取权利要求1所述Heynigia riparia SXOl单藻落于灭菌的BG-1l液体培养基中培养至对数生长期，获得种子液； 2)发酵培养:将步骤I)对数生长期的微藻种子液接种到灭菌的BG-1l液体培养基中进行发酵培养，发酵培养的条件为--温度10~45°C，培养基pH值4.0~11.0，光照强度2500~150001ux，光暗比为O~24:24~0，葡萄糖添加量为O~40g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，培养5~15天后发酵结束，获得发酵液。
3.如权利要求2所述的高密度发酵的方法，特征在于，步骤I)所述种子液的培养条件为:种子液培养条件为温度10~45°C，培养基初始pH值4.0~11，光照强度2500~150001ux,光暗比为O~24:24~0，葡萄糖添加量为O~40g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm。
4.如权利要求2所述的高密度发酵的方法，特征在于，步骤2)所述发酵培养的条件为:温度28°C，培养基pH值8.0，光照强度75001UX，光暗比为12:12，葡萄糖添加量为20g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.33vvm，培养9~14天后发酵结束，获得发酵产物。
5.美丽胶网藻株Heynigiariparia SXOl高密度发酵生物制品的加工工艺,工艺步骤如下: A.采用权利要求2-4任一权利要求所述美丽胶网藻株Heynigiariparia SXOl高密度发酵的方法制备获得发酵液； B.对发酵液进行固液分离，收集微藻细胞，并采用无菌BG-1l液体培养基洗涤； C.将步骤B收集的微藻细胞真空冷冻干燥获得藻粉； D.将步骤C制备的藻粉通过三氟化硼催化法制备脂肪酸甲酯。
6.权利要求1所述美丽胶网藻株Heynigiariparia SXOl在生物质能源领域的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用为美丽胶网藻HeynigiaripariaSXOl生产生物柴油的应用。
【文档编号】C12R1/89GK103952311SQ201310753830
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】缪晓玲, 巩三强 申请人:上海交通大学