一株淡水藻Chlorella sorokiniana HN01及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物质能源【技术领域】，具体涉及一株淡水小球藻株Chlorella?sorokiniana?HN01及其高密度发酵法生产小球藻营养保健品的应用。本发明保藏号为CCTCC?M2013608的淡水小球藻Chlorella?sorokiniana?HN01能够在光异养化能异养光切换培养模式下实现高密度高品质发酵，小球藻发酵藻粉生物量为6.2g/L,蛋白质含量39%，亚油酸、亚麻酸人体必须脂肪酸的含量占总脂肪酸含量的20%以上。该发明为小球藻在食品营养保健品、化妆品、医药、化工等行业的广泛应用提供了良好的藻种以及关键发酵技术，能够确保小球藻高密度高品质发酵，提升我国小球藻产业国际竞争力。
【专利说明】—株淡水藻 Ch I ore I I a sorokiniana HN01 及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物质能源【技术领域】，具体涉及一株淡水藻株Chlorellasorokiniana HNOl及其在高密度发酵法生产小球藻营养保健品中的应用。
【背景技术】
[0002]藻类是所有植物中最古老的。按色素的颜色划分可分为3类:绿藻、褐藻和红藻；根据不同的生态习性，藻类可分为浮游藻和底栖藻；藻类根据生长地域又可分为淡水藻、海藻、盐水藻、流水生藻、气生藻、土壤藻、温泉藻、冰雪藻和附生藻等；我国学者一般将藻类分为11门:蓝藻、红藻、隐藻、甲藻、金藻、黄藻、硅藻、褐藻、裸藻、绿藻、轮藻。
[0003]藻类作为世界上一种古老的物种，含有丰富的色素、人体必需微量元素、人体必需脂肪酸、人体必需氨基酸、抗氧化剂、藻类多糖、膳食纤维等微量营养元素以及留醇等重要药物前体。因此，藻类在国际领域已被广泛应用到保健品、食品、饮料、化妆品行业、饲料行业、医药行业等。尤其是蓝藻(螺旋藻)和绿藻(小球藻)因其含有丰富和独特的营养元素，得到科研工作者和消费者的青睐。
[0004]现阶段已经商业化的微藻相关产业主要集中在:有机藻粉、ω-3、6系列微藻油、胡萝卜素、虾青素、微藻生物基化妆品、微藻基生物多聚物等领域。
[0005]绿藻在显微镜发明以后才被荷兰微生物学者拜林克所发现的。绿藻除含有丰富且均衡的五大营养素(蛋白 质、维生素、微量元素、碳水化合物、多种氨基酸)外，更特别的是含有自然界中唯一的基因生物活性物质c.G.F (绿藻细胞生长促进因子)，因此，二次世界大战后，美国、德国、日本等各国相继投入绿藻的研究，并开始大量培养绿藻，制成营养保健食品销售。目前，绿藻是极受欢迎的绿色食品。随着它的各种作用不断被人们发现，用途越来越广泛。愈来愈多的人认识并接受而喜爱这种食品。此类产品的需求将不断的增大。从上个世纪五六十年代起，台湾的业者积极投入绿藻的生产事业之中，绿藻工厂最多时曾达到三十几家，每年生产超过一千公吨的绿藻产品，几乎全部外销日本及欧美国家。单是这小小的生物产品，每年就为台湾赚进约十亿元新台币。台湾本地所生产的绿藻和绿藻精产品，已经占有日本一大部分的健康食品市场。历年来，绿藻和蜂王乳的销售量，在日本健康食品市场上，一直都是排名第一和第二。
[0006]在国内市场，微藻品牌多以螺旋藻为主，目前专门生产绿藻的企业不多，多是日本、台湾品牌，如升康力牌小球藻片(日本国太阳绿藻株式会社生产)、台湾绿藻工业股份有限公司生产的绿藻粉、绿藻片、绿藻精、绿藻精粉沫等，而国内品牌很少见，江西明骏(香港实业有限公司)外，还有广东金球绿藻有限公司、江西明天科技发展有限公司、广州市三易生物技术有限公司等企业有少量绿藻生产，但是绿藻产品很少在终端零售点出现，因此绿藻制品能够很好进入市场。
[0007]小球藻由于具有特殊营养价值，因此市场价格比螺旋藻高出一倍，如同样300g的绿A螺旋藻精片价格为310元/筒，而由日本国太阳绿藻株式会社生产的升康力牌小球藻片却卖到890元/盒。预计中国小球藻的产量和质量都将会有大幅度提高。[0008]绿藻制品在将来的藻类保健品市场存在以下五大趋势:1)将有很多生产螺旋藻的企业涉足绿藻制品的开发和生产；2)专门生产绿藻的企业将日益崛起，部分企业将成为领头企业；3)绿藻的应用领域和螺旋藻一样全面涉足药品、保健品、食品、饮料、添加剂、化妆品等行业；4)绿藻产品种类、规格也将和螺旋藻产批一样日益丰富；5)绿藻和螺旋藻产品将并存占领市场，绿藻产品因其特殊的营养成分和优于螺旋藻的成分含量，其市场份额将有扩大优势。
[0009]目前，国内小球藻生产过程相对开放，难以确保批次一致性以及外源生物、水源等的污染，另外，传统小球藻培养为自养培养很难实现规模化高密度培养，处理加工过程高能耗成本较高。
【发明内容】
[0010]本发明的目 的在于克服现有技术的缺陷，提供一株优势特色淡水小球藻以及适合该小球藻的高密度高品质发酵技术，用于制备高品质小球藻营养保健品。该藻株在光切换发酵模式下，可以实现高密度发酵，并通过该发酵技术生产的小球藻藻粉植物蛋白含量高、同时还有大量人体必须的脂肪酸。该发明为小球藻在食品营养保健品、化妆品、医药、化工等行业的广泛应用提供了良好的藻种以及关键发酵技术，能够确保小球藻规模化高品质生产，提升我国小球藻产业国际竞争力。
[0011]本发明首先公开了一种小球藻株Chlorella sorokiniana HN01,其保藏号为:CCTCC M2013608。
[0012]本发明从取自河南郑州的一酸性水样中分离筛选到一株小球藻，命名为Chlorella sorokiniana HN01,该菌株已于2013年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M2013608。
[0013]在BG-1I基础营养盐培养基上培养时,该藻株圆形或卵形,直径在2~4μ m之间，每个细胞内有一个周生、杯状或片状的色素体，具有I个细胞核；细胞壁较薄。普通培养条件下，测定其蛋白含量为30-50wt%，油脂含量为22~43wt% (油脂占细胞干重)，多糖含量为5~25wt%,富含绿叶素。该菌株存在光异养化能异养光切换培养模式，细胞内可以累积大量脂滴，脂质含量最闻可达63%。
[0014]经形态学鉴定和18S rRNA, ITS-2以及rbcL扩增序列发育树分析，确定该藻株为小球藻(按照国际命名规则:属名+种名+株名对该藻株进行命名，属名、种名、株名分别为Chlorella、sorokiniana 和 HN01,因此该藻命名为 Chlorella sorokiniana HN01),命名为Chlorella sorokiniana HN01，保藏号为:CCTCC M2013608。
[0015]优选的,所述小球藻株Chlorella sorokiniana HNOl存在光诱导下营养方式的切换。
[0016]更优选的，所述光诱导下营养方式的切换为光异养化能异养光切换培养模式。
[0017]本发明Chlorella sorokiniana HNOl藻株的光异养化能异养光切换模式,是指微藻在培养过程中既添加外源碳源，又通过每天光照和黑暗条件的交替，发酵培养藻株。
[0018]优选的,所述小球藻株Chlorella sorokiniana HNOl的藻细胞内，脂质含量小于等于63wt%。
[0019]更优选的,所述小球藻株Chlorella sorokiniana HNOl的藻细胞内，脂质含量为22 ~43wt%0
[0020]最优选的，所述小球藻株Chlorella sorokiniana HNOl的藻细胞内，亚油酸及亚麻酸总量占总脂肪酸组成的20%以上。
[0021]该藻株适合培养温度和pH范围较广，适宜培养温度范围为10~45°C，适宜pH值范围为4.0~11，能够利用葡萄糖进行光异养，化能异养，以及光异养化能异养光切换培养，为首次发现能够进行光诱导下营养方式的切换，并在切换培养模式下获得高密度生物质发酵及油脂累积。
[0022]本发明第二方面公开了小球藻株Chlorella sorokiniana HNOl高密度发酵的方法，具体步骤如下:
[0023]I)种子液制备:无菌条件下挑取平板上的Chlorella sorokiniana HNOl单藻落于灭菌的BG-1l液体培养基中培养至对数生长期,获得微藻种子液；
[0024]2)发酵培养:将步骤I)对数生长期的微藻种子液接种到灭菌的BG-1l液体培养基中进行发酵培养，发酵培养的条件为:温度10~45°C，培养基pH值4.0~11，光照强度2500~150001ux，光暗比为O~24:24~0，葡萄糖添加量为O~40g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，培养5~15天后发酵结束，获得发酵液。
[0025]种子液培养条件与发酵培养条件基本相同。
[0026]优选的，步骤I)所述藻株种子液的培养条件为:温度10~45°C，培养基pH值
4.0~11，光照强度2500~150001ux，光暗比为O~24:24~0，葡萄糖添加量为O~40g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm。
[0027]优选的,步骤2)所述种子液的接种量为5~15v/v%。
[0028]本发明所述光暗比为O~24:24~0，是指光照时间为A小时，黑暗时间为B小时，A:B为O~24:24~0，并且A+B=24小时。
[0029]优选的，步骤2)所述发酵培养的条件为:温度25_35°C，培养基pH值5_8，光照强度6000~90001ux，光暗比为9~18:6~15，葡萄糖添加量为5~20g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，培养5~9天后发酵结束，获得发酵液。
[0030]更优选的，步骤2)所述发酵培养的条件为:温度28°C，培养基pH值8.0，光照强度75001UX，光暗比为12:12，葡萄糖添加量为15g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.33vvm,培养9天后发酵结束，获得发酵产物。
[0031]优选的，自养培养的发酵时间优选为14天。光异养、化能异养、光异养化能异养光切换模式下的发酵培养时间优选均为9天。光异养、化能异养、光异养化能异养光切换模式发酵培养时葡萄糖优选添加量为15g/L。
[0032]本发明第三方面公开了小球藻Chlorella sorokiniana HNOl高密度发酵生物制品的加工工艺，工艺步骤如下:
[0033]A.米用前述小球藻株Chlorella sorokiniana HNOl高密度发酵的方法制备获得发酵液；
[0034]B.将前一步骤制备的发酵液固液分离，收集微藻细胞获得藻泥；
[0035]C.将前一步 骤收集的藻泥干燥获得藻粉；
[0036]D.将前一步骤制备的藻粉通过三氟化硼催化法制备脂肪酸甲酯。
[0037]优选的，步骤B所述固液分离的方法为低速离心，离心速度为4000~15000rpm。。[0038]优选的，步骤C还包括对藻粉进行微藻生物量，微藻产率，蛋白含量以及油脂含量的检测步骤。
[0039]微藻生物量及微藻产率的检测为常规分析过程，具体方法可参考现有技术。蛋白含量的检测为将真空干燥后的藻粉采用VARIO ELIII型元素分析仪测得氮含量然后乘以蛋白平均含氮量得到蛋白质含量。油脂含量的测定为将真空干燥后的藻粉采用氯仿甲醇法分析油脂含量。
[0040] 优选的，步骤D还包括脂肪酸甲酯组成的分析，为通过气象色谱质谱技术分析脂肪酸甲酯的种类和相对含量。
[0041]本发明第四方面公开了小球藻株Chlorella sorokiniana HNOl在生物能源领域的应用。
[0042]优选的,为美丽胶网藻株Chlorella sorokiniana HNOl生产生物柴油的应用。
[0043]本发明最后一方面公开了小球藻株Chlorella sorokiniana HNOl在食品、保健品、化妆品领域的应用。
[0044]有益效果:本发明提供的淡水小球藻Chlorella sorokiniana HNOl能够在光异养化能异养光切换培养模式下实现高密度高品质发酵，小球藻发酵藻粉生物量为6.2g/L,蛋白质含量39%，亚油酸、亚麻酸人体必须脂肪酸的含量占总脂肪酸含量的20%以上。该发明为小球藻在食品营养保健品、化妆品、医药、化工等行业的广泛应用提供了良好的藻种以及关键发酵技术，能够确保小球藻高密度高品质发酵，提升我国小球藻产业国际竞争力。
[0045]本发明藻株保藏信息如下:
[0046]Chlorella sorokiniana HNOl ；
[0047]保藏号为:CCTCCM2013608
[0048]保藏日期:2013年11月27日；
[0049]保减单位名称:中国典型培养物保减中心；
[0050]保藏单位简称:CCTCC ；
保藏单位地址:武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。
【专利附图】
【附图说明】
[0051]图1:小球藻Chlorella sorokiniana HNOl的藻细胞扫描电镜照片
[0052]图2:小球藻Chlorella sorokiniana HNOl的藻细胞普通光学显微镜照片
[0053]图3:小球藻Chlorella sorokiniana HNOl的藻细胞内部脂肪滴染色显微照片
[0054]图4:生物柴油脂肪酸甲酯组成的HPLC分析
【具体实施方式】
[0055]通过以下具体实施例对本发明进行进一步的阐述，以下实施例仅用于说明，而不用于限制本发明的保护范围。
[0056]本发明通过筛选获得了一株优良富油新藻种，该藻种可以通过营养方式切换实现高密度生物质发酵及脂质累积，为微藻生物柴油的工业化生产提供了新藻藻种及新技术。
[0057]实施例1
[0058]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌BG-1l培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期获得微藻种子液。
[0059]配制BG-1l培养基500mL，按15v/v%接种量接入已扩大培养的微藻种子液。初始PH4.0，温度28°C，光暗比12:12(白天:夜晚)，光照强度150001ux，葡萄糖添加量2g/L，通入0.2vvm的无菌空气，培养14天。
[0060]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为700mg/L,生物量产率为50mg/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为22%。蛋白含量40%以上，亚油酸亚麻酸占总脂肪酸组成的40%以上，脂肪酸甲酯组成的HPLC图谱如图4所示。
[0061]实施例2
[0062]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。
[0063]配制BG-1l培养基500mL，按5v/v%接种量接入已扩大培养的细胞培养液。初始ρΗ8.0，温度28°C，光暗比12:12(白天:夜晚)，光照强度75001ux，葡萄糖添加量15g/L,通入0.33vvm的无菌空气(C02含量为0.03% (v/v),培养9天。
[0064]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为
6.2g/L，生物量产率为0.67g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为43%。蛋白含量38%以上，亚油酸亚麻酸占总脂肪酸组成的20%以上，微藻细胞的扫描电镜照片、光学显微镜照片，以及脂肪滴染色照片见图1-3。
[0065]实施例3
[0066]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。
[0067] 配制BG-1l培养基500mL，接入已扩大培养的微藻细胞。初始pHll.0，温度45°C，光照暗比12:12(白天:夜晚)，光照强度25001UX，葡萄糖添加量15g/L,通入0.33vvm的无菌空气(C02含量为0.03% (v/v)，培养5天。
[0068]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为
4.4g/L，生物量产率为0.49g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为31%。蛋白含量40%以上，亚油酸亚麻酸占总脂肪酸组成的20%以上。
[0069]实施例4
[0070]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期以1:10接种比例扩大培养。
[0071]配制BG-1l培养基，接入已扩大培养的微藻种子液。初始pH7.0，温度10°C，光暗比O:24(白天:夜晚)，葡萄糖添加量40g/L,通入0.33vvm的无菌空气,培养9天。
[0072]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉干重并计算。藻粉生物量浓度为
5.lg/L，生物量产率为0.57g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为29%，蛋白含量40%以上，亚油酸亚麻酸占总脂肪酸组成的20%以上。
[0073]实施例5
[0074]无菌条件下在固体平板上挑取单藻落到含有30ml灭菌培养液的100mL三角瓶中，于光照培养架静置培养，温度28°C，光照强度75001UX，光暗比12:12，培养时间12天，生长到指数末期获得种子液。
[0075]配制BG-1I培养基500mL，按10v/v%接种量接入已扩大培养的种子液。初始PH8.0，温度28°C，光照暗比24:0(白天:夜晚)，光照强度7500lux，通入0.33vvm的无菌空气(C02含量为0.03% (v/v)，培养15天。
[0076]离心收集藻细胞，真空冷冻干燥器干燥，称藻粉并计算干重。藻粉生物量浓度为
0.7g/L，生物量产率为0.05g/L/d，氯仿甲醇法测定油脂含量为28%。蛋白含量30%以上。亚油酸亚麻酸占总脂肪酸 组成的20%以上。
【权利要求】
1.一种小球藻株 Chlorella sorokiniana HN01，其保藏号为:CCTCC M2013608。
2.小球藻株Chlorellasorokiniana HNOl高密度发酵的方法,具体步骤如下: . 1)种子液制备:无菌条件下挑取权利要求1所述Chlorellasorokiniana HNOl单藻落于灭菌的BG-1l液体培养基中培养至对数生长期，获得微藻种子液； . 2)发酵培养:将步骤I)对数生长期的微藻种子液接种到灭菌的BG-1l液体培养基中进行发酵培养，发酵培养的条件为--温度10~45°C，培养基pH值4.0~11，光照强度2500~.150001ux,光暗比为O~24:24~0，葡萄糖添加量为O~40g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~lvvm，培养5~15天后发酵结束，获得发酵液。
3.如权利要求2所述的高密度发酵的方法，其特征在于，步骤I)所述藻株种子液的培养条件为:温度10~45°C，培养基pH值4.0~11，光照强度2500~150001ux，光暗比为.O~24:24~0，葡萄糖添加量为O~40g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.2~Ivvm0
4.如权利要求2所述的高密度发酵的方法，其特征在于，步骤2)所述发酵培养的条件为:温度28°C，培养基pH值8.0，光照强度75001UX，光暗比为12:12，葡萄糖添加量为15g/L，培养过程中通入无菌空气，通气量为0.33vvm,培养9天后发酵结束，获得发酵产物。
5.小球藻Chlorellasorokiniana HNOl高密度发酵生物制品的加工工艺，工艺步骤如下: A.采用权利要求2-4任一权利要求所述小球藻株Chlorellasorokiniana HNOl高密度发酵的方法制备获得发酵液； B.将前一步骤制备的发酵液固液分离，收集微藻细胞获得藻泥； C.将前一步骤收集的藻泥干燥获得藻粉； D.将前一步骤制备的藻粉通过三氟化硼催化法制备脂肪酸甲酯。
6.权利要求1所述小球藻株Chlorellasorokiniana HNOl在生物质能源领域的应用。
7.权利要求1所述小球藻株Chlorellasorokiniana HNOl在食品、保健品、化妆品领域的应用。
【文档编号】C12R1/89GK103952313SQ201310753839
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】缪晓玲, 巩三强 申请人:上海交通大学