一种制备脂肪酸胶体溶液应用于隐甲藻生产二十二碳六烯酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备脂肪酸胶体溶液应用于隐甲藻生产二十二碳六烯酸的方法，其利用人工方式制造脂肪酸胶体溶液，并应用到隐甲藻异养培养，可以明显提高多不饱和脂肪酸的产量。本发明采用特定的超声波乳化方法将脂肪酸前体成分处理成微米-纳米级别的颗粒分散于培养液中，脂肪酸稳定存在于溶液中，不出现分层、聚集或沉降现象，并供给到培养体系中，隐甲藻连续发酵数天，培养的微藻油脂的积累速度和长链脂肪酸的比例明显上升，技术方法易于实现，适用于异养微藻的人工培养。
【专利说明】一种制备脂肪酸胶体溶液应用于隐甲藻生产二十二碳六烯酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种能合成二十二碳六烯酸的异养微藻隐甲藻，特别是利用人工乳化法制备脂肪酸胶体溶液的制备方法，利用本微藻并添加人工胶体溶液生产多不饱和脂肪酸的生产方法。
【背景技术】
[0002]二十二碳六烯酸(DHA)属于多不饱和脂肪酸(PUFAs)的一种，是动物细胞膜磷脂的重要组成成分，决定了细胞膜的流动性和变形性。对多种疾病和某些癌症的预防和治疗有重要作用，足量的PUFAs的摄入对胎儿和幼儿视觉和神经的发育至关重要。欧美国家现在对于DHA的应用较为广泛，主要应用于食品和保健药品中。在食品中的应用包括婴儿奶粉、牛奶、奶酪、食用植物油脂、烘焙油脂等，消费者对于DHA的认知度和认可度也比较高。当前食品工业上使用的二十二碳六烯酸多属于从海洋捕捞的鱼类的鱼油中获得，此法成本高昂，且原料品质受环境因素影响较大。有少量来自海洋微藻，多数为国外公司垄断，我们选用采用的微藻隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)为异养型微藻,无需光照培养,工程化培养实现简单，培养方式接近常规工业发酵，便于利用原有设备和技术工艺。而其DHA积累含量高，一般能达到总脂的30-50%，而且其他多不饱和脂肪酸的含量在1%以下，特别是不含EPA，使用安全。目前国际上已有利用的先例，如美国MARTECK公司推出的孕产妇用DHA胶囊已获美国FDA食品认证，业界有利用微藻的自养作用在光培养反应器中合成多不饱和脂肪酸，但自养培养设备复杂，产出率低。且藻液内含有效成分浓度低，不利于下游分离纯化。
[0003]长链脂肪酸的积累过程积累缓慢，规模化生产过程周期较长，生产成本较高。异养培养微藻生长缓慢，如何提高菌体密度，缩短发酵时间，是核心技术难题之一，一个解决办法是发酵原料中投加长链脂肪酸代谢合成前体，缩短合成步骤和时间，但中长链脂肪酸都为脂溶性物质，不能溶解于水溶液，作为发酵底物加入反应器中，影响传质和溶氧，限制了其应用范围。本发明致力于实现脂肪酸在水溶液中稳定分散的实用方法，使微藻在人工培养体系中可利用低价值长链脂肪酸底物。以提高多不饱和脂肪酸的产量和合成效率。通过解决这一关键问题来缩短发酵周期，提高生产效率。
[0004]在天然水体中的胶体物质与水体中的生态系统联系紧密，源于自然界浮游生物释放的含碳有机物(如细胞溶解、浮游生物摄食、颗粒有机物的降解、陆地水流运输等)在自然水体中的胶体含量可达IO7-1O9个/ml，是海水中最丰富的颗粒物，胶体可作为更大颗粒聚集的核心，影响海洋中各种沉积过程。胶体表面不仅仅是光化学反应位，颗粒表面特征可以控制和影响自由态和吸附态离子在海水中的分配及行为。巨大的比表面积使其作为营养盐、有机碳、微量元素、痕量有机物的良好载体，是真溶液和颗粒之间的中介，其特殊的物理化学属性日益引起生态研究者关注。但在人工生物反应器中和人工培养条件下利用胶体的生物效应的创新应用未见实用化技术的公布或报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种制备脂肪酸胶体溶液应用于隐甲藻生产二十二碳六烯酸的方法，该方法基于胶体溶液生态学效应制备微-纳米量级的脂肪酸的胶体溶液体系，其制备原理为:水溶液的温度控制在脂肪酸的熔点以上，液态脂肪酸在超声波对空化作用下解体与水混合成纳-微尺度的胶体溶液。分散相粒子尺度小到临界点之后，不易重新聚集，自然形成稳定状态，使脂肪酸在培养液中以更容易吸收的状态被微藻代谢利用，应用于微藻异养培养，能提高隐甲藻油脂含量和长链多不饱和脂肪酸比例。
[0006]本发明实现的技术方案为:
[0007]一种制备脂肪酸胶体溶液应用于隐甲藻生产二十二碳六烯酸的方法，包括以下步骤:
[0008](I)按质量比1:8-25将液体或固体状态的长链脂肪酸和水混和均匀，再添加1-3%的表面活性剂，缓慢加热至80-90°C，然后使用通用型超声发生器装置，变幅杆直径控制在5-6_，震荡容器底部放入适量的玻璃珠辅助乳化，玻璃珠以单层铺满容器底部为宜，不得让变幅杆与容器壁直接接触，变幅杆距离容器底部20-30mm，超声换能装置功率设置为100-150W,多次短时间间隔乳化，每次工作3秒间隔2秒，超声震荡处理1-2分钟，溶液的温度控制在90-95°C，脂肪酸胶体溶液制备完成后封装，在121°C温度下灭菌20分钟后备用；
[0009](2)将上述灭菌后的脂肪酸胶体溶液在隐甲藻发酵起始培养时加入到培养基中，也可在发酵培养过 程中流加使用，其余培养步骤和方法与常规微生物和异养微藻的培养过程相同，发酵结束后测量生物量，总油脂含量，长链脂肪酸在总油脂中的比例，DHA在油脂中含量的比例。
[0010]所述的长链脂肪酸选自链长介于十碳到二十碳之间的偶数脂肪酸。
[0011]所述的表面活性剂选自离子表面活性剂或非离子表面活性剂，主要用作0/W型辅助乳化剂。
[0012]本发明的有益效果:
[0013]1、有效提高脂肪酸的利用率，减少脂溶成份对发酵体系氧传递的不良影响；
[0014]2、操作便利、可利用现有设备、此方法所制备的材料存在稳定，重现性好；
[0015]3、制备成本低、添加方式灵活、与现有发酵工艺结合方便；
[0016]4、能显著降低发酵周期和发酵成本，提高产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为通用型超声发生器装置，其中，1.换能器，2.变幅杆，3.容器，4.玻璃珠。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
[0019]以乳化后的棕榈酸作为发酵添加物
[0020]棕榈酸(分子式=C16H32O2)常温下为白色带有珠光的鳞片状固体，不溶解于水，直接作为底物添加不易被微藻吸收，也是合成二十二碳六烯酸(DHA)的前体物质。
[0021]取500毫升水,加入固态棕榈酸25克,再添加Tween80试剂8毫升。添加物浓度低起不到乳化效果，浓度高也会造成胶体体系不稳定。缓慢加热至90°C，使用通用型超声发生器装置，变幅杆直径在6_左右，震荡容器底部放入适量玻璃珠(5克)辅助乳化，不得让变幅杆与容器壁直接接触，变幅杆距离容器底部20-30mm，超声换能装置功率设置为120W (过程参看附图1)。空化过程中热效应引发温度过高而使体系沸腾，多次短时间间隔乳化(工作3秒间隔2秒)。超声震荡处理I分钟，溶液的控制温度范围为90-95°C，处理过程中温度不得低于90°C，过热易造成沸腾及溶液混和不匀，出现沉淀或聚团。脂肪酸胶体溶液制备完成后封装在三角瓶中高温灭菌(121°C，20分钟)处理后备用。
[0022]藻种:隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii ATCC30556)
[0023]种子培养基:葡萄糖:9g/L，酵母膏:3g/L，海盐:25g/L，
[0024]发酵培养基:葡萄糖:50g/L，酵母膏:6g/L，海盐:25g/L，
[0025]培养温度:25 °C pH值均调到6左右。
[0026]种子液接种后培养72小时后，种子液按10%的接种量接入到盛有100mL发酵培养基的500ml三角瓶中，另外无菌操作每瓶加入棕榈酸胶体溶液30毫升(对照组不添加)，摇床转速150转，培养温度为25°C，培养240个小时后发酵结束。发酵结束后测量生物量，总油脂含量，长链脂肪酸在总油脂中的比例，DHA在油脂中含量的比例。
[0027]DHA在总油中含量测量方法:
[0028]取IOOmg油脂样品，置于IOOmL的磨口烧瓶中，加入0.5mol/L的KOH甲醇溶液2mL，于60°C水浴30min进行皂化，冷却后加入2mL三氟化硼-甲醇(体积比为1:1)溶液，60°C水浴30min，冷却后加入5mL正己烷振荡，然后加入5mL饱和食盐水，静置分层后取上层正己烷相，抽取上层可直接进样。
[0029]油脂气相色谱分析方法:
[0030]岛津GC-14C气相工作站；色谱柱:安捷伦DB_23(60M)，载气:氮气。检测器:氢火焰离子化检测器。分流比1:50。进样口温度200°C，检测器温度250°C，进样量I μ L。采用程序升温，140°C保持3分钟，IO0C /分钟升温，升温至250°C，保持15分钟。使用内标积分面积法计算油脂中脂肪酸含量比例。
[0031]藻种细胞干重的测定
[0032]100毫升藻细胞液过滤后装入预先称重平衡的离心管中，4000转/分钟离心10分钟，沉淀后用蒸馏水清洗3次，50°C下真空干燥，定期取出，在干燥器内冷却后称重，直至恒重(DC)。
[0033]对照组培养方法除未添加脂肪酸胶体溶液，其他实验步骤和方法同上。
[0034]统计总油脂积累量和长链脂肪酸的含量比例结果如下表:
[0035]
【权利要求】
1.一种制备脂肪酸胶体溶液应用于隐甲藻生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于包括以下步骤: (O按质量比1:8-25将液体或固体状态的长链脂肪酸和水混和均匀，再添加1-3%的表面活性剂，缓慢加热至80-90°C，然后使用通用型超声发生器装置，变幅杆直径控制在5-6_，震荡容器底部放入适量的玻璃珠辅助乳化，玻璃珠以单层铺满容器底部为宜，不得让变幅杆与容器壁直接接触，变幅杆距离容器底部20-30mm，超声换能装置功率设置为100-150W,多次短时间间隔乳化，每次工作3秒间隔2秒，超声震荡处理1-2分钟，溶液的温度控制在90-95°C，脂肪酸胶体溶液制备完成后封装，在121°C温度下灭菌20分钟后备用； (2)将上述灭菌后的脂肪酸胶体溶液在隐甲藻发酵起始培养时加入到培养基中，也可在发酵培养过程中流加使用，其余培养步骤和方法与常规微生物和异养微藻的培养过程相同，发酵结束后测量生物量，总油脂含量，长链脂肪酸在总油脂中的比例，DHA在油脂中含量的比例。
2.根据权利要求1所述的制备脂肪酸胶体溶液应用于隐甲藻生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，所述的长链脂肪酸选自链长介于十碳到二十碳之间的偶数脂肪酸。
3.根据权利要求1所述的制备脂肪酸胶体溶液应用于隐甲藻生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，所述的表面活性剂选自离子表面活性剂或非离子表面活性剂，主要用作0/W型辅助乳化剂。
【文档编号】C12P7/64GK103898173SQ201410004085
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】姚黎明, 肖尚, 陈祥松, 吴金勇, 姚建铭 申请人:中国科学院等离子体物理研究所