一种产超高光学纯度r,r-2,3-丁二醇基因工程菌及其构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种产R,R-2,3-丁二醇基因工程菌及其构建方法与应用，该基因工程菌株的命名为重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044--dar-。dar为丁二酮还原酶基因，通过同源重组双交换，敲除多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中的dar基因获得菌株重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044-dar-。通过上述方法构建的重组菌能发酵合成超高光学纯度R,R-2,3-丁二醇，光学纯度高达100%，无光学副产物meso-2,3-丁二醇，该菌株能直接利用菊芋菊粉、葡萄糖、3-羟基丁酮等底物，培养条件粗放，操作方便简单，光学纯度高，生产成本低，有利于大规模产业化生产。
【专利说明】—种产超高光学纯度R, R-2, 3- 丁二醇基因工程菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工领域，具体涉及一种产超高光学纯度(≥99.9%) R, R-2, 3_ 丁二醇基因工程菌及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]2，3- 丁二醇属于典型的生物基化学品，存在3个旋光异构体，分别为R，R型(D型)、S，S型(L型)和meso型(内消旋型LR，R-2, 3-丁二醇是一种新兴的微生物四碳手性醇，具有独特的光学等理化性质。超高光学纯度O 99.9%)的R，R-2, 3-丁二醇可用于合成丁三醇-对甲苯磺酸酯，丁三醇-对甲苯磺酸酯是合成药物阿司匹林的关键中间体。超高光学纯度的R，R-2, 3- 丁二醇还可以用于合成光学活性的2-甲基-1，4- 丁二醇，2-甲基-1，4- 丁二醇及其衍生物是合成各种手性近晶型聚酯液晶材料及手性天然生物活性物质的重要中间体。随着R，R-2, 3- 丁二醇的发酵技术不断提高和完善，超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇在手性产品的合成路线改进和新型手性产品的开发等手性合成领域中的作用日趋显著。此外，R, R-2, 3- 丁二醇还是优良的抗冻剂(R，R-2, 3- 丁二醇的凝固点低达_60°C )，添加到液体燃料里，燃料在_40°C也不会凝固。
[0003]化学法合成超高光学纯度手性R，R-2, 3- 丁二醇，除需特殊的合成路径，还需手性拆分，手段尤为复杂，难以实现大规模的工业化生产。自然界某些酵母菌(Saccharomycescerevisiae)虽然能够体内代谢合成R，R-2, 3_ 丁二醇，但由于发酵制备R，R-2, 3- 丁二醇产量极低(最高产量大约0.09g L—1)，缺乏实际应用价值，因此，一些特殊的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa,也称Bacillus polymyxa)是目前唯一具备工业化生产R，R-2, 3- 丁二醇潜力的微生物。
[0004]P.polymyxa代谢合 成R, R-2, 3_ 丁二醇时，总是伴随合成少量的meso-2，3_ 丁二醇，且pH、溶氧、底物的流加速率等外源发酵条件的变动常导致副产物的meso-2，3- 丁二醇的含量发生明显变化。在发酵液中，R，R-2, 3-丁二醇的光学纯度约为90-98%，meso-2，3-丁二醇的光学纯度约为2-10%。当R，R_2，3-丁二醇用于手性产品的合成时，一般要求其应达到99.9%以上的超高光学纯度，否则将不适合制备手性物质。通过优化发酵工艺条件，虽然能提高R，R-2, 3- 丁二醇的光学纯度，但是光学纯度仍难达到99.9%以上这个标准，且常常引起R，R-2, 3- 丁二醇产量下降。而用手性分离法提取R，R-2, 3- 丁二醇时，存在操作繁琐，难度大，成本高等缺陷，导致R，R-2, 3- 丁二醇的市场价格居高不下，极大地限制了R, R-2, 3- 丁二醇的工业化应用。
【发明内容】
[0005]发明目的:为了克服现有技术中存在的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种产超高光学纯度O 99.9%) R, R-2, 3- 丁二醇基因工程菌。
[0006]本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌的构建方法。
[0007]本发明最后要解决的技术问题是提供上述产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌的应用。
[0008]技术方案:为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0009]一种产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌，该工程菌是通过下列方法构建得到:利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中扩增出丁二酮还原酶基因dar，5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带入如(1同源重组序列克隆粘粒5即虹(:08-1/PIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“dar同源臂1-oriT-ApraK_dar同源臂II”序列的重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790_dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II ”,重组粘粒转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，并在λ Red介导下与多粘类芽孢杆菌CGMCC3044发生同源重组双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar_。
[0010]其中，SuperCos_l/pIJ790中 SuperCos-1 为粘粒；质粒 pIJ790 携带 λ Red 同源重组序列、oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK等序列。
[0011]该基因工程菌通过下列方法构建得到:
[0012](I)基因dar的克隆:根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌ATCC12321中dar基因的序列设计合成PCR所需的引物:
[0013]Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3’
[0014]P2:5’ -CTGT`GGGTTGGTTGTCCAAAT-3’
[0015]以多粘类芽孢杆菌CGMCC3044基因组为模板完成PCR反应:PCR反应条件:94°C变性 5min，经 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，共 32 个循环，再经过 72°C延伸 lOmin，获得的 PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，获得来源于多粘类芽孢杆菌CGMCC3044的丁二酮还原酶基因，即dar基因；
[0016](2)重组粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT_ApraK-dar 同源臂 II ” 的构建:在dar的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I,Xho I，得到dar同源臂I ;在dar的3，端20bp碱基序列的两端分别引入Not I,BamH I,得到dar同源臂II ;将上述dar同源臂I和dar同源臂II分别连接至携带ARed同源重组序列的克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“dar同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II” 序列的重组粘粒 SuperCos_l/pIJ790 ；
[0017](3)重组基因工程菌的获得:将重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790-dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II ”转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽孢杆菌，命名为CGMCC3044-dar_。
[0018]其中，该方法包括下列步骤:利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中扩增出丁二酮还原酶基因dar，5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带ARed同源重组序列克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端,得到含“dar同源臂1-oriT-ApraK-dar同源臂II ”序列的重组粘粒SuperCos_l/pIJ790,重组粘粒转化CGMCC3044，并在λ Red介导下与宿主菌发生同源重组双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar_。
[0019]其中，上述产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌的构建方法包括下列步骤:(1)基因dar的克隆:根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌ATCC12321中dar基因的序列设计合成PCR所需的引物:
[0020]Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3’
[0021]P2:5’ -CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT-3’
[0022]以多粘类芽孢杆菌CGMCC3044基因组为模板完成PCR反应:PCR反应条件:94°C变性 5min，经 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，共 32 个循环，再经过 72°C延伸 lOmin，获得的 PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，获得来源于多粘类芽孢杆菌CGMCC3044的丁二酮还原酶基因，即dar基因；
[0023](2)重组粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II ” 的构建:在dar的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I,Xho I，得到dar同源臂I ;在dar的3，端20bp碱基序列的两端分别引入Not I,BamH I,得到dar同源臂II ;将上述dar同源臂I和dar同源臂II分别连接至携带ARed同源重组序列的克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“dar同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II” 序列的重组粘粒 SuperCos_l/pIJ790 ；
[0024](3)重组基因工程菌的获得:将重组粘粒“SuperCos-l/pI J790_dar同源臂
1-oriT-ApraE-dar同源臂I I ”转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽孢杆菌，命名为CGMCC3044-dar_。
[0025]上述的产超高光学纯度R，R-2，3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044_dar_在生产R, R-2, 3-丁二醇中的应用。
[0026]上述应用，将构建的基因工程菌CGMCC3044_dar_接种于含碳源、氮源和无机盐的无菌培养基中进行培养，发酵生产超高光学纯R，R-2, 3- 丁二醇，其中，所述碳源为未经任何水解处理的菊芋菊粉粗提液。
[0027]上述的应用，该基因工程菌直接以菊芋菊粉粗提液为底物生产超高光学纯度R, R-2, 3- 丁二醇，具体生产工艺为:
[0028](I)出发菌株:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044-dar_ ；
[0029](2)种子培养基:(NH4) 2ΗΡ040.5-2.0g/L, KC10.10-0.3g/L, MgSO4.7Η200.1-0.3g/L,酵母膏0.l-0.3g/L，葡萄糖2.0-8.0g/L,菊芋菊粉粗提液含菊粉1.0-3.0g/L,阿泊拉霉素20-40 μ g/mL ；
[0030]种子培养:1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30-37 °C，摇床转速120-200rpm，培养 12_36h ；
[0031](3)发酵培养:培养基组成:菊芋菊粉粗提液含菊粉20.0-60.0g/L,(NH4)2HPO40.5-2.0g/L, KC10.10-0.3g/L, MgSO4.7Η200.1-0.3g/L，酵母膏 3.0-8.0g/L,阿泊拉霉素 20-40 μ g/mL ；
[0032]培养条件:接种量10v/v%，发酵温度30_37°C，pH6.0-8.0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h,控制转速240-320rpm,发酵24h后,控制转速80_160rpm,维持微氧环境发酵，摇瓶发酵，或批式发酵，或分批补料发酵，流加补料菊粉维持菊粉浓度在30.0±1.0g/L,补料后底物共约60-120g/L。
[0033]其中，本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株为能产菊粉酶的多粘芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa) CGMCC N0.3044,目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，登记入册的编号是CGMCC N0.3044，保藏日期是:2009年4月29日。以此菌作为出发菌株。该菌株相应的专利的申请日为2009年6月I日，专利号为ZL200910026807.1。
[0034]有益效果:
[0035]本发明在于提供一种新型基因工程菌，用于发酵产超高光学纯度O 99.9%)R，R-2, 3- 丁二醇，该菌在微氧条件下直接利用未经处理的菊芋菊粉粗提液高效发酵产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇，突破了传统发酵难以获得超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇和低效率生产超高光学纯度R，R_2，3-丁二醇的局限。研究发现能够代谢合成R，R-2, 3- 丁二醇的菌种在菌体内通过氧化还原酶系将前体化合物即羰基化合物逐步还原成R，R-2, 3- 丁二醇(光学纯度约为90-98%)过程中，总是伴随合成光学纯度约为2-10%的副产物meso-2，3- 丁二醇，通过控制溶氧、添加还原性物质、调节pH等优化发酵工艺条件，R, R-2, 3- 丁二醇仍难达到99.9%以上超高光学纯度，从而无法用于制备手性液晶材料等手性产品，而进一步用手性拆分法制备R，R-2, 3- 丁二醇，存在操作繁琐，难度大，成本高，产量低等缺陷，上述因素导致R，R-2, 3- 丁二醇的市场价格居高不下，极大地限制了 R，R-2，3-丁二醇的工业化应用。与原始多粘类芽孢杆菌相比，重组菌株发酵液中R，R-2, 3-丁二醇的光学纯度可达100%，且产量也得到了明显提高。与目前文献所报道发酵后利用手性拆分生产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇方法相比，不仅重组菌产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇稳定性和产物浓度均较高，而且发酵后无需手性拆分等分离手段即可获得100%的超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇，显著地减低了分离成本和提高了生产效益，为微生物发酵法工业化生产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇奠定了良好的基础。
【具体实施方式】
`[0036]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0037]实施例1:
[0038]菊芋菊粉粗提液的制备方法:
[0039]新鲜的菊芋洗净去皮，热烫灭酶(100°C，15min)后切成薄片，70°C下鼓风干燥，然后粉碎过80目筛制得菊芋粗粉，冰箱保存备用。按照1:6的比例称取菊芋粗粉放入水中搅拌均匀后，70°C水浴加热浸提4h，用石灰乳调节pH为9，然后80°C水浴保温lh，用纱布过滤后即可得菊芋菊粉粗提液。
[0040]实施例2:基因dar的克隆:
[0041]根据Genebank 公布的多粘类芽抱杆菌(paenibacillus polymyxa) ATCC12321 中dar基因的序列设计合成PCR所需的引物:
[0042]Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3’[0043]P2:5’ -CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT-3’
[0044]以多粘类芽孢杆菌CGMCC3044基因组为模板完成PCR反应；PCR反应条件:94°C变性 5min，94°C 30s ；56°C 30s ；72°C lmin 共 32 次循环，72°C延伸 lOmin，获得的 PCR 产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与PMD18-T载体连接，进行序列测定，获得来源于多粘类芽孢杆菌CGMCC3044的丁二酮还原酶基因dar。
[0045]实施例3:重组粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂II”的构建:
[0046]在dar的5’端约39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I,Xho I,得到dar同源臂
I;在dar的3’端约20bp碱基序列的两端分别引入Not I,BamH I，得到dar同源臂II。根据所述酶切位点将上述dar同源臂I和dar同源臂II分别连接至携带λ Red同源重组序列的连接至克隆粘粒SuperCos-l/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含“dar同源臂1-oriT-ApraK-dar同源臂II”序列和λ Red序列的重组粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraR_dar 同源臂 II”。
[0047]实施例4:重组粘粒 “SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂
II”转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044。
[0048]将重组粘粒“SuperCos-l/pIJ790_dar同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II”转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽孢杆菌，命名为CGMCC3044-dar_。
[0049]实施例5:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044_dar_中丁二酮还原酶酶活测定
`[0050](I)出发菌株:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044-dar_
[0051](2)所用培养基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，阿泊拉霉素40 μ g/mL,ρΗ6.0
[0052](3)酶活测定方法:酶活力测定的基本反应体系(200 μ L)组成:200mmol/L磷酸钾 ρΗ6.0177 μ L，酶液 10 μ L，5.3mmol/L丁二酮 10 μ L, 14.2mmol/L NADPH (NADP+) 3 μ L，37°C反应5min后，测定lmin内340nm处吸光度的变化率。一个酶活力单位(U)定义为IminNADPH减少(增加)的ymoL数量。酶粗提液的制备如下:将发酵液离心所得的菌体用生理盐水(0.85%NaCl)洗涤两次后重悬于pH8.050mmol/L磷酸钾中，在300W，30min，超声2s，停4s进行超声破碎，冰浴保护，8500rpm低温离心30min，上清液即为酶粗提液。蛋白浓度用Bradford法检测，以牛血清蛋白作为标准品。
[0053]考察结果:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044_dar_中丁二酮还原酶酶活为O。
[0054]对比例1:原始菌株多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中丁二酮还原酶酶活测定
[0055](I)出发菌株:多粘类芽孢杆菌CGMCC3044
[0056](2)所用培养基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，ρΗ6.0
[0057](3)酶活测定方法:酶活力测定的基本反应体系(200 μ L)组成:200mmol/L磷酸钾 ρΗ6.0177 μ L，酶液 10 μ L，5.3mmol/L丁二酮 10 μ L, 14.2mmol/L NADPH (NADP+) 3 μ L，37°C反应5min后，测定lmin内340nm处吸光度的变化率。一个酶活力单位(U)定义为IminNADPH减少(增加)的ymoL数量。酶粗提液的制备如下:将发酵液离心所得的菌体用生理盐水(0.85%NaCl)洗涤两次后重悬于pH8.050mmol/L磷酸钾中，在300W，30min，超声2s，停4s进行超声破碎，冰浴保护，8500rpm低温离心30min，上清液即为酶粗提液。蛋白浓度用Bradford法检测，以牛血清蛋白作为标准品。
[0058]考察结果:原始菌株多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中丁二酮还原酶酶活为0.239U/
mg ο
[0059]实施例6:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044_dar_直接利用菊芋菊粉粗提液在摇瓶中发酵产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇
[0060](I)出发菌株:paenibacillus polymyxa CGMCC3044-dar_ ；
[0061](2)种子培养基(g/L): (NH4)2HPO4L 0,KC10.2,MgSO4.7H200.1，酵母膏 0.2，葡萄糖5.0，菊芋菊粉粗提液含菊粉2.0,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；
[0062]种子培养:1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30°C，摇床转速120rpm，培养22h ；
[0063](3)发酵培养:培养基组成(g/L):菊粉粗提液含菊粉60.0，(NH4)2HPO4LO,KC10.10，MgSO4.7Η200.1，酵母膏 6.0，阿泊拉霉素 30 μ g/mL ；
[0064]培养条件:接种量10v/v%，发酵温度30°C，pH6.0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h,控制转速240rpm,发酵24h后,控制转速160rpm,维持微氧环境发酵，发酵时间42h。
[0065]发酵结果:菊芋菊粉粗提液中含60.0g/L的菊粉，经发酵得到24.4g/L的R, R-2, 3- 丁二醇，光学纯 度 100%。
[0066]对比例2:原始菌多粘类芽孢杆菌CGMCC直接利用菊芋菊粉粗提液在摇瓶中发酵产 R，R-2, 3- 丁二醇
[0067](I)出发菌株:多粘类芽孢杆菌CGMCC3044 ；
[0068](2)种子培养基(g/L): (NH4)2HPO4L 0,KC10.2,MgSO4.7H200.1，酵母膏 0.2，葡萄糖5.0，菊粉 2.0 ；
[0069]种子培养:1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30°C，摇床转速120rpm，培养22h ；
[0070](3)发酵培养:培养基组成(g/L):菊粉粗提液含菊粉60.0，(NH4)2HPO4LO,KC10.10，MgSO4.7Η200.1，酵母膏 6.0 ；
[0071]培养条件:接种量10ν/ν%，发酵温度30°C，pH6.0，控制氧气的通入量，摇床转速120rpm,维持微氧环境发酵即可，发酵时间42h。
[0072]发酵结果:菊芋菊粉粗提液中含60.0g/L的菊粉，经发酵得到20.7g/L的R, R-2, 3- 丁二醇，光学纯度 98.0%。
[0073]实施例7:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044_dar_直接利用菊芋菊粉粗提液在5L发酵罐中批式发酵生产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇
[0074](I)出发菌株:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044_dar_ ；
[0075](2)种子培养基(g/L): (NH4)2HPO4L 0,KC10.2,MgSO4.7H200.1，酵母膏 0.2，葡萄糖5.0，菊粉2.0,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；
[0076]种子培养:1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30°C，摇床转速120rpm，培养22h ；
[0077](3)发酵培养:培养基组成(g/L):酵母膏 6.0，(NH4)2HPO4L O, KC10.10，MgSO4.7H200.1，菊粉粗提液含菊粉60.0,阿泊拉霉素30 μ g/mL ；
[0078]培养条件:5L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10v/v%,发酵温度30°C，pH6.0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h，控制转速240rpm，发酵24h后，控制转速120rpm，维持微氧环境发酵，发酵时间42±lh。
[0079]发酵结果:底物约为60.0g/L的菊粉，经发酵得到26.2g/L的R，R-2, 3_ 丁二醇，光学纯度100%。
[0080]对比例3:原始多粘类芽孢杆菌CGMCC3044直接利用菊芋菊粉粗提液在5L发酵罐中批式发酵生产R，R-2, 3- 丁二醇
[0081](I)出发菌株:多粘类芽孢杆菌CGMCC3044 ；
[0082](2)种子培养基(g/L): (NH4)2HPO4L 0,KC10.2,MgSO4.7H200.1，酵母膏 0.2，葡萄糖5.0，菊粉 2.0 ；
[0083]种子培养:1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30°C，摇床转速120rpm，培养22h ；
[0084](3)发酵培养:培养基组成(g/L):酵母膏 6.0，(NH4)2HPO4L 0，KC10.10，MgSO4.7H200.1，菊粉粗提液含菊粉60.0 ；
[0085]培养条件:5L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10v/v%,发酵温度300C，pH6.0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h，控制转速240rpm，发酵24h后，控制转速120rpm，维持微氧环境发酵，发酵时间42±lh，。
[0086]发酵结果:底物约为60.0g/L的菊粉，经发酵得到22.lg/L的R，R-2，3_ 丁二醇，光
学纯度98.8%。
`[0087]实施例8重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044_dar_直接利用菊芋菊粉粗提液在5L发酵罐中分批补料发酵生产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇
[0088](I)出发菌株:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044-dar_ ；
[0089](2)种子培养基(g/L): (NH4)2HPO40.5,KC10.LMgSO4.7Η200.3，酵母膏 0.1，葡萄糖2.0，菊粉1.0，阿泊拉霉素30 μ g/mL ；
[0090]种子培养:1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度37°C，摇床转速200rpm，培养12h ；
[0091](3)发酵培养:培养基组成(g/L):酵母膏 3.0，(NH4)2HPO40.5，KC10.2，MgSO4.7H200.2，菊粉粗提液含菊粉20.0,阿泊拉霉素20 μ g/mL ；
[0092]培养条件:5L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10v/v%,发酵温度370C，pH8.0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h，控制转速320rpm，发酵24h后，控制转速80rpm,维持微氧环境发酵，当菊粉剩余浓度约为5g/L时开始流加补料,补料流加菊粉维持菊粉浓度在30.0±1.0g/L，发酵时间72±lh。
[0093]发酵结果:补料后底物共约为60g/L的菊粉，经发酵得到28.6g/L的R，R-2, 3_ 丁二醇，光学纯度100%。
[0094]对比例4:原始菌多粘类芽孢杆菌CGMCC3044直接利用菊芋菊粉粗提液在5L发酵罐中分批补料发酵生产R，R-2, 3- 丁二醇
[0095](I)出发菌株:多粘类芽孢杆菌CGMCC3044 ；
[0096](2)种子培养基(g/L): (NH4)2HPO40.5,KC10.LMgSO4.7Η200.3，酵母膏 0.1，葡萄糖
2.0,菊粉 1.0 ；
[0097]种子培养:1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度37°C，摇床转速200rpm，培养12h ；
[0098](3)发酵培养:培养基组成(g/L):酵母膏 3.0，(NH4)2HPO40.5，KC10.2，MgSO4.7H200.2，菊粉粗提液含菊粉20.0 ；
[0099]培养条件:5L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10v/v%,发酵温度370C，pH8.0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h，控制转速320rpm，发酵24h后，控制转速80rpm,维持微氧环境发酵，当菊粉剩余浓度约为5g/L时开始流加补料,补料流加菊粉维持菊粉浓度在30.0±1.0g/L，发酵时间72±lh。
[0100]发酵结果:补料后底物共约为60g/L的菊粉，经发酵得到24.3g/L的R，R-2, 3_ 丁
二醇，光学纯度98.9%。
[0101]实施例9重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044-dar_直接利用菊芋菊粉粗提液在5L发酵罐中分批补料发酵生产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇
[0102](I)出发菌株:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044-dar_ ；
[0103](2)种子培养基(g/L): (NH4)2ΗΡ042.0,KC10.3,MgSO4.7Η200.2，酵母膏 0.3，葡萄糖
8.0,菊粉3.0,阿泊拉霉素40 μ g/mL ；
[0104]种子培养:1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度33°C，摇床转速160rpm，培养36h ；
[0105](3)发酵培养:培养基组成(g/L):酵母膏 8.0，(NH4)2HP042.0, KC10.3，MgSO4.7H200.3，菊粉粗提液含菊粉60.0,阿泊拉霉素40 μ g/mL ；
[0106]培养条件:5L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10v/v%,发酵温度33°C，pH8.0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h，控制转速280rpm，发酵24h后，控制转速160rpm，维持微氧环境发酵，补料流加菊粉维持菊粉浓度在30.0±1.0g/L，发酵时间96± lh。
[0107]发酵结果:补料后底物共约为120g/L的菊粉，经发酵得到58.5g/L的R，R-2, 3_ 丁二醇，光学纯度100%。
[0108]对比例5:原始菌多粘类芽孢杆菌CGMCC3044直接利用菊芋菊粉粗提液在5L发酵罐中分批补料发酵生产R，R-2, 3- 丁二醇
[0109](I)出发菌株:多粘类芽孢杆菌CGMCC3044 ；
[0110](2)种子培养基(g/L): (NH4)2ΗΡ042.0,KC10.3,MgSO4.7Η200.2，酵母膏 0.3，葡萄糖8.0，菊粉 3.0 ；
[0111]种子培养:1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度33°C，摇床转速160rpm，培养36h ；
[0112](3)发酵培养:培养基组成(g/L):酵母膏 8.0，(NH4)2HP042.0, KC10.3，MgSO4.7H200.3，菊粉粗提液含菊粉60.0 ；
[0113]培养条件:5L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ),接种量 10v/v%,发酵温度33°C，pH8.0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h，控制转速280rpm，发酵24h后，控制转速160rpm，维持微氧环境发酵，补料流加菊粉维持菊粉浓度在30.0±1.0g/L，发酵时间96± lh。
[0114]发酵结果:补料后底物共约为120g/L的菊粉，经发酵得44.8g/L的R，R-2，3_ 丁二醇，光学纯度98.6%。
【权利要求】
1.一种产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌，该工程菌是通过下列方法构建得到:利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中扩增出丁二酮还原酶基因dar，5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带入如(1同源重组序列克隆粘粒5即虹(:08-1/PIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含dar同源臂1-oriT-ApraK_dar同源臂II序列的重组粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar同源臂1-oriT-ApraK-dar同源臂II，重组粘粒转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，并在λ Red介导下与多粘类芽孢杆菌CGMCC3044发生同源双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar'
2.根据权利要求1所述的产超高光学纯度R，R-2,3- 丁二醇基因工程菌，其特征在于:该工程菌通过下列方法构建得到: (1)基因dar的克隆:根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌ATCC12321中dar基因的序列设计合成PCR所需的引物:
Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3，
P2:5’ -CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT-3’ 以多粘类芽孢杆菌CGMCC3044基因组为模板完成PCR反应:PCR反应条件:94°C变性5min，经 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，共 32 个循环，再经过 72°C延伸 lOmin，获得的 PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，获得来源于多粘类芽孢杆菌CGMCC3044的丁二酮还原酶基因，即dar基因；
(2)重组粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II 的构建:在dar的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I, Xho I，得到dar同源臂I ;在dar的3’端20bp碱基序列的两端分别引入Not I, BamH I,得到dar同源臂II ;将上述dar同源臂I和dar同源臂II分别连接至携带ARed同源重组序列的克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II序列和λ Red序列的重组粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar同源臂 1-oriT-ApraE-dar 同源臂 II ； (3)重组基因工程菌的获得:将重组粘粒SuperCos-l/pIJ790-dar同源臂1-or iT-ApraE-dar同源臂II转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽孢杆菌，命名为CGMCC3044-dar_。
3.权利要求1所述的产R，R-2,3- 丁二醇基因工程菌的构建方法，其特征在于:该方法包括下列步骤:利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中扩增出丁二酮还原酶基因dar，5’端39bp碱基序列构成同源臂I，3’端20bp碱基序列构成同源臂II，通过多克隆位点将同源臂I和同源臂II分别串联到携带ARed同源重组序列克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II序列的重组粘粒SuperCos-l/pI J790,重组粘粒转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，并在λ Red介导下与宿主菌发生同源重组双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar_。
4.根据权利要求3所述的产超高光学纯度R，R-2,3- 丁二醇基因工程菌的构建方法，其特征在于:包括下列步骤:(I)基因dar的克隆:根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌ATCC12321中dar基因的序列设计合成PCR所需的引物:
Pl:5，-ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC-3，
P2:5’ -CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT-3’ 以多粘类芽孢杆菌CGMCC3044基因组为模板完成PCR反应:PCR反应条件:94°C变性5min，经 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin，共 32 个循环，再经过 72°C 延伸 lOmin，获得的 PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-T载体连接，进行序列测定，获得来源于多粘类芽孢杆菌CGMCC3044的丁二酮还原酶基因，即dar基因； (2)重组粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar 同源臂 1-oriT-ApraK_dar 同源臂 II 的构建:在dar的5’端39bp碱基序列的两端分别引入EcoR I, Xho I，得到dar同源臂I ;在dar的3’端20bp碱基序列的两端分别引入Not I, BamH I,得到dar同源臂II ;将上述dar同源臂I和dar同源臂II分别连接至携带ARed同源重组序列的克隆粘粒SuperCos-1/PIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因ApraK序列的两端，得到含dar同源臂1-oriT-ApraE-dar同源臂II序列和λ Red序列的重组粘粒SuperCos-l/pIJ790_dar同源臂 1-oriT-ApraE-dar 同源臂 II ； (3)重组基因工程菌的获得:将重组粘粒SuperCos-l/pIJ790-dar同源臂1-or iT-ApraE-dar同源臂II转化多粘类芽孢杆菌CGMCC3044，涂布含40 μ g/mL阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽孢杆菌，命名为CGMCC3044-dar_。
5.权利要求1所述的产超高光学纯度R，R-2,3- 丁二醇基因工程菌CGMCC3044-dar_在生产R，R-2, 3- 丁二醇中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:将构建的基因工程菌CGMCC3044-dar_接种于含碳源、氮源和无机盐的无菌培养基中进行培养，发酵生产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇，其中，所述碳源为未经任何水解处理的菊芋菊粉粗提液。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:该基因工程菌直接以菊芋菊粉粗提液为底物生产超高光学纯度R，R-2, 3- 丁二醇，具体生产工艺为: Cl)出发菌株:重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044-dar_ ；
(2)种子培养基:(NH4)2HPO40.5-2.0g/L, KC10.10-0.3g/L, MgSO4.7Η200.1-0.3g/L,酵母膏0.1-0.3g/L，葡萄糖2.0-8.0g/L,菊芋菊粉粗提液含菊粉1.0-3.0g/L,阿泊拉霉素20-40 μ g/mL ； 种子培养=1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度30_37°C，摇床转速120-200rpm，培养 12-36h ； (3)发酵培养:培养基组成:菊芋菊粉粗提液含菊粉20.0-60.0g/L,(NH4)2HPO40.5-2.0g/L, KC10.10-0.3g/L, MgSO4.7Η200.1-0.3g/L，酵母膏 3.0-8.0g/L,阿泊拉霉素 20-40 μ g/mL ； 培养条件:接种量10v/v%，发酵温度30-37°C，pH6.0-8.0，控制氧气的通入量，接种后发酵前24h,控制转速240-320rpm,发酵24h后,控制转速80_160rpm,维持微氧环境发酵，摇瓶发酵，或批式发酵，或分批补料发酵，流加补料菊粉维持菊粉浓度在30.0±1.0g/L，补料后底物共约60-120g/L。
【文档编号】C12P7/18GK103756949SQ201410018001
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】高健, 徐虹, 徐尤勇, 薛锋, 丁鸽, 李莎, 冯小海 申请人:盐城工学院