利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法

利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法
【专利摘要】本发明提供一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，属于基因工程【技术领域】。利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白基因Dlfd3(登录号：JF733784)导入兰科植物文心兰，所获转化植株表现更高的移栽成活率和对抗病害的能力。与野生型植株相比，转基因植株抵抗软腐病能力提高，由高感软腐病（Di=100）提升为中抗软腐病(Di=27.5)，移栽成活率由79.3%提高至95.7%,均达极显著差异水平。
【专利说明】利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，涉及一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，具体涉及龙眼铁氧还蛋白基因的应用及兰花育种。
【背景技术】
[0002]文心兰又名舞女兰、金蝶兰、瘤瓣兰等，是重要的盆切花经济栽培品种。文心兰易患软腐病(Soft rot)，在组培苗的移栽阶段，软腐病更能带来毁来性的打击。目前，该病没有特别有效的防治方法，因此选育抗软腐病文心兰品种的是文心兰育种的重要课题。文心兰可以进行广泛的属内杂交和属间杂交，但无论属内杂交还是属间杂交其亲和力都差，在自然条件下结果较为罕见，难以利用传统的育种方法改变某些品种的单一性状，因而利用转基因技术快速提升文心兰经济栽培性状成为文心兰育种的重要手段。
[0003]铁氧还蛋白基因(ferredoxin, fd)基因作为一个大的基因家族在植物中普遍存在，植物FD蛋白多为[2Fe-2S]类型，在光合作用PSI系统中参与电子传递，作为Ferredoxin-NAD(P) (+) oxidoreductase (FNR)的电子供体参与NADP的再生,与植株体内活性氧(reactive oxygen species, R0S)的累积密切相关。由于ROS在植物抗性的产生中起信号传导和超敏反应(hypersensitive response,HR)及细胞程序性死亡(programmedcell death,P⑶)能源来源的双重作用，现已证实源自甜椒(Capsicum annuum)的类铁氧还蛋白基因(/7/7/7)可帮助水稻、烟草、拟南芥以及文心兰在内的许多植物获得广谱抗性，但转化定位不同亚细胞器Λ/基因对植株能否产生抗病性有重要影响。
[0004]此前，我们以龙眼胚性愈伤组织转录组数据为基础，分离克隆6个不同类型铁氧还蛋白 NCBI GenBank 基因登录号分别为 JF733781、JF733783、JF733784、JF733785、JF733787、JF733788、JX996183，其中，获得 cDNA 全长的为 JF733784、JF957855、JF957858、JF957857，分别命名为 Dlfd1、D1MFDX\ ,Dlfdc 1、D1MFDX2。进化树分析显示，Dlfdi ,Dlfdc I与甜椒/7/7/7基因有一定的同源性，可能在提高植物抗病性方面具有生理作用。此前，有关类铁氧还蛋白基因提高植物抗病性方面仅见源自甜椒的类铁氧还蛋白被报道，源自其他物种的不同类型的Λ/基因是否且有提高抗病性功能仍未知。本发明通过将源自龙眼的两个铁氧还蛋白基因利用农杆菌介导技术导入文心兰切花栽培种南茜Gower TfeffisejO原球莖(protocorm-like body, PLB),成功获得了转化植株，经软腐病(soft rot)接菌试验,发现转化/7/Λ/3基因文心兰植物可以显著提高文心兰种苗抗软腐病能力。
[0005]
【发明内容】
:
本发明的目的是提供一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白基因07Λ/3导入兰科植物，提高转化植株对抗病害的能力。其中所述的兰科植物为文心兰或石斛兰，优选文心兰。所抵抗病害为软腐病。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白基因NCBI GenBank基因登录号:JF733784，导入兰科植物，获得具有抗病害能力的转化植株。
[0007]所述的兰科植物为文心兰或石斛兰。
[0008]所述抗病害为软腐病。
[0009]本发明的有益效果:
1、本发明通过系统研究，首次克隆了龙眼铁氧还蛋白基因及CDNA全长。
[0010]2、利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白导入兰科植物，可以显著提高兰科植物的移栽成活率。
[0011]3、利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白导入兰科植物，可以显著提高兰科植物的抵抗软腐病的能力。
[0012]【专利附图】

【附图说明】:
图1载体结构图。
[0013]图2转化似/?/ Dlfdcl植株的PCR鉴定。其中，A为转化Dlfdcl植株，B为转\tDlfd3植株；取筛选培养后的生根苗叶片进行转化后PCR鉴定。在500bp左右呈现阳性条带的为整合外源基因植株。
[0014]图3转化植株移栽对比试验。生根苗生长至6 cm以上进行移栽，每个处理移栽128株，重复3次，移栽2个月后统计成活率。MmkDlfd3阳性植株移栽成活率显著高于野生型。其中WT:野生型，E2:超表达似Λ/ci阳性植株，E3:超表达似Λ/J阳性植株。
[0015]图4转化Dlfd3/ Dlfdcl植株移栽抗软腐病能力试验。超表达Dlfd3阳性植株移栽抗软腐病能力显著高于野生型。其中WT:野生型，E2:超表达似阳性植株，E3:超mkDlfd3阳性植株。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
I,Dlfd3/ Dlfdc超表达载体构建
利用Trizol?试剂盒(Ivitrogen)提取龙眼胚性愈伤组织RNA,利用RevertAidTMFirst-Strand Synthesis System (Fermantas)合成 cDNA 第一链。
[0017]根据龙眼铁氧还蛋白基因D1M3、Dlfdcl设计带限制性内切酶位点Bgl I1、Spe I 的上下游相应引物似Λ/J F: 5’ -GA AGATC TATGGCAACT GTGACCCTTAG-3J, DlfdSR: 5’ -GG ACTAGT GTAAAGTTCG CCTTCCTTGTG-3’ -,DlfcIcl F: 5’ -GA AGATCT ATGGCAACACTTCACTTCAG-3’，似R: 5’ -GG ACTAGT ATCATCAGCA GTTGCCAGTTG-3’。25 μ LPCR 反应体系:10 X PCR buffer ( plus Mg 2+) 2.5 μ L, dNTPs ( 2.5 mmol.L-1) 0.5μ L,正向引物(10 μ mo I.L—1) I μ L,反向引物(10 μ mo I.L—1 ) I μ L, Taq ( 5 U?μ L-1) 0.2 μ L，ddH20 18.8 μ L0 PCR 反应程序:94 °C 预变性 4 min, 94 °C 变性 45 s,54 °C退火45 s，72 °C延伸40 s，设35个循环，最后72 °C延伸10 min。1.0% (W/V)琼脂糖电泳检测PCR产物，回收500 bp左右条带，导入PMD18-T (TAKARA)构建PMD18-T质粒。利用 Fermentas FastDigest (Thermo Fisher Scientific)限制性内切酶兔1./ I1、Spe I双酶切pCAMBIA1302及Vmi^-rX-Dlfd3/Dlfdel质粒，回收酶切质粒及500bp左右小片段，利用 T4 连接酶将龙眼似基因导入 pCAMBIA1302 (pl302)，构建 pl302: \Dlfd?>/Dlfdcl质粒，构建好的质粒经PCR检测，导入大肠杆菌感受态DH5 a (TIANGEN),于含安苄青霉素50 mg.L^1 LB固体培养基涂板，阳性菌株送华大基因测序，检测剪接正确性，完成双元表达载体P1302::似Λ/3/似/而7的构建(见图1)。
[0018]2、农杆菌的 制备
利用小量质粒提取试剂盒(TIANGEN)提取大肠杆菌DH5 α中p1302: -.Dlfd?,/ Dlfdcl质粒，利用钙通道法将质粒转化ΕΗΑ105农杆菌感受态，于含卡那霉素及链霉素均为75mg/LYEB固体培养基涂板，挑取阳性克隆子，于含卡那霉素及链霉素均为75mg/L YEB液体培养基，置于摇床，280C，250rpm,培养至0D600 =0.4，备用。
[0019]3、文心兰的转化
以继代35 d PLB为培养材料，将PLB置于0.5M蔗糖MS液体培养基，置于80 RPM摇床，高渗处理2 h，再通过3 d黑暗条件下预培养，将预处理后PLB材料置于以MS液体培养基重悬的浓度为0D600=1.0的EHA105农杆菌菌液进行侵染30min，置于MS培养基黑暗条件下共培养3d,以200 mg/L头孢(cefatoxime)洗菌20 min,并转移至含50 mg/L头孢MS培养基，250C，16h /d光照进行二阶共培养，30 d后转入含5 mg .L-1潮霉素筛选培养基，25°C，16h /d光照，培养45d，重复筛选培养3次，将抗性植株转入普通生根培养基培养60 d，移栽至水草待测。
[0020]4、转化后植株PCR检测
利用CTAB法提取转化后文心兰叶片基因组DNA。通过PCR检测目的基因条带验证T-DNA是否导入植株。PCR反应体系及反应条件同上。经检测，转^7/而7基因的11株侍测株有7棵植株有阳性条带，转基因的11株侍测株有8棵植株有阳性条带。
[0021]5、转化后植株的抗病性检测(见图2)。
[0022]参照尹俊梅等方法，选取文心兰软腐病病叶，75%乙醇表面灭菌后挑取病健结合部组织液于NA固体培养基划板,挑取的单菌落于NA液体培养基置于摇床,28°C, 250rpm,摇菌过夜，挑取有致病力菌液用于抗病性检测。利用10 μ L枪头蘸取菌液，于第二片真叶表面打孔，以不穿透叶片为度，接种10 d后观察发病情况。参照尹俊梅等【尹俊梅，任羽，杨光穗，editors (2008)石斛兰种质资源描述规范和数据质量控制规范.北京，统计发病指数.】方法，统计发病指数。经对比发现，与野生型植株相比，转基因植株抵抗软腐病能力提高，由高感软腐病(Di=IOO)提升为中抗软腐病(Di=27.5)(见图3，移栽成活率由79.3%提高至95.7% (见图4)，达极显著差异水平。
[0023]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【权利要求】
1.一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，其特征在于:利用转基因技术将龙眼铁氧还蛋白基因似/必，登录号:JF733784，导入兰科植物，获得具有抗病害能力的转化植株。
2.根据权利要求1所述的一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，其特征在于:所述的兰科植物为文心兰或石斛兰。
3.根据权利要求1所述的一种利用龙眼铁氧还蛋白基因转化兰科植物提高抗病力的方法，其特征在于:所述抗病害为软腐病。
【文档编号】C12N15/84GK103898156SQ201410039383
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】赖钟雄, 叶炜, 林玉玲, 匡云波, 江金兰, 李永清, 雷伏贵, 周建金, 许旭明, 陈裕坤, 刘生财, 张梓浩 申请人:福建农林大学, 三明市农业科学研究院