一种快速提取百合鳞茎dna的方法
【专利摘要】本发明涉及一种植物基因组提取方法，公开了一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，包括新鲜百合鳞茎样品研磨、加入预冷的预处理液去除杂质、加入预热的裂解液进行裂解、用氯仿和乙醇和异戊醇的混合溶液去除蛋白、用70%乙醇去除残留醇类物质和用TE溶液溶解保存DNA步骤。本方法能快速、简便、高效提取百合鳞茎中的完整基因组DNA，操作难度低，不受次生代谢物的污染，提取的DNA可以用于分子生物学分析，从而为百合的遗传多样性分析、种质资源保护和利用提供一项技术手段，具有重大科学意义和实用价值。
【专利说明】一种快速提取百合鳞茎DNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物基因组提取方法，尤其涉及了一种快速提取百合鳞茎DNA的方法。
【背景技术】
[0002]百合(Lilium.)为百合科百合属多年生草本球根植物，是世界上重要花卉品种之一，被誉为“球根花卉之王”，主要分布在亚洲东部、欧洲、北美洲等北半球温带地区，全球发现的品种达百种，其中我国是最主要的起源地，自然分布品种就有50多种。随着植物分子生物学研究的不断进步，分子生物技术已被广泛应用于植物资源鉴定、植物选种、育种和遗传改良等方面，而高质量DNA的提取是进行分子生物实验的基础。基因工程育种将是未来百合育种的主要研究方向和科研工作的重点，而任何一项基因工程技术均离不开DNA的提取和操作。
[0003]百合的鳞茎中富含多糖、酚、色素及多种次生代谢物质，百合中分离获得的DNA由于富含多酚，易被氧化成棕褐色，此外，由于多糖、单宁等物质与DNA的理化性质相似会结合成粘稠的胶状物，很难将其分离，因此，获得的DNA产量低、质量差、易降解，影响了 DNA质量和纯度，不能进行酶切及作为模板进行试验。
[0004]目前对的植物叶片和罗布麻属植物的基因组DNA提取方法，均通过液氮冷冻研磨法，但该方法不适用于百合鳞茎的DNA提取；而水稻和香菇的快速DNA提取方法具有严格的植物针对性，提取质量较差。由于百合的鳞茎生长有其特殊性，如其鳞茎组织糖分及次生代谢物含量较高，如方法不当极易造成基因组DNA的褐化而影响DNA的提取效果；且普通的DNA提取方法多采用液氮研磨法进行植物的细胞破碎，而百合鳞茎水分含量很高会导致研磨组织冻结，无法进行研磨，但如采用直接研磨匀浆的方法，则又会使DNA大量降解而且细胞内各种降解酶被释放，提取DNA含量和质量均会受到极大影响，上述方法均不利于百合鳞茎DNA快速高效提取。
【发明内容】
[0005]本发明针对百合鳞茎的基因组DNA提取中，DNA易褐化，鳞片水分含量高不易细胞破碎、提取液糖分含量高、单位体积提取量低等缺点，提供了一种快速、高效，糖分含量低、且成本低廉，操作简便，适于提取百合鳞茎基因组DNA的方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决:
[0007]一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，包括如下步骤:
[0008](1)取80~120mg新鲜百合鳞茎样品，放入离心管内，加入预冷的预处理液600~1000uL室温放置5~lOmin，4500~5500rpm离心5~8min，弃上清液；
[0009](2)向步骤(1)的离心沉淀物中迅速加入预热的CTAB提取缓冲液600~800ul，混合均匀，于60~65°C水浴40~50min ；
[0010](3)向步骤(2)的混合物中加入400~500uL的抽提液，抽提液为体积比为76:20:4的氯仿和乙醇和异戍醇的混合液,颠倒混匀成乳池液，于8000~12000rpm离心6~IOmin,留上清液；
[0011](4)向步骤(3)的上清液中加入占上清液0.6~0.8倍体积的预冷的异丙醇，混合均匀后在冰冻条件下放置10~20分钟，离心，弃上清；
[0012](5)用预冷的70%的乙醇漂洗步骤(4)的离心沉淀物，室温干燥，加入180~220uLl XTE溶液重悬沉淀，即得百合鳞茎DNA。
[0013]采用本发明的方法提取百合鳞茎DNA，无需液氮研磨，先在前期组织破碎阶段加入了 DNA保护缓冲液，不仅能解决常规鳞片含水量高，遇液氮无法研磨的问题，更能去除部分可溶性多糖，本方法省时省力。另外缩短离心时间和降低离心速度，可以减少多糖等杂质与DNA 一起被沉淀，百合基因组DNA提取效果好，时间短，容易操作。
[0014]作为优选，步骤(1)加入预处理液前还需要将百合样品打磨成匀浆。直接将新鲜百合鳞茎打磨成泥状，再进行DNA提取操作，解决了鳞茎鲜品遇液氮后坚硬难以研磨的问题。[0015]作为优选，步骤(1)预处理液预冷处理温度为O~4°C。
[0016]作为优选，步骤(1)中，预处理液为pH值为8.0的10mmol/L的Tris-HCl、pH值为8.0的lmmol/LEDTA和0.lmol/L的NaCl的缓冲液，预处理液经过灭菌处理，灭菌温度为120°C，灭菌时间为20min。
[0017]作为优选，步骤(2)中，CTAB提取缓冲液为pH值为8.0的100mmol/L的Tris-HCl、pH值为8.0的20mmol/L的EDTA、1.4mol/LNaCl、质量分数为2%CTAB、质量分数为2%α -巯基乙醇和质量分数为3%PVP的缓冲液。其中，EDTA为乙二胺四乙酸，CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
[0018]作为优选，步骤(2)中，CTAB提取缓冲液预热处理温度为60~70°C。
[0019]作为优选，步骤(4)中，冰冻温度为-22~-18°C。
[0020]本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果:
[0021 ] (I)采用本申请的快速提取百合鳞茎DNA的方法，无需液氮研磨，在前期组织破碎阶段加入了 DNA保护缓冲液，不仅能解决常规鳞片含水量高，遇液氮无法研磨的问题，更能去除部分可溶性多糖，方法省时省力。
[0022](2)本申请缩短了离心时间并降低了离心速度，可以减少多糖等杂质与DNA —起被沉淀，提取出的DNA经琼脂糖凝胶电泳显示清晰完整的基因组DNA条带，经分光光度计检
测八260/280
值为1.75~1.90。
[0023](3)本申请中采用氯仿和乙醇和异戊醇的混合液为抽提液，采用醋酸钠溶液增加DNA溶解度，并采用用70%乙醇去除残留醇类物质，反应均匀且充分，反应时间短，溶液中物质充分分层，能有效去除蛋白和多糖等杂质。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是采用本发明的方法提取出的百合鳞茎DNA的电泳图；
[0025]图2是采用本发明的方法提取出的DNA扩增ITS序列、matK基因和RbcL基因的电泳图。
【具体实施方式】[0026]下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
[0027]实施例1
[0028]样本来源:2012年11月采集于浙江省绍兴地区的东方百合“Siberia”种球鳞茎，成品种球直径14-16cm。
[0029]一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0030](I)取IOOmg新鲜百合鳞茎样品，打磨成匀浆，放入离心管内，加入预冷的(TC的预处理液800uL，室温放置8min，5000rpm离心5min，弃上清液，其中，预处理液为pH值为8.0的 IOmmoI/L 的 Tris_HCl、pH 值为 8.0 的 lmmol/LEDTA 和 0.1mol/LNaCI 的缓冲液，120。。灭菌 20min ；
[0031](2)向步骤(1)的离心沉淀物中迅速加入预热至65°C的CTAB提取缓冲液700ul，混合均匀，于62 °C水浴45min，其中CTAB提取缓冲液为pH值为8.0的100mmol/L的Tris-HCl、pH 值为 8.0 的 20mmol/L 的 EDTA、1.4mol/LNaCl、质量分数为 2%CTAB、质量分数为2%α -巯基乙醇和质量分数为3%PVP的缓冲液；
[0032](3)向步骤(2)的混合物中加入450uL的抽提液，抽提液为体积比为76:20:4的氯仿和乙醇和异戊醇的混合液，颠倒混匀成乳浊液，于1000Orpm离心8min，留上清液；
[0033](4)向步骤(3)的上清液中加入0.67倍体积的预冷的异丙醇，混合均匀后在_20°C条件下放置15分钟，1000rpm离心5min,弃上清；
[0034](5)用预冷70%的乙醇漂洗步骤(4)的离心沉淀物，室温干燥，加入200UL1XTE溶
液重悬沉淀，即得百合鳞茎DNA。
[0035]经过以上提取过程，最后获得DNA提取液的A26Q/28Q=1.82，琼脂糖凝胶电泳后呈现清晰的单一条带(如图1所示)，表明应用该方法提取的DNA是完整的基因组DNA。
[0036]实施例2
[0037]样本来源:2013年10月采集于浙江省绍兴地区的东方百合种球鳞茎，成品种球直径 13_15cm。
[0038]一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0039](I)取80mg新鲜百合鳞茎样品，打磨成匀浆，放入离心管内，加入预冷的4°C的预处理液600uL，室温放置5min，4500rpm离心5min，弃上清液，其中，预处理液为含有pH值为 8.0 的 IOmmoI/L 的 Tris-HCl、pH 值为 8.0 的 lmmol/LEDTA 和 0.1mol/LNaCI 的缓冲液，120 °C，灭菌 20min ；
[0040](2)向步骤(1)的离心沉淀物中迅速加入预热至60°C的CTAB提取缓冲液600ul，混合均匀，于60°C水浴40min，其中CTAB提取缓冲液是含有pH值为8.0的100mmol/L的Tris-HCl、pH 值为 8.0 的 20mmol/L 的 EDTA、1.4mol/LNaCl、质量分数为 2%CTAB、质量分数为2%α -巯基乙醇和质量分数为3%PVP的缓冲液；
[0041](3)向步骤(2)的混合物中加入400uL的抽提液，抽提液为体积比为76:20:4的氯仿和乙醇和异戊醇的混合液，颠倒混匀成乳浊液，于SOOOrpm离心6min，留上清液；
[0042](4)向步骤(3)的上清液中加入0.6倍体积的预冷的异丙醇，混合均匀后在_18°C条件下放置10分钟，1000rpm离心5min,弃上清；
[0043](5)用预冷70%的乙醇漂洗步骤(4)的离心沉淀物，室温干燥，加入180UL1XTE溶
液重悬沉淀，即得百合鳞茎DNA。[0044]经过以上提取过程，最后获得DNA提取液的A26Q/28Q=1.78，琼脂糖凝胶电泳后呈现清晰的单一条带，表明应用该方法提取的DNA是完整的基因组DNA。
[0045]实施例3
[0046]样本来源:2012年11月采集于云南省昭通地区的东方百合“Siberia”种球鳞茎，成品种球直径14-16cm。
[0047]一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0048](I)取120mg新鲜百合鳞茎样品，打磨成匀浆，放入离心管内，加入预冷的2°C的预处理液1000uL,室温放置lOmin，5500rpm离心8min，弃上清液，其中，预处理液为含有pH值为 8.0 的 IOmmoI/L 的 Tris-HCl, pH 值为 8.0 的 lmmol/LEDTA 和 0.1mol/LNaCI 的缓冲液，12CTC,灭菌 20min ；
[0049](2)向步骤(1)的离心沉淀物中迅速加入预热至70°C的CTAB提取缓冲液800ul，混合均匀，于65°C水浴50min，其中CTAB提取缓冲液是含有pH值为8.0的100mmol/L的Tris-HCl、pH 值为 8.0 的 20mmol/L 的 EDTA、1.4mol/LNaCl、质量分数为 2%CTAB、质量分数为2%α -巯基乙醇和质量分数为3%PVP的缓冲液；
[0050](3)向步骤(2)的混合物中加入500uL的抽提液，抽提液为体积比为76:20:4的氯仿和乙醇和异戊醇的混合液，颠倒混匀成乳浊液，于12000rpm离心10min，留上清液；
[0051](4)向步骤(3)的上清液中加入0.8倍体积的预冷的异丙醇，混合均匀后在_22°C条件下放置20分钟，1000rpm离心5min,弃上清；
[0052](5)用预冷70%的乙醇漂洗步骤(4)的离心沉淀物，室温干燥，加入220UL1XTE溶
液重悬沉淀，即得百合鳞茎DNA。
[0053]经过以上提取过程，最后获得DNA提取液的A26Q/28Q=1.90，琼脂糖凝胶电泳后呈现清晰的单一条带，表明应用该方法提取的DNA是完整的基因组DNA。
[0054]验证实施例
[0055]利用实施例1提取的基因组DNA作为PCR模板，扩增植物DNA的特征序列，包括核糖体DNA内转录间隔区ITS序列、叶绿体编码成熟酶K、蛋白的matK基因以及编码核酮糖1，5- 二磷酸羧化酶大亚基的RbcL基因，具体引物序列见表1。扩增结果如图2所示，可以得到单一条带的PCR产物。经测序后将扩增所得产物序列在NCBI的Genbankblast获得百合属同源序列，序列相似率70%以上。
[0056]表1ITS序列、matK基因和RbcL基因的引物表
[0057]
【权利要求】
1.一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)取80~120mg新鲜百合鳞茎样品，放入离心管内，加入预冷的预处理液600~1000uL室温放置5~lOmin，4500~5500rpm离心5~8min，弃上清液； (2)向步骤(1)的离心沉淀物中迅速加入预热的CTAB提取缓冲液600~800ul，混合均匀，于60~65°C水浴40~50min ； (3)向步骤(2)的混合物中加入400~500uL的抽提液，抽提液为体积比为76:20:4的氯仿和乙醇和异戍醇的混合液，颠倒混匀成乳池液，于8000~12000rpm离心6~IOmin,留上清液； (4)向步骤(3)的上清液中加入0.6~0.8倍体积的预冷的异丙醇，混合均匀后在冰冻条件下放置10~20分钟，离心，弃上清； (5)用预冷70%的乙醇漂洗步骤(4)的离心沉淀物，室温干燥，加入180~220UL1XTE溶液重悬沉淀，即得百合鳞茎DNA。
2.根据权利要求1所述的一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于:步骤(1)加入预处理液前还需要将百合样品打磨成匀浆。
3.根据权利要求1所述的一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于:步骤(1)预处理液预冷处理温度为O~4°C。
4.根据权利要求1所述的一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于:步骤(1)中，预处理液为 pH值为 8.0 的 10mmol/L 的 Tris-HCl、pH值为 8.0 的 lmmol/LEDTA和 0.1mol/LNaCl的缓冲液，预处理液经过灭菌处理，灭菌温度为120°C，灭菌时间为20min。
5.根据权利要求1所述的一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于:步骤(2)中，CTAB提取缓冲液为pH值为8.0的IOOmmoI/L的Tris-HCUpH值为8.0的20mmol/L的EDTAU.4mol/LNaCl、质量分数为2%CTAB、质量分数为2%α -巯基乙醇和质量分数为3%PVP的缓冲液，其中，EDTA为乙二胺四乙酸，CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，PVP为聚乙烯吡咯烷酮。
6.根据权利要求1所述的一种快速提取百合鳞茎DNA的方法，其特征在于:步骤(2)中，CTAB提取缓冲液预热处理温度为60~70°C。
7.根据权利要求1所述的一种快速提取 百合鳞茎DNA的方法，其特征在于:步骤(4)中，冰冻温度为-22~-18°C。
【文档编号】C12N15/10GK103882008SQ201410072420
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】吴超, 郭方其, 黎侠, 丁晓瑜, 林森洪 申请人:浙江省农业科学院