含油污泥中石油高效降解菌及菌组的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种含油污泥中石油的高效降解菌及菌组及应用。所述降解菌组包括两种菌，其中一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC?NO.8646和保藏编号：CGMCC?NO.8647，名称为谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum(RS1)。本发明还提供一种菌组，由RS3，其保藏编号CGMCC?NO.8646和RS1，其保藏编号CGMCCNO.8647组成，本发明提供的混合菌组对n-C12～n-C34的正构烷烃均有明显降解，通过GC-MS分析表明，对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强。
【专利说明】含油污泥中石油高效降解菌及菌组的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及降解石油烃的菌株，尤其是一种含油污泥中石油高效降解菌及菌组的应用。
【背景技术】
[0002]石油是当今社会生活生产中必不可少的能源之一，同时也是全球公认的对环境最具严重影响的污染物之一。石油的勘探、开发和加工运输过程中会产生大量含油污泥。含油污泥中通常含有烷烃、芳香烃、非烃化合物和浙青质等物质，会通过土壤和地下水污染生态环境威胁人类健康，因此，含油污泥的安全处置是一个重大问题。含油污泥的处理处置，主要涉及油含量的减少以及水和油泥的分离。当前焚烧、制砖等处理方法均有一定局限性，而利用微生物对石油污染进行降解修复安全性高、无二次污染，是一项成本低、效益高且环境友好型的处理技术。由于含油污泥成分复杂难于降解，目前国内外对含油污泥的微生物降解修复研究相对较少。
[0003]申请者从渤海油田含油污泥中分离出二株高效石油烃降解菌，并进一步研究菌株及菌组对含油污泥中石油烃的降解能力，以期应用于含油污泥的微生物修复。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含油污泥中石油的高效降解菌及菌组的应用，本发明提供一种假单胞菌，以及由该假单胞菌与棒状杆菌组成的菌组，该菌种及菌组对石油烃的降解效果明显，大幅提高了降解率，为制备一种高效的石油污泥降解剂提闻良好的技术支持。
[0005]本发明实现目的的技术方案是:
[0006]一种含油污泥中石油的高效降解菌，所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院研究所，保藏编号:CGMCC N0.8646,施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri,保藏日期:2013年12月27日。
[0007]而且，所述降解菌对芳香烃的降解率达到8.08%。
[0008]而且，所述降解菌对石油的降解条件为42°C、盐度1%、pH6~10。
[0009]而且，所述对含油污泥中总石油烃的降解率为53.29%。
[0010]含油污泥中石油的高效降解菌作为含油污泥净化剂的应用。
[0011]一种含油污泥中石油的高效降解菌组，所述降解菌组包括两种菌，其中一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCjia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院研究所，保藏编号:CGMCC N0.8646，施氏假单胞菌Pseudomonasstutzeri ;保藏日期:2013年12月27日。另外一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院研究所，保藏编号:CGMCC N0.8647,分类号为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum,保藏日期:2013年12月27日。
[0012]而且，所述菌组对n-C12 ~n_C34的正构烷烃均有明显降解，且对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强，分别达到44.39%,27.79%,30.78%和39.43%。
[0013]含油污泥中石油的高效降解菌组作为含油污泥净化剂的应用。
[0014]本发明的有益效果和优点是: [0015]1、本申请从渤海油田含油污泥中分离出石油烃降解菌，其保藏编号CGMCC8646，经过试验证实,RS3对芳香烃的降解率最高，达到8.08%,该细菌30d内对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率分别为53.29%，该细菌对石油的最适降解条件分别为42°C、盐度1%、ρΗ6~10。
[0016]2、本发明还提供一种菌组，由RS3，其保藏编号CGMCC8646和RS1，其保藏编号CGMCC8647组成，本发明提供的混合菌组对n_C12~n_C34的正构烷烃均有明显降解，通过GC-MS分析表明，对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强，分别达到44.39%,27.79%、30.78% 和 39.43%ο
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明温度对降解率的影响；
[0018]图2为本发明盐度对降解率的影响；
[0019]图3为本发明pH值对降解率的影响；
[0020]图4为本发明TPH降解率随时间变化；
[0021]图5为本发明菌株对石油烃不同组分的降解效果；
[0022]图6处理组(T)与对照组(C)的m/z85选择离子色谱图，图中标记I~23分别代表正构烷烃n-C12~n-C34。
【具体实施方式】
[0023]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0024]本申请通过以下方法来筛选、确认菌株种类，同时提供该菌株的各项优异性能，具体内容如下:
[0025]I材料与方法
[0026]1.1含油污泥
[0027]含油污泥样品来源于渤海油田钻井岩屑，取自中海油渤海公司环保技术服务分公司，经测定油泥的含水率为70.55%，pH值为6.4，盐度3.0%。
[0028]1.2培养基
[0029]1.2.1 富集分离培养基(g/L)酵母粉 3，NaCl5, MgSO4.7Η200.25，(NH4)2SO4I,K2HPO4IO, ΚΗ2Ρ044, ρΗ7.2 ~7.4。
[0030]1.2.2斜面固体培养基LB固体培养基。
[0031]1.2.3 含油液体培养基(g/L)酵母粉 3，NaC15，MgSO4.7Η200.25，(NH4)2SO4I,K2HPO4IO, ΚΗ2Ρ044,原油 10，ρΗ7.2 ~7.4。
[0032]1.3降解菌的分离和形态观察[0033](I)称取IOg含油污泥样品，加入40mL吐温80-水溶液(1%。v/v)，静置I~2h。取上层悬浊液ImL加到含有9mL吐温水的试管中，重复以上步骤3次。分别取100 μ L菌悬液涂抹于富集固体培养基平板，于培养箱中37°C培养24h。
[0034](2)挑取形态不同的单独菌落，接种于装有50mL液体富集培养基的150mL锥形瓶中，每个菌种做3个平行，将锥形瓶置于恒温震荡培养箱中37°C、IOOrpm培养24h后进行划线分离。
[0035](3)重复步骤(2)对菌株进行纯化，直至平板上所有菌落形态一致，即为单一菌株。纯化后的菌株接种于斜面固体培养基，4°C保存。以上实验均在无菌操作条件下进行。
[0036]使用扫描电镜(SEM)对分离菌株进行形态观察。
[0037]菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鉴定到属。使用AXYGEN细菌DNA提取试剂盒对筛选出的两株石油烃降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，PCR采用的引物为:
[0038]27F:5/ AGAGTTTGATCATGGCTCAG3'；
[0039]1492R:5/ CTACGGTTACCTTGTTACGAC3'；
[0040]PCR 反应体系(50 μ L)为:Μ?χ25 μ L，模板 2.0 μ L，引物各 1.0 μ L，ddH2021 μ L。 [0041]PCR 反应程序:94°C预变性 4min，94°C变性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 2min，以上共进行30个循环，72°C延伸lOmin，最后4°C保存。
[0042]PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化测序。
[0043]1.4菌株的鉴定
[0044]菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鉴定到属。使用AXYGEN细菌DNA提取试剂盒对筛选出的二株石油降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，PCR采用的引物为:
[0045]27F:5/ AGAGTTTGATCATGGCTCAG3'；
[0046]1492R:5/ CTACGGTTACCTTGTTACGAC3'；
[0047]PCR 反应体系(50 μ L)为:Μ?χ25 μ L，模板 2.0 μ L，引物各 1.0 μ L，ddH2021 μ L。
[0048]PCR 反应程序:94°C预变性 4min，94°C变性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 2min，以上共进行30个循环，72°C延伸lOmin，最后4°C保存。
[0049]PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化测序。
[0050]1.5降解菌的最适降解条件
[0051]将活化后的降解菌接种于装有50mL含油液体培养基的150mL三角瓶中，采用单因素实验，在其它条件因素相同的情况下，分别改变温度、盐度和pH条件进行摇瓶培养，培养7d，每组实验做三个平行，对照组不接种降解菌。采用紫外分光光度法测定培养基中石油含量，计算降解率Η (%):
[0052]
对照组含量-处理组含量,ΑΑη/ ( Λ Λ
η =-χ 100% Cl)
对照组含量
[0053]温度、盐度和pH值分别设定为以下几个梯度:(1)温度:22°C、27°C、32°C、37°C、42°C>47°C>50°C ；(2)盐度:0.5%、1%、2%、3%、5%、7%、8% ; (3) pH:4、5、6、7、8、9、10、11。
[0054] 1.6降解菌对含油污泥的降解
[0055]1.6.1含油污泥总TPH的降解
[0056]将活化后的二株石油烃降解菌接种于富集液体培养基中，37°C振荡培养24h，然后将RS1，RS3和投加比例为1:1的混合菌菌液各30mL加入盛有100g左右含油污泥的烧杯中，对照组则加入等量富集液体培养基，每组设三个平行，实验进行30d，每3d测定TPH质量分数，含油污泥的TPH质量分数的测定采用超声萃取-紫外分光光度法测定。
[0057]1.6.2石油烃不同组份的降解
[0058]取5g左右添加菌液处理7d的含油污泥置于具塞比色管中，分三次加入50mL 二氯甲烷(20mL、20mL、IOmL),每次超声萃取30min，收集萃取液于圆底烧瓶中。将滤液用事先烘干的WhatmanGF/F玻璃纤维滤膜过滤，过滤后的萃取液使用旋转蒸发仪浓缩后定容至IOmL,氮吹至ImL用于硅胶柱层析。
[0059]层析柱内径Icm,高30cm,从下至上依次填入玻璃纤维,25cm硅胶和Icm无水硫酸钠，加入ImL滤液样品，分别用30mL正己烷、50mL正己烷-二氯甲烷(体积比1:1)洗脱，所得到的饱和烃、芳香烃组份用事先称重的圆底烧瓶接取。将所得组份风干后用万分之一分析天平称重，用重量法测得各组分含量，按照式(I)计算石油烃降解菌对饱和烃和芳香烃的降解率。
[0060]然后将称重后的芳香烃和饱和烃组份用适量正己烷完全溶解，旋转蒸发至适量后氮吹至ImL装入样品瓶进行GC-MS检测。
[0061]仪器分析条件:PAHs和正构烷烃的分析均使用Agilent7890A气相色谱-5975C质谱联用仪进行，色谱柱为DB-5MS(30mX0.25mm X 0.25 μ m)。( I )PAHs分析气相条件:进样口温度 290°C，初始温度 70°C保持 lmin，10°C /min 升到 260°C保持 4min，5°C /min 升到 300°C保持4min。质谱条件:传输线温度280°C，离子源温度230°C，电离方式:EI，扫描方式:SM。载气为He，流速为lmL/min。(2)正构烷烃的仪器分析条件为:进样口温度220°C，程序升温，传输线温度250°C，离子源温度250°C，扫描方式:fullscan。
[0062]2结果与讨论
[0063]2.1降解菌的分离和形态
[0064]从含油污泥样品中分离纯化得到二株石油烃降解菌，编号为RSl和RS3。通过扫描电镜观察到RSl大小为0.6~0.8 μ mX 0.8~1.4 μ m，RS3大小为0.6~0.8 μ mX 1.2~
2.0ym ；RS1为椭圆形，RS3为短杆状。
[0065]2.2菌株的16SrRNA基因鉴定
[0066]测序结果显示两株细菌的16SrRNA基因序列长度分别为1422bp、1415bp。将得到的基因序列与GenBank数据库中的序列进行比对，获得各序列的同源性信息(表1)。
[0067]表1两株菌的16SrRNA基因序列BLAST比对结果
[0068]
【权利要求】
1.一种含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于:所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院研究所，保藏编号:CGMCC N0.8646,施氏假单胞菌Pseudomonasstutzeri。
2.根据权利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于:所述降解菌对芳香烃的降解率达到8.08%。
3.根据权利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于:所述降解菌对石油的降解条件为42°C、盐度1%、ρΗ6~10。
4.根据权利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌，其特征在于:所述对含油污泥中总石油烃的降解率为53.29%。
5.权利要求1所述的含油污泥中石油的高效降解菌作为含油污泥净化剂的应用。
6.一种含油污泥中石油的高效降解菌组，其特征在于:所述降解菌组包括两种菌，其中一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院研究所，保藏编号:CGMCC N0.8646，施氏假单胞菌Pseudomonasstutzeri ;另外一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院研究所，保藏编号:CGMCCN0.8647,分类号为谷氨酸棒状杆菌Corynebacteriumglutamicum。
7.根据权利要求6所述的含油污泥中石油的高效降解菌组，其特征在于:所述菌组对n-C12~n-C34的正构烷 烃均有明显降解，且对萘、苊、屈和苯并[b]荧蒽的降解能力较强，分别达到 44.39%、27.79%、30.78% 和 39.43%。
8.权利要求6所述的含油污泥中石油的高效降解菌组作为含油污泥净化剂的应用。
【文档编号】C12N1/20GK103981119SQ201410072227
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】刘宪斌, 任丽君, 田胜艳, 赵兴贵 申请人:天津科技大学