影响猪肉脂肪酸组分的主效snp标记及其在种猪肉质性状遗传改良中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种影响猪肉脂肪酸组分的主效SNP标记，所述SNP标记位于猪SCD基因的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963718核苷酸位点为C与T的突变，对应于SEQ?ID?NO:1上的第4513位，或所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963819核苷酸位点为C与G的突变，对应于SEQ?ID?NO:1上的第4614位，前述两个位点完全连锁；并且所述SNP标记能够提高猪的单不饱和脂肪酸含量和/或降低饱和脂肪酸含量，所述单不饱和脂肪酸为C18:1和/或C16:1，所述饱和脂肪酸为C18:0和/或C16:0。本发明还相应提供一种位于猪14号染色体上的SCD基因的核苷酸序列，以及提供该SNP标记和核苷酸序列在种猪肉质性状遗传改良中的应用。
【专利说明】影响猪肉脂肪酸组分的主效SNP标记及其在种猪肉质性状遗传改良中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物技术及动物遗传育种领域，具体涉及鉴别能显著提高商品猪肌肉不饱和脂肪酸C18:1和C16:1含量同时降低饱和脂肪酸C18:0和C16:0含量的主效基因标记及其在种猪肉质遗传改良中的应用。
【背景技术】
[0002]脂肪酸(fatty acid)是指一端含有一个羧基的长脂肪碳氢链，是动植物脂肪组织、磷脂和糖脂的主要组成部分。按照碳链中的双键数目，脂肪酸可分为饱和脂肪酸(不含双键，SFA)、单不饱和脂肪酸(只含一个双键，MUFA)和多不饱和脂肪酸(含有多个双键，PUFA)ο猪肉中含有18种常见脂肪酸，其中含量最丰富的为C18:1、C16:0、C18:0、C18:2和C16:1等，这些脂肪酸的总含量占猪肌肉中总脂肪酸的90%以上。脂肪酸组成是影响猪肉营养、风味和加工的重要因素。一般来说，饱和脂肪酸(SFA)特别是C12:0、C14:0和C16:0会促使人体血液中低密度脂蛋白和总胆固醇含量的升高，引发心脑血管疾病，对人体健康极为不利；然而不饱和脂肪酸如C16:1、C18:1、18:2和C18:3有助于降低人体血液中低密度脂蛋白和总胆固醇含量、提高免疫力和降低癌症风险，因此，优化猪肉中脂肪酸组成可以提高猪肉营养水平并且有益于人类健康。
[0003]检测猪肉脂肪酸组成需要将生猪进行屠宰测定，成本昂贵，且不能实现个体的直接选择，这使得基于家系和表型测定的传统育种效率低下。而通过寻找引起猪肉脂肪酸组成差异的主效基因及其关键变异位点，并利用这些位点作为分子标记选择脂肪酸组成优异的猪种来生产，不需要详细的系谱记录和后代表型信息，且可实现早期选种，能极大提高种猪肉质遗传改良的效率。
[0004]鉴定主效基因突变位点是实现现代分子育种的必要前提，在家畜中实现这一目的通常需要经过数量性状位点(QTL)定位、后裔同源染色体(IBD)精细定位、eQTL定位、置信区间的重测序、多态位点的搜寻以及大群体关联验证分析等一系列的研究。定位猪肌肉脂肪酸含量QTL的研究始于2000年,西班牙Perez-Enciso小组利用伊比利亚黑猪X长白猪的F2资源群体，在猪4号染色体上定位了显著影响C18:2含量的QTL。该小组在2003年利用同一个群体进行全基因组QTL扫描，并在8号染色体上发现影响C16:0和C16: 1，10号染色体上影响C14:0含量的多个QTL。此后，多个研究小组对肌肉和脂肪组织的脂肪酸含量组成进行了全基因组QTL定位。
[0005]发明人利用一个大规模白色杜洛克X 二花脸F2资源群体开展了全基因组QTL定位研究，并在4、7、8和X号染色体上定位了多个效应显著的QTL。从国际猪QTL数据库网站(http://www.animalgenome.0rg/cgi_bin/QTLdb/SS/index)可知，目前在猪所有染色体上都已定位到影响 脂肪酸组成的QTL，但大部分是利用微卫星标记定位的QTL，置信区间多在10-20cM，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，因此难以直接应用于种猪选育改良。
【发明内容】
[0006]因此，本发明提供一种影响猪肉脂肪酸组分的主效SNP标记，所述SNP标记位于猪14号染色体上的硬脂酰辅酶A脱氢酶基因(SCD基因)的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963718核苷酸位点，且其为C与T的突变，对应于SEQ ID NO:1上的第4513位，或所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963819核苷酸位点，且其为C与G的突变，对应于SEQ ID NO:1上的第4614位，前述两个位点完全连锁；并且所述SNP标记能够提高猪的单不饱和脂肪酸含量和/或降低饱和脂肪酸含量，所述单不饱和脂肪酸为C18:1和/或C16:l，所述饱和脂肪酸为C18:0和/或C16:0。
[0007]本发明通过现代分子生物学技术检测这两个关键标记位点的基因型，判定携带增加不饱和脂肪酸含量并降低饱和脂肪酸含量有利等位基因的个体。
[0008]本发明还相应提供一种鉴定如上所述的SNP标记的引物，所述引物的序列如SEQID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
[0009]本发明还提供一种如上所述的SNP标记在种猪肉质性状遗传改良中的应用，且所述种猪肉质性状遗传改良包括提高猪的单不饱和脂肪酸含量和/或降低饱和脂肪酸含量。根据该应用，优选所述种猪为杜洛克猪或含有杜洛克血缘的猪。
[0010]本发明中，利用所鉴别的主效标记信息开展种猪选育，利用标记辅助选择(MAS)选择有利基因型个体留种生产，以提高种猪猪肉的不饱和脂肪酸含量并降低饱和脂肪酸含量改良猪肉品质。
[0011]本发明还提供一种与S⑶基因中所述SNP标记的连锁不平衡程度(r2)大于0.8的SNP分子标记在种猪肉质性状遗传改良中的应用。
[0012]本发明提供一种种猪遗传改良的方法，包括，种猪继代选育国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963718位点的TT型个体和/或其g.120963819位点的GG型个体，淘汰g.120963718位点的TC基因型和CC基因型个体和/或淘汰g.120963819位点的GC基因型和CC基因型个体。
[0013]本发明中，还提供一种检测猪的生产性状的方法，包括检测序列表中SEQ ID NO:1的5’端第4513位核苷酸为C还是T，或者检测检测序列表中SEQ ID NO:1的5’端第4614位核苷酸为C还是G，确定基因型，然后通过基因型确定生产性状；且所述猪的生产性状为单不饱和脂肪酸C18:1和/或C16:1含量的高低，或为饱和脂肪酸C18:0和/或C16:0含
量的高低。
[0014]本发明又提供一种位于猪14号染色体上的SCD基因的核苷酸序列，所述序列为SEQ ID NO:1的第4513位由C突变为T且其4614位由C突变为G而得的序列；对应于国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963718位点由C突变为T且其g.120963819位点由C突变为G而得的序列。
[0015]本发明相应提供一种如上所述的核苷酸序列或SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在与猪肉中单不饱和脂肪酸C18:1含量相关的种猪选育中的应用，优选所述种猪为杜洛克猪或含有杜洛克血缘的猪。
[0016] 本发明还提供一对扩增SCD基因核苷酸序列片段的引物，其中，上游引物的序列为如SEQ ID N0:2所示的序列，下游引物的序列为如SEQ ID N0:3所示的序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为染色体上影响猪肌肉C18:0含量的GWAS定位结果示意图。其中，图1a为白色杜洛克猪X 二花脸猪F2群体的GWAS定位结果，图1b为苏太猪群体的GWAS定位结果，图1c为两个群体GWAS荟萃分析(meta-analysis)结果。其中,猪的18条常染色体信息标识于X轴，SNP与C18:0相关性的-1oglO(P)值按SNP在基因组中的位置显示于Y轴。横虚线表示的是染色体显著水平阈值，横实线表示的是基因组显著水平的阈值。
[0018]图2为猪14号染色体上影响猪肌肉C18:0含量QTL精细定位和S⑶主效基因鉴别示意图。在图2的上半部分中，曲线条表示在白色杜洛克X 二花脸F2群体和苏太猪群体中采用连锁不平衡/连锁(LDLA)定位分析结果，点表示GWAS分析结果，两条曲线线条中位于上方的一条表不F2群体,位于下方的一条表不苏太群体,米用-1oglO(P)值下降2确定的置信区间用阴影表示。在图2的下半部分中，该表格展示的是置信区间内所有11个位置候选基因表达量与C16:0、C16:1、C18:0和C18:1脂肪酸含量的相关性分析，表格中数字为Pearson相关系数，星号表示相关性对应的显著性P值小于0.05，从中可见S⑶基因表达量与C18:0含量的关联性最强。[0019]图3为S⑶基因结构示意图及12个候选主效突变位点在S⑶基因的物理位置，以及部分候选主效突变位点的生物信息学功能分析图。图3具体分为三部分。其中，最上部分为S⑶的基因结构图，它包括6个外显子、5’ UTR区、3’ UTR区和启动子区，且12个候选主效突变位点标识在相应的位置上(最上方的长横线上连接的12根短竖线表示)。中间部分为2个最有可能的主效突变位点在哺乳动物中的序列比对保守性分析。最下部分为利用UCSC网站查看相应人类SCD基因的生物信息学功能，其中2根长竖线为2个在猪基因组中的候选主效突变位点对应人类参考SCD基因序列的相应位置。
[0020]图4为SCD基因两个主效突变位点(g.120963718和g.120963819)不同基因型的Sanger测序结果峰图。
【具体实施方式】
[0021]实验猪群:本发明共使用了三种猪实验群体:白色杜洛克猪X 二花脸猪&资源群体、苏太猪(50%杜洛克猪和50%太湖猪血缘)群体和三元杂(杜洛克猪X (长白猪X大白猪))群体。
[0022]白色杜洛克猪X 二花脸猪F2资源群体以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪为祖代繁殖F1代，选9头F1代公猪与59头F1母猪交配，分6批次产生1912头F2代个体，将这些个体饲养至240日龄屠宰。
[0023]苏太猪是一个中国培育品种，由中国太湖猪和西方杜洛克猪杂交并经过超过18个世代的培育而成(各含50%太湖猪和50%杜洛克猪的血缘)；本发明所利用的苏太猪群是由4头苏太公猪与55头苏太母猪交配获得的461头后代，其中421头在240±3日龄屠宰。
[0024]杜长大三元杂交商品猪来自南昌蒋巷镇江西国鸿有限公司屠宰场，分多个批次屠宰并取602头195±3日龄的三元杂商品猪的背最长肌样本。三个猪群体均使用统一的饲料进行喂养，控制饲料对脂肪酸组成的影响。[0025]脂肪酸组分的检测:取屠宰个体左半边胴体的第5至第6根胸椎处背最长肌样品约log。使用氯仿甲醇溶液(3:1)提取总脂肪，送至江西省分析测试中心，用正己烷溶解总脂肪，在0.4mol KOH的甲醇溶液中进行甲酯化，最后使用气相色谱仪(GC-2010plus，日本岛津)进行检测。通过脂肪酸色谱峰图和脂肪酸标准溶液各成分的出峰时间对比确定脂肪酸成分，采用面积归一法计算各脂肪酸成分的百分含量。
[0026]实施例1
[0027]本实施例为具体解释得到本发明中SNP位点的发明过程。
[0028]猪全基因组6万个(60K)SNP基因型检测:从上述3个实验群体中的每个个体采集一小块耳组织样，利用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经过Nanodrop-100分光光度计检测质量后统一将浓度稀释至50ng/ul,在Illumina Beadstation平台上根据公司标准流程进行猪全基因组60K SNP (Illumina，美国)基因型判定。利用PLINK (1.07)对所有样本60K芯片数据进行质量控制，剔除检出率低于95%、家系孟德尔错误率高于0.1的个体；以及检出率低于95%，最小等位基因频率小于0.05和哈代-温伯格平衡显著性高于10_6的SNP标记。
[0029]全基因组关联(GWAS)分析，精细定位及候选基因的确定:使用R软件包GenABEL中的混合线性模型利用上述3个实验群体所有个体的60K SNP标记基因型数据和脂肪酸组成表型数据进行GWAS分析，采用Bonfeironi法确定SNP与脂肪酸表型性状关联程度的显著性阈值。白色杜洛克猪X 二花脸猪F2资源群体和苏太猪群体的GWAS结果均显示，猪14号染色体上存在与硬脂酸C18:0含量显著相关的SNP位点(图1)。在苏太猪群体中，采用整合连锁与连锁不平衡分析(LDLA)法，利用DualPHASE软件构建14号染色体SNP标记的单倍型并分析单倍型和表型之间的关联性，通过最显著位点的-1oglO (P)值下降2界定QTL的置信区间为1.4Mb，再通过基于单倍型效应估计的QTL基因型与SNP标记基因型的一致性分析，将该QTL位点确定在14号染色体上1.0Mb的范围内。该区域对应于国际猪基因组参考序列(10.2 版本)14 号染色体上的 120546475(H3GA0042050)至 121556717(ASGA0066126)的区间，在区间内一共存在11个已注释基因，分别为:NGRN、C10orf2、SCD、BL0ClS2、MRPL43、RPLP0、CHUK、CWE19L1、DNMBP、ERLINl 和 KAZALD1。利用白色杜洛克猪 X 二花脸猪 F2 资源群体中前期测量的600头猪肌肉基因数字表达谱数据(digital gene expression,DGE),分析这11个基因与C18:0含量的相关性(spearman correlation),结果显示S⑶基因表达水平与C18:0的相关性最强(图2)，这表明SCD基因是该区域最有可能影响脂肪酸组成的因果基因(causative gene)。
[0030]目标基因重测序:S⑶基因是多不饱和脂肪酸合成的限速酶，催化肌肉中的饱和脂肪酸C16:0、C18:0分别转化为C16:l、C18:l不饱和脂肪酸。该基因在哺乳动物中也与脂肪沉积性状相关。S⑶基因长度约16.7Kb，共有6个外显子。在Ensembl网站(http://asia.ensembl.0rg/index, html)下载猪硬脂酰辅酶A脱氢酶基因(SO))的基因组DNA序列，利用Primer3.0在线软件(http://frod0.w1.mit.edu/)设计28对引物(见表1)，以白色杜洛克猪X 二花脸猪F2资源群体中经标记辅助分离分析确定QTL基因型为杂合子(Qq)的2头H)公猪和QTL基因型为纯合子(qq) 9头H)母猪为模板，扩增SCD基因转录起始位点上游5kb和转录终止位点下游5kb区段。50ul的聚合酶链式反应(PCR)反应体系中，包括IOOng的猪基因组DNA，2.5mM MgCl2,0.4mM dNTP，正反向引物各20pmol，2.5单位DNA聚合酶(Taq酶)及10*PCR buffer (缓冲液)(上海申能博彩有限公司)。PCR采用Touchdown程序，扩增条件为:94°C 5min ；94°C 30s，68°C(每个循环降 0.5°C)30s，72°C 60s。94V 30s,55V 30s, 72°C 60s, 18个循环；最后在72°C延伸lOmin。PCR扩增产物采用QIAquick DNA纯化试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)纯化后送至上海生工生物工程有限公司直接测序，测序结果利用公用的DNAStar的SeqMan软件进行分析。共检测到72个多态位点，其中包括70个SNP和两个缺失插入位点。
[0031]表1
[0032]
【权利要求】
1.一种影响猪肉脂肪酸组分的主效SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于猪14号染色体上的硬脂酰辅酶A脱氢酶基因(SCD基因)的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963718核苷酸位点，且其为C与T的突变，对应于SEQ ID NO:1上的第4513位，或所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963819核苷酸位点，且其为C与G的突变，对应于SEQID NO:1上的第4614位，前述两个位点完全连锁；并且所述SNP标记能够提高猪的单不饱和脂肪酸含量和/或降低饱和脂肪酸含量，所述单不饱和脂肪酸为C18:1和/或C16:1，所述饱和脂肪酸为C18:0和/或C16:0。
2.一种鉴定如权利要求1所述的SNP标记的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
3.—种如权利要求1所述的SNP标记在种猪肉质性状遗传改良中的应用，且所述种猪肉质性状遗传改良包括提高猪的单不饱和脂肪酸含量和/或降低饱和脂肪酸含量。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述种猪为杜洛克猪或含有杜洛克血缘的猪。
5.与权利要求1的S⑶基因中SNP标记的连锁不平衡程度(r2)大于0.8的SNP分子标记在种猪肉质性状遗传改良中的应用。
6.一种种猪遗传改良的方法，其特征在于，种猪继代选育国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963718位点的TT型个体和/或其g.120963819位点的GG型个体，淘汰g.120963718位点的TC基因型和CC基因型个体和/或淘汰g.120963819位点的GC基因型和CC基因型个体。
7.一种检测猪的生产性状的方法，包括检测序列表中SEQ ID NO:1的5’端第4513位核苷酸为C还是T，或者检测检测序列表中SEQ ID NO:1的5’端第4614位核苷酸为C还是G，确定基因型，然后通过基因型确定生产性状；且所述猪的生产性状为单不饱和脂肪酸C18:1和/或C16:1含量的高低，或为饱和脂肪酸C18:0和/或C16:0含量的高低。
8.一种位于猪14号染色体上的S⑶基因的核苷酸序列，所述序列为SEQ ID NO:1的第4513位由C突变为T且其4614位由C突变为G而得的序列；对应于国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.120963718位点由C突变为T且其g.120963819位点由C突变为G而得的序列。
9.一种如权利要求8所述的核苷酸序列或SEQ ID ΝΟ:1所示的核苷酸序列在与猪肉中单不饱和脂肪酸C18:1含量 相关的种猪选育中的应用，优选所述种猪为杜洛克猪或含有杜洛克血缘的猪。
10.一对扩增SCD基因核苷酸序列片段的引物，其特征在于，上游引物的序列为如SEQID NO:2所示的序列，下游引物的序列为如SEQ ID NO:3所示的序列。
【文档编号】C12Q1/68GK103911373SQ201410100377
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】任军, 杨斌, 麻骏武, 张万昌, 黄路生 申请人:江西农业大学