检测溶液中的汞离子的方法和试剂盒的制作方法

检测溶液中的汞离子的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了检测溶液中的汞离子的方法和试剂盒。所述方法包括：1）将所述溶液与含有胸腺嘧啶（T）的单链DNA混合形成混合物，使得所述含有胸腺嘧啶的单链DNA通过T-Hg2+-T碱基对形成双链DNA，其中所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的至少一个脱氧核糖核苷酸上连接有信号产生分子；2）使步骤1）所得的双链DNA与特异于双链DNA的核酸外切酶接触，使得所述核酸外切酶切割所述双链DNA，释放出连接有所述信号产生分子的脱氧核糖核苷酸；以及3）检测步骤2）中释放出的所述脱氧核糖核苷酸所连接的信号产生分子。本发明的方法特异性和灵敏度高、无需固定DNA、操作简便、可实现快速检测。
【专利说明】检测溶液中的汞离子的方法和试剂盒

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化学和电化学领域，具体涉及检测溶液中的汞离子的方法和试剂 盒。

【背景技术】
[0002] 金属离子和核酸碱基之间具有特定的结合相互作用。例如，诸如Ag+、Hg2+、Cu 2+、 Ni2+等金属离子可通过配位力与特定的天然或合成核苷酸结合，形成金属离子介导的碱基 对，其中Watson-Crick (W-C)型碱基对中的氢键被金属-碱基键取代。这种核酸与金属离 子的新型相互作用在多种应用中具有巨大前景，包括制备基于DNA的生物传感器，设计分 子水平的逻辑门（logic gate)以及调节DNA功能。
[0003] 汞离子（Hg2+)是一种生物累积性及具有高毒性的环境污染物，它能引起严重的人 类健康问题，例如DNA损伤、脑损伤、器官功能衰竭、以及免疫系统平衡的破坏。由于对环 境和食物中的Hg 2+污染的关注日益增加，需要发展能够对水性介质中的Hg2+进行灵敏的现 场检测的方法，以用于环境保护和疾病的预防中。最近，0n〇和Togashi报道的Hg 2+与双胸 腺嘧啶（T)之间的配位相互作用启发了基于DNA的Hg2+生物传感器的新方法(请参见文献 "0no，A. ;Togashi，H. Angew.Chem.，Int. Ed. 2004, 43, 4300-4302"、"Tanaka, Y. ;0da，S. ; Yam aguchi，H. ;Kondo，Y. ;Kojima，C. ;0no，A.J.Am. Chem.Soc. 2007, 129,244?245，' 和" Miyake, Y. ;Togashi,H. ;Tashiro, M. ; Yamaguchi, H. ; Oda, S. ;Kudo, M. ; Tanaka, Y. ;Kondo, Y. ; Sawa, R. ;Fujimoto，T. ;Machina_mi，T. ;0no, A. J. Am. Chem.Soc. 2006, 128, 2172?2173，'）。具体地 说，DNA双链中的T-T错配（T-T mismatch)能吸引水溶液中的Hg2+，从而形成稳定的带有 Hg2+介导的T-T DNA碱基配对的DNA双链。T-Hg2+-T碱基对的结合常数比天然A-T碱基对 的高得多。更重要的是，这种T-Hg 2+-T相互作用具有高度特异性，且只有Hg2+能使T-T碱基 对稳定。这一发现导致发展了许多荧光、色度和电化学传感器，它们针对其他金属离子的干 扰具有良好的选择性。然而，这些传感器中的大部分几乎都不能实现在较低的纳摩尔范围 内的检测，这限制了这种技术在饮用水中的Hg 2+检测中的应用，因为根据美国环境保护局 (EPA)指定的Hg2+毒性水平，这种检测要求检测下限要达到10nM。
[0004] 最近，基于具有金属离子介导的碱基对的DNA双链（M-dsDNA)与天然双链DNA (dsDNA)的二级结构之间的相似性，几个研究小组报道了正常dsDNA的很多功能和应用也 适用于M-dsDNA，并报道了具有更高灵敏度的Hg 2+传感器。例如，Liu等人报道了可通过 由Hg2+与T-T错配的配位导致的变构相互作用来开启DNA酶（DNAzyme)的催化活性，并由 此发展了一种灵敏度下限达2. 4nM的Hg2+检测平台（请参见文献"Liu, J. W. ;Lu, Y. Angew. Chem.，Int. Ed. 2007, 119, 7731?7734")。但是，这种基于DNA酶的传感器容易受到其他金 属离子的干扰。Li等人报道了 Hg2+可开启刻痕核酸内切酶（nicking endonuclease)对具 有T-T错配的DNA双链的切割活性(请参见文献"Li，F. ; Feng, Υ· ; Liu, S. F. ; Tang, Β· Chem. Commun. 2011，47, 6347?6349")。Urata等人和Park等人均报道了 DNA聚合酶能识别引物 3'端的金属配位T-Hg2+-T碱基对并使引物沿着模板DNA延伸(请参见文献"Urata，Η. ; Yama guchi, E. ;Funai, T. ;Matsumura, Y. ;Wada, S. Angew. Chem.，Int. Ed. 2010, 49, 6516?6519"和 "Park, K. S. ; Jung, C. ;Park, H. G. Angew. Chem.，Int. Ed. 2010, 49, 9757?9760，，）。此后，Zhu 等人报道了一种免标记Hg2+传感器，通过聚合酶辅助的荧光扩增达到了 40pM的低检测下限 (请参见文献 "Zhu, X. ; Zhou, X. M. ; Xing, D. Biosens· Bioelectron· 2011，26, 2666?2669，，）。 但是，这种方法需要多个步骤的操作以及复杂的荧光仪器，因此不适合用于现场检测。


【发明内容】

[0005] 为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种检测溶液中的汞离子的 方法，还提供了一种检测溶液中的汞离子的试剂盒。
[0006] 具体而言，本发明提供了：
[0007] ( 1) -种检测溶液中的汞离子的方法，该方法包括：
[0008] 1)将所述溶液与含有胸腺嘧啶（T)的单链DNA混合形成混合物，使得所述含有胸 腺嘧啶的单链DNA通过T-Hg 2+-T碱基对形成双链DNA，其中所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的 至少一个脱氧核糖核苷酸上连接有信号产生分子；
[0009] 2)使步骤1)所得的双链DNA与特异于双链DNA的核酸外切酶接触，使得所述核酸 外切酶切割所述双链DNA，释放出连接有所述信号产生分子的脱氧核糖核苷酸；以及 [0010] 3)检测步骤2)中释放出的所述脱氧核糖核苷酸所连接的信号产生分子。
[0011] (2)根据（1)所述的方法，其中所述溶液的汞离子浓度为0. 2nM至200μΜ。
[0012] (3)根据（1)或（2)所述的方法，其中所述胸腺嘧啶占所述单链DNA的总碱基数的 50%-80%〇
[0013] (4)根据（1)- (3)中任意一项所述的方法，其中所述含有胸腺嘧啶的单链DNA具 有20-40个核苷酸的长度。
[0014] (5)根据（1)- (4)中任意一项所述的方法，其中在步骤1)所述的混合物中，所述 含有胸腺嘧啶的单链DNA的浓度为1-5 μ M。
[0015] (6)根据（1)- (5)中任意一项所述的方法，其中，在所述含有胸腺嘧啶的单 链DNA中，所述连接有信号产生分子的脱氧核糖核苷酸占所述单链DNA的总核苷酸数的 3. 8%-30, 8%〇
[0016] (7)根据（1)- (6)中任意一项所述的方法，其中所述信号产生分子为电活性分子。
[0017] (8)根据（7)所述的方法，其中所述电活性分子选自亚甲基蓝和二茂铁。
[0018] (9)根据（1)- (8)中任意一项所述的方法，其中在步骤2)中，所述双链DNA与所 述核酸外切酶在30-50°C下反应10-30分钟。
[0019] (10)根据（1)- (9)中任意一项所述的方法，其中所述核酸外切酶选自大肠杆菌 核酸外切酶III、λ噬菌体核酸外切酶、和T7噬菌体基因6核酸外切酶。
[0020] (11)根据（1)- (10)中任意一项所述的方法，其中所述信号产生分子为亚甲基蓝， 该信号产生分子连接在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的3'端部分；所述核酸外切酶为大肠 杆菌核酸外切酶III。
[0021] (12)根据（1)- (11)中任意一项所述的方法，其中在步骤3)中，利用位于电极芯 片上的带负电荷的氧化铟锡玻璃电极检测释放出的所述脱氧核糖核苷酸所连接的信号产 生分子。
[0022] (13)根据（1) - (12)中任意一项所述的方法，其中步骤2)中所述的核酸外切酶 对所述双链DNA进行的切割还包括：切割该双链DNA中的T-Hg 2+-T碱基对，使该碱基对中的 Hg2+游离出来，从而与其他含有胸腺嘧啶的单链DNA结合。
[0023] (14) -种检测溶液中的汞离子的试剂盒，包括：
[0024] 含有胸腺嘧啶的单链DNA，该含有胸腺嘧啶的单链DNA包含至少一个连接有信号 产生分子的脱氧核糖核苷酸；
[0025] 特异于双链DNA的核酸外切酶；以及
[0026] 检测试剂，该检测试剂能够与游离态的所述脱氧核糖核苷酸所连接的信号产生分 子作用而产生信号。
[0027] (15)根据（14)所述的试剂盒，其中所述胸腺嘧啶占所述单链DNA的总碱基数的 50%-80%〇
[0028] (16)根据（14)或（15)所述的试剂盒，其中所述含有胸腺嘧啶的单链DNA具有 20-40个核苷酸的长度。
[0029] (17)根据（14)- (16)中任意一项所述的试剂盒，其中，在所述含有胸腺嘧啶的 单链DNA中，连接有所述信号产生分子的脱氧核糖核苷酸占所述单链DNA的总核苷酸数的 3. 8%-30, 8%〇
[0030] (18)根据（14)- (17)中任意一项所述的试剂盒，其中所述信号产生分子为电活 性分子。
[0031] (19)根据（18)所述的试剂盒，其中所述电活性分子选自亚甲基蓝和二茂铁。
[0032] (20)根据（14) - (19)中任意一项所述的试剂盒，其中所述核酸外切酶选自大肠 杆菌核酸外切酶III、λ噬菌体核酸外切酶、和T7噬菌体基因6核酸外切酶。
[0033] (21)根据（14)- (20)中任意一项所述的试剂盒，其中所述信号产生分子为亚甲 基蓝，该信号产生分子连接在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的3'端部分；所述核酸外切酶 为大肠杆菌核酸外切酶III。
[0034] (22)根据（14)- (21)中任意一项所述的试剂盒，其中所述检测试剂为带负电荷 的氧化铟锡玻璃电极的形式，该带负电荷的氧化铟锡玻璃电极位于电极芯片上。
[0035] 本发明通过由金属离子引起的构型依赖性核酸外切酶活性，发展了一种电化学 Hg2+传感器平台，其与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0036] 1.本发明通过使用标记有信号产生分子的富含胸腺嘧啶的单链DNA、以及特异于 双链DNA的核酸外切酶，使得能够高度特异性地定性和定量检测溶液中的Hg 2+ ;
[0037] 2.所述核酸外切酶通过切割双链DNA，可使Hg2+从T-Hg2+_T碱基对中释放出来，使 其回到溶液相中，继而与其他富含T的单链DNA结合，由此形成Hg 2+循环机制，从而放大检 测体系所产生的电信号，由此大大提高了检测灵敏度；
[0038] 3.本发明的方法无需固定DNA、操作简便、可实现快速检测。

【专利附图】

【附图说明】
[0039] 图1A为示出大肠杆菌核酸外切酶III (Exo III)对Ref-〇ligol/Ref-〇ligo2双 链中的Ref-oligonl的降解作用的示意图；图1B示出Hg 2+对Exo III的活性的抑制效应 的 PAGE 分析结果；其中，a:2yM Ref_oligol+2yM Ref-〇ligo2;b:2yM Ref-〇ligo2;c: 2μΜ Ref-oligol+2 μ Μ Ref-〇ligo2+Exo III ；d：2uM Ref-〇ligol+2 μ M Ref-〇ligo2+Exo ΙΙΙ + ΙΟμΜ Hg2+；e：2yM Ref-〇ligol+2 μ M Ref-〇ligo2+Exo ΙΙΙ + ΙΟΟμΜ Hg2+；f ： 2μΜ Ref-oligol+2 μ M Ref-〇ligo2+Exo ΙΙΙ+200μΜ Hg2+；g：2uM Ref-〇ligol+2 μ M Ref-〇ligo2+Exo ΙΙΙ+500μΜ Hg2+〇
[0040] 图2A示出含有不同数目的T-Hg2+-T碱基对的DNA双链的序列；图2B示出A中所 示的DNA双链的降解产物的PAGE分析结果；其中，a :2 μ M Ref-oligol+2 μ M Ref_oligo2 ; b：2uM Ref-〇ligo2 ；c ：2 μ Μ Ref-oligol+2 μ M Ref-〇ligo2+Exo ΙΙΙ+20μΜ Hg2+；d ： 2μΜ Ref-〇ligo3+2 μ M Ref-〇ligo4+Exo ΙΙΙ+20μΜ Hg2+；e：2uM Ref-〇ligo5+2 μ Μ Ref-〇ligo6+Exo ΙΙΙ+20μΜ Hg2+；f：2uM Ref-〇ligo7+2 μ Μ Ref-〇ligo8+Exo ΙΙΙ+20μΜ Hg2+；g：2yM Ref-〇ligo9+2yM Ref-oligolO+Exo ΙΙΙ+20μΜ Hg2+〇
[0041] 图3为示出通过本发明的一个实施方案的免固定电化学检测方法检测所设计的 e-T-rich探针的降解的示意图，其中所述e-T-rich探针的降解由Hg2+触发，并且由Exo III 催化。
[0042] 图4示出所显示的不同反应混合物在37°C (A)或45°C (B)下分别温育20分钟后 的示差脉冲伏安法（DPV)扫描结果；图中的探针代表e-T-rich探针。
[0043] 图5A示出在分别存在20 μ Μ或0. 1 μ M Hg2+的情况下，DPV峰电流对温育时间的曲 线图；图5B示出A中的反应混合物的PAGE分析结果；其中，a :2μΜ e-T-rich探针；b :2μΜ e-T-rich 探针+Εχο ΙΙΙ;(3:2μΜ e-T-rich 探针+Εχο ΙΙΙ+Ο.ΙμΜ Hg2+;d:2yM e-T-rich 探针+Exo ΙΙΙ+20μΜ Hg2+。
[0044] 图6示出本发明方法的灵敏度；其中，A示出含有2 μ M e-T-rich探针、20单位Exo III和不同浓度Hg2+的反应混合物在45°C下温育20分钟后的DPV扫描结果；B示出DPV峰 电流对Hg 2+浓度的曲线图，其中的小图示出DPV峰电流对较低的Hg2+浓度的曲线图；平均 值和标准差由二次独立实验获得。
[0045] 图7示出不同反应混合物的DPV扫描结果，该结果显示本发明方法的选择特异性， 其中所有竞争金属离子在1 μ Μ、5 μ Μ和10 μ Μ下进行测试；还显示了对10nM、50nM和500nM 的Hg2+离子的反应信号，以作为比较。

【具体实施方式】
[0046] 本发明提供了一种检测溶液中的汞离子的方法，该方法包括：
[0047] 1)将所述溶液与含有胸腺嘧啶（T)的单链DNA混合形成混合物，使得所述含有胸 腺嘧啶的单链DNA通过T-Hg 2+-T碱基对形成双链DNA，其中所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的 至少一个脱氧核糖核苷酸上连接有信号产生分子；
[0048] 2)使步骤1)所得的双链DNA与特异于双链DNA的核酸外切酶接触，使得所述核酸 外切酶切割所述双链DNA，释放出连接有所述信号产生分子的脱氧核糖核苷酸；以及
[0049] 3)检测步骤2)中释放出的所述脱氧核糖核苷酸所连接的信号产生分子。
[0050] 在本文中，术语"信号产生分子"是指能够指示单链DNA形成双链DNA从而被特异 于双链DNA的核酸外切酶切割、并且能够被检测到的物质。特别地，所述信号产生分子在连 接在DNA上时不能产生信号，只有当DNA被切割为游离的脱氧核糖核苷酸时，连接在该游离 的脱氧核糖核苷酸上的信号产生分子才能够产生信号。
[0051 ] 在本发明中，信号产生分子可以为电活性分子，例如，诸如亚甲基蓝和二茂铁等易 标记在脱氧核糖核苷酸上的电活性分子。可以利用能够与该电活性分子发生相互作用的检 测试剂对连接在游离的脱氧核糖核苷酸上的该电活性分子进行检测，所述检测试剂优选带 负电荷并且位于电极芯片上。所述电活性分子与所述检测试剂之间的相互作用可以为例如 氧化还原反应，由此产生电子传递，从而提供电化学信号。
[0052] 在这种情况中，当没有Hg2+时，含有胸腺嘧啶的单链DNA呈无规卷曲的单链结构， 不能被特异于双链DNA的核酸外切酶降解。由于DNA的负电骨架使其与带负电的检测试剂 之间存在静电排斥作用，连接在DNA上的信号产生分子无法与检测试剂接触，因此几乎观 察不到电化学信号。当加入Hg 2+时，含有胸腺嘧啶的单链DNA能形成T-Hg2+-T碱基对，从而 形成双链DNA，其能够被特异于双链DNA的核酸外切酶识别，从而使单核苷酸逐一被切割下 来，当标记有信号产生分子的单核苷酸被切下来后，由于该单核苷酸带较少的负电荷并且 体积更小，其更易扩散到所述带负电的检测试剂表面，从而使信号产生分子能够与所述检 测试剂相互作用而产生电化学信号。
[0053] 在一个具体的实施方案中，所述检测试剂为带负电荷的氧化铟锡玻璃电极，该带 负电荷的氧化铟锡玻璃电极位于电极芯片上；所述电极芯片主要由一个钼对电极、一个钼 准参比电极、以及四个作为工作电极的圆形ΙΤ0电极组成，并且依次经过Alconox溶液清 洗、异丙醇清洗、水清洗而形成带负电荷的工作电极表面。
[0054] 在本发明中，在所述特异于双链DNA的核酸外切酶降解双链DNA的过程中，能够使 Hg2+从T-Hg2+-T结构中释放出来，释放出来的Hg2+又会与其他的含有胸腺嘧啶的单链DNA 结合从而形成双链DNA，由此进行新一轮的降解过程。以这种方式，Hg2+能够在溶液相和 T-Hg2+-T中循环使用，从而作为酶催化引发剂来放大双链DNA的降解过程，从而产生放大的 电化学信号。
[0055] 优选地，在本发明的方法中，所述含有胸腺嘧啶的单链DNA为具有20-40个(例如 20个、21个、22个、23个、24个、25个…36个、37个、38个、39个、40个)脱氧核糖核苷酸的 寡核苷酸。所述胸腺嘧啶优选占所述单链DNA的总碱基数的50%-80% (例如50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%)。
[0056] 优选地，在本发明的所述步骤1)中，在待测溶液中，汞离子的浓度优选在0. 2nM至 200 μ Μ的范围内。在步骤1)所述的混合物中，所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的浓度优选为 1_5 u Μ〇
[0057] 还优选地，在所述步骤1)中，使所述汞离子与所述含有胸腺嘧啶的单链DNA在 20-45°C下反应至少1-30分钟，优选在37-45°C下反应至少1-30分钟，更优选在45°C下反 应30分钟。
[0058] 优选地，所述特异于双链DNA的核酸外切酶选自大肠杆菌核酸外切酶III (Exo III)、λ噬菌体核酸外切酶、和T7噬菌体基因6核酸外切酶，其中更优选大肠杆菌核酸外 切酶III。
[0059] 优选地，在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA中，所述连接有信号产生分子的脱氧核 糖核苷酸占所述单链DNA的总核苷酸数的3. 8%-30. 8%。
[0060] 当使用从双链DNA的3'端开始切割的核酸外切酶时，所述信号产生分子优选连接 在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的3'端部分，更优选连接在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA 的3'端部分的T碱基上，更优选连接在3'末端的T碱基上；当使用从双链DNA的5'端开 始切割的核酸外切酶时，所述信号产生分子优选连接在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的5' 端部分，更优选连接在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的5'端部分的T碱基上，更优选连接 在5'末端的T碱基上。
[0061] 在本文中，术语"3'端部分"是指DNA的3'末端核苷酸或靠近3'末端的核苷酸； 术语"5'端部分"是指DNA的5'末端核苷酸或靠近5'末端的核苷酸；术语"3'末端"是指 从DNA的3'端开始的第一个核苷酸；术语"5'末端"是指从DNA的5'端开始的第一个核 苷酸。
[0062] 将信号产生分子标记到DNA中的脱氧核糖核苷酸上的方法是本领域已知 的。例如，当信号产生分子为亚甲基蓝时，可以通过文献"Xiao，Y. ;Qu，X. ;Plaxc〇，K. W. ;Heeger，A. J. J. Am. Chem. Soc.，2007, 129(39)，ppll896 - 11897" 中所述的方法进行标 记。
[0063] 优选地，在所述步骤2)中，使所形成的双链DNA与所述特异于双链DNA的核酸外 切酶在30-45°C下反应1-30分钟，优选在37-45°C下反应1-30分钟，更优选在45°C下反应 30分钟。在本发明中，特异于双链DNA的核酸外切酶的酶切反应也可以在4°C下进行，这样 该酶对双链DNA的特异性更高，但会大大延长反应时间(例如需要反应24小时)。
[0064] 在本发明中，检测所产生的电化学信号的方法是本领域已知的。例如，可以利用由 General Purpose Electrochemical System(GPES)(通用电化学系统）软件（Eco Chemie) 控制的Autolab PGSTAT30稳压器/稳流器（Eco Chemie，荷兰）进行电化学测量。
[0065] 在本发明的方法中，可以在所述步骤1)的反应完成后再向体系中加入所述步骤 2)所用的核酸外切酶，也可以将所有反应物（即，汞离子、标记有信号产生分子的含有胸腺 嘧啶的单链DNA、以及特异于双链DNA的核酸外切酶）同时混合。
[0066] 在本发明的方法中，可以在所述步骤1)和2)的反应完成后，再取样单独进行所述 步骤3 )所述的检测。也可以在同一体系内进行所述步骤1 )、2 )和3 )。
[0067] 本发明还提供了一种检测溶液中的汞离子的试剂盒，包括：
[0068] 含有胸腺嘧啶的单链DNA，该含有胸腺嘧啶的单链DNA包含至少一个连接有信号 产生分子的脱氧核糖核苷酸；
[0069] 特异于双链DNA的核酸外切酶；以及
[0070] 检测试剂，该检测试剂能够与游离态的所述脱氧核糖核苷酸所连接的信号产生分 子作用而产生信号。
[0071] 优选地，所述含有胸腺嘧啶的单链DNA为具有20-40个脱氧核糖核苷酸的寡核苷 酸。所述胸腺嘧啶优选占所述单链DNA的总碱基数的50%-80%。
[0072] 还优选地，在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA中，连接有所述信号产生分子的脱氧 核糖核苷酸占所述单链DNA的总核苷酸数的3. 8%-30. 8%。
[0073] 优选地，所述信号产生分子为电活性分子，例如，诸如亚甲基蓝和二茂铁等易标记 在脱氧核糖核苷酸上的电活性分子。
[0074] 所述核酸外切酶优选选自大肠杆菌核酸外切酶III、λ噬菌体核酸外切酶、和T7 噬菌体基因6核酸外切酶，其中更优选大肠杆菌核酸外切酶III。
[0075] 在一个优选的实施方案中，所述信号产生分子为亚甲基蓝，该信号产生分子连接 在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的3'端部分；所述核酸外切酶为大肠杆菌核酸外切酶III。 更优选地，所述信号产生分子连接在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的3'端部分的T碱基上， 更优选连接在3'末端的T碱基上。
[0076] 所述检测试剂优选为能够与所述电活性分子发生相互作用的物质，其优选带负电 荷并且位于电极芯片上。所述电活性分子与所述检测试剂之间的相互作用可以为例如氧化 还原反应，由此产生电子传递，从而提供电化学信号。
[0077] 在一个具体的实施方案中，所述检测试剂为带负电荷的氧化铟锡玻璃电极，该带 负电荷的氧化铟锡玻璃电极位于电极芯片上；所述电极芯片主要由一个钼对电极、一个钼 准参比电极、以及四个作为工作电极的圆形ΙΤ0电极组成，并且依次经过Alconox溶液清 洗、异丙醇清洗、水清洗而形成带负电荷的工作电极表面。
[0078] 例子 [0079] 试剂
[0080] Exo III 购自 New England Biolabs 公司（USA)，未经进一步纯化。
[0081] 10XNEBufferl(lXNEBufTerl :10mM Bis-Tris-丙烷-HC1，10mM MgC12, ImM 二硫 苏糖醇，ρΗ7· 0, 25°C )购自 New England Biolabs, Inc. (USA)，未经进一步纯化。
[0082] 亚甲基蓝修饰富T寡核苷酸（e-T-rich探针）购自Biosearch Technologies公 司（USA)，序列如下：5' -CATTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTTT-(亚甲基蓝）-G-3'，其中亚甲基蓝 修饰在斜体T上。
[0083] 以下参比寡核苷酸购自Invitr〇gen(USA)，并以标准脱盐纯化：参比寡核苷酸1 (R ef-oligol: 5'-GTAGCGGTCTTGCGG-3'）、参比寡核苷酸 2 (Ref-oligo2:5'-CCGCAAGACCGCTACA AAAA-3'）、参比寡核苷酸 3(Ref_oligo3:5' -GTAGCGGTCTTGCGG-3'）、参比寡核苷酸 4(Ref-〇 1 igo4:5' -CCGCTAGACCGCTACAAAAA-3'）、参比寡核苷酸 5 (Ref-oligo5:5' -GTAGCGGTCTTGCGG -3'）、参比寡核苷酸 6 (Ref_oligo6:5' -CCGCTAGTCCGCTACAAAAA-3'）、参比寡核苷酸 7 (Ref-〇1 igo7:5' -GTAGCGGTCTTGCGG-3'）、参比寡核苷酸 8 (Ref-oligo8:5' -CCGCTTGACCGCTACAAAA A-3'）、参比寡核苷酸 9(Ref_oligo9:5' -GTAGCGGCTTTGCGG-3'）和参比寡核苷酸 10(Ref-〇 ligol0:5' -CCGCTTTGCCGCTACAAAAA-3'）。
[0084] 10 X TBE (Tris-硼酸盐-EDTA)缓冲液购自 Fermentas (加拿大）。
[0085] GelRed?核酸凝胶染色剂（10, 000X，溶于水中）购自Biotium(USA)。
[0086] 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1) 30%凝胶母液购自Bio-Rad (USA)。
[0087] 过硫酸铵（APS)购自USB公司（USA)。
[0088] N，N，Ν'，Ν' -四甲基乙二胺（TEMED)、金属盐（Hg (N03) 2、Pb (N03) 2、Ni (N03) 2、 Cd(N03)2、FeCl2、FeCl3、ZnCl 2、CuCl2 和 MnCl2)购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, M0, USA)。
[0089] 所有水性溶液均以Milli-Q试剂级水系统（Millipore，USA)去离子水（电阻率 >18. 2ΜΩ/>)配制。
[0090] 在下列试验例和实施例中采用下述方法进行ΙΤ0电极芯片的处理和电化学测量。
[0091] 用于电化学测量的具有ΙΤ0涂层的玻璃芯片在香港科技大学的纳米电子制备所 (NFF)中制备。其设计与本研究小组先前报道的用于免固定电化学DNA检测的微芯片相 同（请参见文献 "Xuan, F. ;Luo, X. ;Hsing, I. Μ. Anal. Chem. 2012, 84, 5216-5220"），该芯片主 要由一个钼对电极、一个钼准参比电极、以及四个作为工作电极的圆形ΙΤ0电极组成。每 个ITO工作电极的有效面积是7. 85Xl(T3cm2。钼准参比电极在lXNEBufferl中相对于 银/氯化银参比电极的电势为+〇. 36V。在每次电化学测量之前，所使用的检测芯片依次在 Alconox溶液（8克Alconox (Sigma-Aldrich) /升水）中超声清洗15分钟，在异丙醇中超 声清洗15分钟，在水中超声清洗15分钟两次。经过这些清洗程序，形成了带负电荷的工作 电极表面。米用由 General Purpose Electrochemical System(GPES)(通用电化学系统） 软件（Eco Chemie)控制的Autolab PGSTAT30稳压器/稳流器（Eco Chemie，荷兰）进行电 化学测量。在C1000?热循环仪（Bio-Rad，USA)中温育样品。在每次测量时，将1.5微升的 每种待测样品溶液加到到芯片上，以覆盖钼对电极、钼准参比电极以及一个IT0工作电极， 利用差示脉冲伏安法（DPV)进行扫描，测量电流。
[0092] 如无特别说明，在下列试验例和实施例中，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测分 析的具体步骤如下：
[0093] 将5mL30%的丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1)凝胶溶液、lmL TBE缓冲液（10X )、 100 μ L APS、10 μ L TEMED和3. 89mL去离子水混合，以制备水凝胶。该混合物的最终凝胶 百分比为15%。使凝胶在室温下聚合1小时，之后浸泡在1XTBE缓冲液（pH=8. 3)中以备使 用。将5yL各试验样品与1 μ L6X上样缓冲液（loading buffer)混合，然后进行15%非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)。该PAGE在1XTBE缓冲液中、在室温、150V恒压下进行 大约40分钟。用稀释的Gel-Red溶液染色，之后用Gel Doc?XR记录系统（Bi〇-Rad，USA) 扫描凝胶。
[0094] 试验例1 :Hg2+对核酸外切酶（Exo III)抑制作用的研究
[0095] 使 2μΜ Ref-oligol 和 2μΜ Ref_oligo2 于室温下在缓冲液 lXNEBufferl 中杂 交20分钟。随后加入不同浓度的Hg2+ (0-500 μ M)，将混合均匀的溶液在室温下放置20分 钟。然后，加入20单位的ΕχοΙΙΙ至总体积为50yL，并于37°C放置10分钟。最后，将这些 混合液加热至80°C保持10分钟，以使Exo III失去活性。使所有的样品溶液缓慢地冷却至 室温(大约20分钟)，以备进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)分析。
[0096] Exo III具有特异地作用于双链DNA (dsDNA)的3' 一 5'外切酶活性，从一端开始 降解，得到互补的单链DNA (ssDNA)和5' -P单核苷酸。该酶对双链结构具有高度特异性， 能够从平末端、3'凹末端及有切口的DNA位点开始降解，但是当3'端含4个碱基以上的突 出末端时，其降解活性受到限制(请参见文献"Zuo，X. ;Xia，F. ;Xiao，Y. ;Plaxco，K.W. J.Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1816-1818"）。Exo III 的活性受一些阳离子影响。例如，Mg2+和 Co2+作 为必要的金属辅助因子支持其活性，而Na+，Pb2+，Fe2+和Cd 2+则抑制其活性。最近，Yuan小组 报导了 Hg2+可能对Exo III活性有抑制作用。在基于Exo III的Hg2+检测实验中，为了消除 Hg2+本身对Exo III活性的可能的抑制作用，发明人首先研究了在不同Hg2+浓度下，dsDNA 被Exo III降解的情况。如图1A所示，Ref-oligol序列被设计为与Ref_oligo2的5'部分 互补，形成平末端。因此，Exo III将从Ref-oligol的3'端开始对其降解，切割得到5'-P 单核苷酸，直至降解至Ref-oligol的末端，或者Ref-oligol的残余片段从Ref_oligo2上 脱离下来。由于Ref-〇lig 〇2的3'端具有5nt的突出末端，因此不会被降解。如图1B所 示，泳道a和泳道b分别对应Ref-〇ligol/Ref-〇ligo2双链和Ref_oligo2。泳道c和泳道 b的条带在同一位置，说明当没有Hg2+时，Ref-oligol被Exo III完全降解。当Hg2+浓度为 10μΜ或100 μΜ时，泳道d和泳道e的条带与泳道b的条带也在同一位置，说明Ref-oligol 也被Exo III完全降解。这说明当Hg2+浓度低于100 μ Μ时，其对Exo III的活性几乎没有 影响。当Hg2+浓度为200 μ Μ时，泳道f中存在代表Ref-〇ligol/Ref-〇ligo2双链的条带，由 于Ref-〇lig 〇l/Ref-〇lig〇2双链中的Ref-oligol没有被完全降解，因此说明此浓度的Hg 2+ 抑制了 Exo III的活性。当Hg2+浓度增至500 μ Μ时，Exo III的活性被完全抑制，因此没 有观察到代表Ref_oligo2的条带。这些实验结果证明，在此实验条件下，只有当Hg 2+达到 相当高的浓度时，才对Exo III的活性有抑制作用。
[0097] 试验例2 :Exo III对具有T-Hg2+_T碱基对的DNA双链的酶切活性的研究
[0098] 首先，在缓冲液 lXNEBufferl 中分别混合 2μΜ Ref-oligol 和 2μΜ Ref_oligo2、 2μΜ Ref_oligo3 和 2μΜ Ref_oligo4、2yM Ref_oligo5 和 2μΜ Ref_oligo6、2yM Ref_oligo7和 2μΜ Ref_oligo8、2yM Ref_oligo9和 2μΜ Ref-oligolO,并于室温下杂交 20分钟。之后，将20yMHg2+加到以上五种混合液中，并室温放置20分钟。然后，将20单 位Exo III加入到以上体系中至总体积为50 μ L，并在37°C下放置10分钟。最后，将这些 混合液加热至80°C保持10分钟。使所有的样品溶液缓慢冷却至室温(大约20分钟)，以备 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE )分析。
[0099] 在上述对Exo III活性的抑制作用的研究中，Hg2+并没有被引入到DNA双链中。另 一种可能的途径是，Hg2+有可能通过在双链DNA中形成T-Hg 2+-T碱基对，从而抑制Exo III 的活性。之前没有文章报导过T-Hg2+-T碱基对是否会抑制Exo III降解DNA。在T-Hg2+-T 碱基对中，Hg2+能直接与胸腺嘧啶的N3位配位，取代亚氨基质子，从而与两个相反取向的胸 腺嘧啶残基形成一对键。Hg 2+的范德华半径约为1.44 A，DNA双链中W-C型碱基对之间的 距离约为3.4 A，因此，Hg2+插入到T-T错配碱基对中几乎不会影响到DNA双螺旋结构的刚 性和Hg2+与Exo III的结合。另一方面，由于dsDNA被Exo III降解是一个碱基一个碱基 连续被切下来的过程，其中任何有关步骤(例如，切掉的核苷酸的解离）的阻碍都会导致Exo III活性的降低。在T-Hg 2+-T碱基对中，胸腺嘧啶通过共价键N-Hg与Hg2+结合。此共价键 的强度比八-1'和6-(：中的氢键作用更强(请参见文献"1^ 7&1?5，￥.;1'呢&吐丨，!1.5 &此化〇，^; Yamaguchi,H. ;0da,S. ; Kudo, Μ. ; Tanaka, Υ. ;Kondo,Y. ;Sawa,R. ;Fujimoto,T. ;Machina-mi ，T. ; 0no, A. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2172?2173"）?因此，被 Exo III 切割下来的 T 碱基 从T-Hg2+-T碱基对上的解离很可能在Exo III对具有T-Hg2+-T碱基对的dsDNA的降解中起 到一定作用。〇no小组对具有T-Hg 2+-T碱基对的DNA双链的热诱导解离和结合情况进行了 研究，并且提出，在Exo III实施降解的过程中，切割下来的T碱基可能从T-Hg2+-T碱基对 中解离下来。
[0100] 如图2A所示，为了研究T-Hg2+-T碱基对对Exo III活性的影响，改变了 Ref-oligol和Ref_oligo2序列以引入不同数目的T-T错配，从而构建了五种不同的含 T-Hg2+-T的双链DNA。这些DNA双链均与过量的Hg2+孵育，以保证各个T-T错配碱基对与 Hg2+作用完全。另外，Hg2+的浓度为20μΜ,远远低于100μΜ,从而消除了 Hg2+对Exo III 的抑制作用（参见图1)。如图2B所示，用PAGE分析Exo III对这些双链DNA的降解作用。 与之前的实验结果一致，当存在20μΜ Hg2+时，Exo III具有活性，Ref-〇ligol/Ref-〇ligo2 双链(没有T-T错配）被完全降解为Ref-〇lig〇2 (泳道c)。当双链中有一个或两个分离的 T-Hg2+-T碱基对时，Exo III的活性没被抑制，双链依然被降解为ssDNA，如泳道d和泳道e 所示。当双链中有两个或三个连续的T-Hg2+-T碱基对时，因为在泳道f和泳道g中没有未 被降解的双链DNA存在，因此可知Exo III仍然可有效地降解双链DNA。这些实验证明，像 正常双链DNA那样，Exo III对含T-Hg2+-T碱基对的双链DNA具有降解作用。同时也说明 N-Hg键不会阻碍Exo III的降解作用，也不会阻碍T碱基从T-Hg2+-T碱基对上解离。
[0101] 有意思的是，泳道f和泳道g中出现两条较短的条带(如图2B中箭头所标出 的)，这表明在Ref-〇lig 〇7被降解后，有一部分的完整的Ref-〇lig〇8被释放出来，并且在 Ref-〇lig〇9被降解后，所有完整的Ref-oligolO被释放出来，并且它们进一步被降解成更 短的寡聚核苷酸。这可能是由Ref_oligo8和Ref-oligolO的内部碱基对导致的(在图2A 中由黑体字母表示)。自身具有4个互补碱基的自弓丨（self-primed)序列Ref-oligolO的溶 解温度为40°C。当Ref-〇lig 〇9被降解后，在反应温度为37°C时，被释放出的Ref-oligolO 自引形成具有少于4个突出碱基的3'端，进而被Exo III降解。显然地，自身具3个互补 碱基的自引序列Ref_oligo8的溶解温度约为25°C，这比反应温度（37°C)低很多。理论上， 所释放出的Ref-〇lig 〇8应该不会自引形成具有少于4个突出碱基的3'端进而被降解。然 而，如图2B中泳道f所示，发明人发现有几乎一半的Ref-oligoS被降解。发明人认为，这 种有意思的实验结果可能是Exo III酶促反应动力学和Ref_oligo8与其相应的自引序列 的热力学平衡的共同作用的结果。从热力学方面看，在反应温度为37°C时，虽然高的温度 (37°C)有利于形成单链Ref_oligo8而不是溶解温度（25°C)较低的自引Ref_oligo8结构， 但由于内部碱基对的存在，仍有少量的自引Ref-〇lig 〇8结构与单链Ref-〇lig〇8同时存在。 然而，由于存在Exo III，自引Ref_oligo8结构一旦形成，3'端具有少于4个突出碱基的双 链结构就会诱导Exo III活性，从而导致自引Ref_oligo8结构进一步被Exo III降解。酶 切过程打破了热力学平衡，并使该过程向自引Ref-oligoS结构形成的方向移动，从而自引 Ref_oligo8结构进一步被降解。这可能能够解释一些文献中所报道的Exo III具有降解 ssDNA的活性的原因。
[0102] 试验例3 :Hg2+引发的Exo III对DNA的降解作用
[0103] 上一个实验证明了含T-Hg2+-T碱基对的DNA双链和正常双链DNA -样，能被Exo πI有效降解，因此发明人设计了一条富含T的ssDNA，其在Hg2+的引发作用下能被Exo III 降解。如图3所示，此降解过程通过本发明的无需固定DNA探针的电化学检测平台进行检 测。其原理是利用寡聚核苷酸和单核苷酸向带负电荷的ΙΤ0电极表面扩散时具有不同的扩 散速度。所设计的这条富T的DNA序列（e-T-rich探针）包含26个核苷和在临近3'末端 的T上所标记的亚甲基蓝基团（MB)。当没有Hg 2+时，e-T-rich探针呈无规卷曲的单链结 构，不能被Exo III降解。由于其负电骨架与负电ΙΤ0电极表面之间的静电排斥作用，其无 法与电极接触，所以几乎观察不到电化学信号。当存在Hg 2+时，Hg2+与T碱基相互作用，能 够形成T-Hg2+-T结构，从而使线型的e-T-rich探针折叠成含4nt环（CCCC)和llbp茎的具 有3'平末端的发卡结构。此结构能被Exo III识别，从而使单核苷酸从3'端被逐一降解 下来，当标记有MB的T被切下来后，由于其与e-T-rich探针相比带较少的负电荷并具有更 小的体积，其更易扩散到带负电的电极表面，从而给出放大的电信号。这增强的电信号证明 了 Hg2+引发了 Exo III的活性。此外，发明人推测，在降解过程中Hg2+能从T-Hg2+-T结构 中释放出来，使另一新的未被降解的e-T-rich探针折叠成双链，从而进行新一轮的降解过 程(在下文试验例4中得到验证)。以这种方式，Hg 2+能在溶液相和e-T-rich探针中循环使 用，并作为催化引发剂来放大大量e-T-rich探针的降解过程。
[0104] 将如图4所示的不同反应混合物在37°C (图4A)或45°C (图4B)下分别温育20 分钟，之后进行示差脉冲伏安法（DPV)扫描。如图4A所示，当在含有e-T-rich探针和Exo III的体系中加入Hg 2+时，观察到明显的电信号增强，这说明了 Hg2+引发了 Exo III的降解 活性。但值得注意的是，当没有Hg2+但有Exo III时，与没有Hg2+和Exo III时的信号(只 检测到很弱的背景信号)相比较，出现稍强的信号，这暗示了即使没有Hg2+的引发作用，也有 少量的e-T-rich探针被降解，可能是由于Exo III对未折叠的e-T-rich探针具有残余核 酸外切酶活性。尽管有些研究组报道了 Exo III在4°C比37°C具有更好的特异性，但降低 温度会大大延长培养时间(在一些实例中，4°C放置24小时)。从本文前面的实验结果来看， e-T-rich探针被Exo III非特异性降解很可能是由于e-T-rich探针中存在分子内碱基配 对。因此，可以通过升高反应温度来减少分子内碱基配对，从而降低在无 Hg2+时的由非特异 性降解导致的电信号。图4B显示了在45°C反应的结果。与37°C的结果相比，无 Hg2+时的 信号显著降低，这表明e-T-rich探针被降解的情况大大减少。同时，存在Hg2+时的信号稍 有增强，这可能是因为45°C时Exo III具有更好的酶活性。在此条件下，无需延长反应时间 就得到了更好的信噪比。这些结果进一步证实了发明人之前的推测，即分子内碱基配对导 致ssDNA被Exo III非特异性降解。
[0105] 为了证实Hg2+在溶液相和e-T-rich探针之间能够循环释放-键合的机理，发明人 进行了时程实验。在45°C下，将含有2μ M e-T-rich探针和20单位Exo III的50yL溶液 分别与20 μ Μ或0. 1 μ Μ的Hg2+混合一段时间，观察随着混合时间的不同，电化学信号的变 化。如图5A所示，当Hg2+为20μΜ (大大过量）时，电化学信号迅速呈饱和状态，这表明当 加入Hg2+时，e-T-rich探针都呈发卡结构且迅速被降解。当Hg 2+为0. 1 μ Μ (不充足）时， 电化学信号以相对缓慢的速度连续增长，最后到达同一平台。由于e-T-rich探针的浓度是 Hg2+浓度的20倍，而最后e-T-rich探针能被完全降解，因此说明Hg2+在溶液相和e-T-rich 探针之间确实能循环释放-键合。反应产物的PAGE分析参见图5B。与预期一致，即使Hg2+ 浓度仅为〇. 1 μ M，所有的e-T-rich探针也均被Exo III降解成较短的寡核苷酸。
[0106] 试验例4 :本发明方法的检测限
[0107] 前面的实验结果说明，Exo III的"被引发"的活性能用于Hg2+的信号放大检测， 且具有超高灵敏度。发明人尝试了不同浓度的Hg2+以测试本发明的方法。之前的0.1 μΜ Hg2+的时程实验显示，在孵育的前20分钟，信号呈粗糙的线性增长，在孵育30分钟以后达 到平台期。因此，在进行电化学检测之前，将含有2μΜ e-T-rich探针、20单位Exo III和 不同浓度Hg2+的反应混合物分别在45°C下孵育20分钟。如图6A所示，在没有任何背景消 除的情况下，低至〇. 5nM的Hg2+可轻易地实现可检测的信号增大，此方法可检测的浓度已远 远低于EPA标准(对于饮用水，10nM Hg2+)。图6B描述了峰值电流与Hg2+浓度的函数关系， 其呈S形曲线。当有两个或三个Hg 2+与e-T-rich探针螯合时，尽管每个e-T-rich探针上 有7对T-T错配碱基对，e-T-rich探针仍能够发生折叠。如图6B中的插图所示，在较低浓 度范围内，峰电流与Hg 2+浓度线性相关。其校准公式为：峰值（nA)=l. 38C+1. 26,其中C为 Hg2+浓度，相关系数为0. 97426。由图可知可检测到的最低信号值为背景信号与三倍标准偏 差的和，由此根据所述校准公式确定最低检测限为0. 2nM。这是目前报道的电化学Hg2+传 感器的最低检测限，甚至比目前大多数基于荧光的Hg2+检测器的检测限还低。
[0108] 试验例5 :Hg2+的特异性
[0109] 随后，我们检测了此方法对Hg2+的选择性(特异性)。将2 μ Me-T-rich探针与不同 浓度的Hg2+、Pb2+、Mn2+、Ni 2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+或Cd2+在室温下混合，放置20分钟。随后加入 20单位Exo III至50yL，37°C或45°C放置20分钟。然后加热至80°C保持10分钟，以使 Exo III失去活性。最后缓慢冷却至室温(大约20分钟)，以备PAGE分析和在ΙΤ0电极芯片 上进行电化学检测。
[0110] 用实际样品中普遍存在的多种金属离子(例如Pb2+，Mn2+，Zn 2+，Ni2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+ 和Cd2+)替代Hg2+进行检测。如图7所示，在相同的测试条件下（Exo III反应温度为45°C)， 每种替代金属在三种相对高的浓度下（1 μ Μ、5 μ Μ和10 μ Μ)进行测试。发现没有任何一种 所检测的替代金属能给出比lOnM Hg2+的信号的一半高的峰值电流。这种优异的选择性归 因于特异性的T-Hg2+-T碱基对和ΕχοΙΙΙ的偏好活性。
[0111] 实施例1
[0112] 在lXNEBufferl缓冲液中，将e-T-rich单链DNA分别与三份10yL、Hg2+浓度不 同的待测溶液样品(分别称作试样1、试样2和试样3)在室温下混合，使得e-T-rich的浓度 达到2 μ M。室温下放置该混合物20分钟。随后加入20单位Exo III至50 μ L，45°C放置 20分钟。然后加热至80°C保持10分钟，以使Exo III失去活性。最后缓慢冷却至室温(大 约20分钟)，以备PAGE分析和在ΙΤ0电极芯片上进行电化学检测。该实施例的结果列于下 表中：

【权利要求】
1. 一种检测溶液中的汞离子的方法，该方法包括： 1) 将所述溶液与含有胸腺嘧啶（T)的单链DNA混合形成混合物，使得所述含有胸腺嘧 啶的单链DNA通过T-Hg2+-T碱基对形成双链DNA，其中所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的至 少一个脱氧核糖核苷酸上连接有信号产生分子； 2) 使步骤1)所得的双链DNA与特异于双链DNA的核酸外切酶接触，使得所述核酸外切 酶切割所述双链DNA，释放出连接有所述信号产生分子的脱氧核糖核苷酸；以及 3) 检测步骤2)中释放出的所述脱氧核糖核苷酸所连接的信号产生分子。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液的汞离子浓度为0. 2nM至200 μ M。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述胸腺嘧啶占所述单链DNA的总碱基数的 50%-80%〇
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述含有胸腺嘧啶的单链DNA具有20-40个核苷 酸的长度。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤1)所述的混合物中，所述含有胸腺嘧啶的 单链DNA的浓度为1-5 μ M。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA中，所述连接有 信号产生分子的脱氧核糖核苷酸占所述单链DNA的总核苷酸数的3. 8%-30. 8%。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述信号产生分子为电活性分子。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述电活性分子选自亚甲基蓝和二茂铁。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤2)中，所述双链DNA与所述核酸外切酶在 30-50°C下反应10-30分钟。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸外切酶选自大肠杆菌核酸外切酶III、 λ噬菌体核酸外切酶、和T7噬菌体基因6核酸外切酶。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述信号产生分子为亚甲基蓝，该信号产生分子 连接在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的3'端部分；所述核酸外切酶为大肠杆菌核酸外切酶 III。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤3)中，利用位于电极芯片上的带负电荷的 氧化铟锡玻璃电极检测释放出的所述脱氧核糖核苷酸所连接的信号产生分子。
13. 根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中步骤2)中所述的核酸外切酶对所 述双链DNA进行的切割还包括：切割该双链DNA中的T-Hg 2+-T碱基对，使该碱基对中的Hg2+ 游离出来，从而与其他含有胸腺嘧啶的单链DNA结合。
14. 一种检测溶液中的汞离子的试剂盒，包括： 含有胸腺嘧啶的单链DNA，该含有胸腺嘧啶的单链DNA包含至少一个连接有信号产生 分子的脱氧核糖核苷酸； 特异于双链DNA的核酸外切酶；以及 检测试剂，该检测试剂能够与游离态的所述脱氧核糖核苷酸所连接的信号产生分子作 用而产生信号。
15. 根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述胸腺嘧啶占所述单链DNA的总碱基数的 50%-80%〇
16. 根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述含有胸腺嘧啶的单链DNA具有20-40个 核苷酸的长度。
17. 根据权利要求14所述的试剂盒，其中，在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA中，连接有 所述信号产生分子的脱氧核糖核苷酸占所述单链DNA的总核苷酸数的3. 8%-30. 8%。
18. 根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述信号产生分子为电活性分子。
19. 根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述电活性分子选自亚甲基蓝和二茂铁。
20. 根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述核酸外切酶选自大肠杆菌核酸外切酶 III、λ噬菌体核酸外切酶、和T7噬菌体基因6核酸外切酶。
21. 根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述信号产生分子为亚甲基蓝，该信号产生 分子连接在所述含有胸腺嘧啶的单链DNA的3'端部分；所述核酸外切酶为大肠杆菌核酸外 切酶III。
22. 根据权利要求14-21中任意一项所述的试剂盒，其中所述检测试剂为带负电荷的 氧化铟锡玻璃电极的形式，该带负电荷的氧化铟锡玻璃电极位于电极芯片上。
【文档编号】C12Q1/68GK104059964SQ201410100363
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2013年3月18日
【发明者】邢怡铭, 宣锋, 罗晓腾 申请人:香港科技大学