专利名称：一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种试剂盒，具体来说，特别是涉及一种钙离子筛选试剂盒。
背景技术：
Ca2+作为细胞内的第二信使，在细胞的生命活动中起着重要作用，不仅直接激活具有重要生理意义的细胞内的机械活动，如肌肉收缩等，同时也作为细胞内第二信便介导第一信使(如激素等细胞外信号)对细胞内的反应，其影响几乎涉及到细胞所有的生理和生化过程，如物质代谢、肌肉收缩、胞吞、胞饮、神经递质释放、染色体移动、DNA合成、细胞分裂以及细胞凋亡等，而且某些疾病的发生和发展都会引起细胞内游离钙浓度(简写为[Ca2+])和分布的大幅度变化，甚至因此导致细胞死亡。随着科技和社会的进步，人们对钙代谢、钙通道、钙受体及其调控作用，钙的转运和利用以及钙与某些疾病发生和发展关系的认识越 来越深入，研究细胞内Ca2+的含量及其时空分布的精确测定方法和技术已是当今化学、生物学、基础和临床医学等学科的一个十分重要的前沿热点研究课题。从20世纪50年代起，人们就开始研究测定细胞内Ca2+的方法和技术，先后建立和发展了多种方法，如Ca2+激活生物发光蛋白法、有机显色剂法、核磁共振法、放射示踪法、微电极法和荧光探针法等，这些方法各有其优缺点，实际应用时通常要根据各种方法的特点，按照所进行实验的具体要求和目的而选择不同的测定方法，其中荧光探针法是目前最常用的一种方法。通常细胞内游离钙的浓度[Ca2+]仅为l(T7mol/L，而细胞外Ca2+浓度高达l(T3mol/L，而且随着细胞的活动，胞质游离钙的浓度还会发生较大变化，正是由于其分布的不均一性及其时空变化构成了细胞内Ca2+信号的基础，Ca2+作为胞内第二信使对细胞代谢和功能进行调节正是通过胞内游离Ca2+含量及分布的变化，以及由此而引发的与蛋白质或酶的特异性结合而实现的。如此大的浓度梯度受细胞膜对钙的通透性和传输性质控制。细胞膜、细胞核、内质网和线粒体上都具有主动的钙转运机制，当胞内钙离子浓度上升时，这些转运系统可以将钙运出胞浆；当胞内钙离子浓度下降时，又能将存贮在“钙库”中的“存贮Ca2+”释放入胞质中成为游离钙，从而保持细胞内游离钙浓度Ca2+的稳定。测定细胞内游离钙Ca2+测定在技术上的要求(I)对活细胞无损伤或生理条件下研究细胞钙，不干扰细胞内正常的生理、生化过程;(2)灵敏度高，检出限应达10_7mol/L ;(3)选择性好，由于细胞内其它一些无机离子如Mg2+，Na+，K+等的浓度均在10-3mol/L水平，故要求测定方法特异性和选择性要强；(4)响应速度快，为了测定钙浓度的变化，要求测定方法对Ca2+浓度变化的响应快于细胞内Ca2+信号引起的相关生理和生化反应；(5)时空分辨率高，能实时、原位地提供胞内各亚细胞区域钙信号聚散涨落的彼此独立又相互关联的信息。信号转导是活细胞所执行的重要生物功能之一。细胞外的信号通常是通过各种各样的化学刺激来传递到细胞内部的。活细胞的表面有多种多样的受体，而信号正是通过这些受体的活化来传递到细胞内部，然后信号转变为另外一种形式的信息以引起相应的细胞应答。第二信使在细胞内的信号转导中起到非常重要的作用，它主要是通过离子浓度的变化来传递信息的。因此能够监控细胞内的离子浓度对研究第二信使以及胞内信号转导的研究具有极为重要的意义。钙离子是人体内最重要的离子之一，是人体内重要的元素，广泛分布于人体的细胞和体液中。随着人们对钙代谢、钙通道、钙受体及其调控，钙的转运和利用及其某些疾病发生和发展关系的认识愈来愈深入，细胞内Ca2+的研究已成为化学、生物学、基础和临床等学科重要的前沿热点研究课题。细胞内自由钙离子浓度([Ca2+])及其变化在细胞功能中起着十分重要的作用，精确测定活性细胞内钙离子的浓度及其流入已成为生物学及医学基础研究的重要内容之一。目前大约30%的FDA批准的药物是基于钙离子通道的，尤其是心血管方面的药物；农药中也有相当部分是基于钙离子通道的，例如最近杜邦公司刚刚上市的新农药氯虫酰胺，就是能选择性的封闭害虫的钙离子通道，让昆虫缺钙而死亡，但是对鱼类和动物无任何影响，是2008年刚刚批准上市的绿色农药。钙荧光指示剂法是目前应用广泛的测定活性细胞内钙离子浓度的重要方法。近年来这方面的研究进展很快，并且开拓了有机试剂研究的新领域。目前来说，细胞Ca2+定主要是通过荧光探针标记，然后荧光显微成像分析来实现的，探针的性能至关重要。探针若不能够区分标记特定亚细胞区域，荧光显微镜也就根本无法获取得到有关区域的Ca2+信息。而目前广泛采用的以Fura2和Fluo3为代表的小分子Ca2+荧光探针均与细胞融合性不好，有一定毒性，均不具有亚细胞区域靶向定位性，或与Ca2+结合后无荧光峰的位移，难以采用双波长比率法进行测定；或对于细胞内胞浆、胞核钙无特异性。这对于细胞Ca2+信号研究，不仅得不到确切的信息，甚至会导致错误的结论。因此，研发灵敏度更高、选择性更强、毒性更低的Ca2+探针十分必要和迫切，并且该利用该Ca2+探针研发快速分析钙离子浓度的检测试剂盒。
实用新型内容针对上述问题，本实用新型提供一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，该试剂盒用于测定钙离子浓度，并且测定的灵敏度高、选择性强，还对生物体的细胞毒性低。本实用新型通过以下技术手段实现一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，包括盒体；盒体内设有三个试剂瓶，其中一个装有荧光探针标记物干粉，一个装有溶解溶剂，另一个装有稀释液。本实用新型还可做以下改进所述盒体为硬质盒体，盒体内还设有缓冲泡沫塑料，缓冲泡沫塑料上设有用于固定安放各配件的凹槽。还设有一次性吸管和空试剂瓶。所述装有荧光探针标记物干粉的试剂瓶为密闭的安瓿瓶，盒体内还设有开启安瓿瓶的砂轮。所述空试剂瓶上设有体积刻度。所述装有荧光探针标记物干粉的安瓿瓶规格为lmL，所述装有溶解溶剂的试剂瓶规格为5mL，所述装有稀释液的试剂瓶规格为IOOmL,所述一次性吸管为3根，所述空试剂瓶为6个，每个空试剂瓶上的刻度均为1-lOmL。所述溶解溶剂为二甲基亚砜溶液(DMSO)。所述稀释液为Hank’ s平衡盐溶液(HBSS溶液)。与现有技术相比，本实用新型具有的有益效果为I)利用本实用新型的试剂盒测定细胞内钙离子浓度，具有非常好的荧光性能，其对细胞的毒害性小，荧光分辨率比传统测定方法提高100倍，背景更低。2)利用本实用新型的试剂盒测定细胞内钙离子浓度，负载容易，只需与细胞简单孵化即可进入细胞，无损伤且避免了微注射等繁杂手续。3)利用本实用新型的试剂盒测定细胞内钙离子浓度，可在近中性的生理条件下与Ca2+高选择性定量配位，响应其变化，据此可以实现在生理条件下对活细胞内游离Ca2+的测 量。4)利用本实用新型的试剂盒测定细胞内钙离子浓度，显色后采用荧光显微成像技术，可提供细胞内Ca2+分布的二维或三维图像，并可实时显示，空间分辨率优于其它所有方法。5)利用本实用新型的试剂盒测定细胞内钙离子浓度，反应速度快，反应速度时间< 5ms，反应时间慢则无法反应活细胞的实时生理过程，而钙微电极的响应时间需要几秒，NMR法需要几分钟。6)利用本实用新型的试剂盒测定细胞内钙离子浓度，该方法能与其它多种先进技术联合应用，如图像分析技术、流式细胞仪技术等，有利于对照观察亚细胞结构。
图I为本实用新型的试剂盒组成示意图；图中1.盒体；2.安瓿瓶；3.砂轮；4. 一次性吸管；5.空试剂瓶；6.缓冲泡沫塑料；7.装有稀释液的试剂瓶；8.装有溶解溶剂的试剂瓶。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本实用新型做进一步说明，但并不对本实用新型造成任何限制。实施例I试剂盒组成如图I所示，一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，包括盒体I ;盒体I内设有三个试剂瓶，其中一个装有荧光探针标记物干粉，一个装有二甲基亚砜溶剂，另一个装有Hank’ s平衡盐溶液。所述盒体I为硬质盒体，盒体I内还设有缓冲泡沫塑料6，缓冲泡沫塑料6上设有用于固定安放各配件的凹槽。还设有3根一次性吸管4和6个刻度为I-IOmL空试剂瓶5。所述装有荧光探针标记物干粉的试剂瓶为密闭的安瓿瓶2，盒体内还设有开启安瓿瓶的砂轮3。所述装有荧光探针标记物干粉的安瓿瓶2规格为lmL，所述装有二甲基亚砜溶剂的试剂瓶8规格为5mL，所述装有Hank’ s平衡盐溶液的试剂瓶7规格为100mL。[0039]上述试剂盒的保存条件为温度< _20°C，密封、干燥和避光。实验原理 荧光探针标记物，如Fluo-IOAM，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo IOAM通过引入乙酰甲酯基团增强整个分子的亲脂性，使其能够穿透活细胞膜，进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-ΙΟ，从而被滞留在细胞内，Fluo-IO若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，当它与细胞内钙离子结合后可以产生非常强的荧光。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化，从而研究药物的毒性和生物活性。操作步骤各试剂在使用前平衡至室温。I、母液配制用砂轮3将安瓿瓶2打开，然后用一次性吸管4吸取DMSO溶液至安瓿瓶2中溶解、转移荧光探针标记物至一个空试剂瓶5中，然后用DMSO定容至预订刻度线，配制成lmmol/L的母液。_20°C避光密封保存。使用前根据实验需要稀释成合适的浓度。2、取出培养好的细胞，除去培养基，用稀释液(HBSS溶液)洗涤细胞3次，尽量除去残留的培养基。3、把适量荧光探针标记物母液转移至剩下的空试剂瓶5中，用稀释液(HBSS溶液)定容至预订刻度，配制成1-5 μ mol/L工作液，涡旋混匀配成工作液；荧光探针标记物工作液需要即配即用，勿反复冻存。也可根据实验需求，自行调整最佳工作浓度。4、加入荧光探针标记物工作液，溶液量以覆盖细胞为准，37 °C细胞培养箱孵育15-60min，建议先孵育30min，观察荧光效果如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间，其中，最佳孵育时间应根据实验要求自行调整。5、除去荧光探针标记物工作液，用HBSS溶液洗涤细胞3次，以充分去除残留的荧光探针标记物工作液。然后加入HBSS溶液覆盖细胞。6、37°C培养箱孵育约20_30min，以确保荧光探针标记物在细胞内的完全去酯化作用。7、用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞。条件为激发波长494nm，发射波长516nm。以上内容是结合具体的优选实施方式对本实用新型所作的进一步详细说明，不能认定本实用新型的具体实施只局限于这些说明。对于本实用新型所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本实用新型的保护范围。
权利要求1.一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，包括盒体(I);其特征在于盒体(I)内设有三个试剂瓶，其中一个装有荧光探针标记物干粉，一个装有溶解溶剂，另一个装有稀释液。
2.根据权利要求I所述的一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，其特征在于所述盒体为硬质盒体，盒体内还设有缓冲泡沫塑料￠)，缓冲泡沫塑料(6)上设有用于固定安放各配件的凹槽。
3.根据权利要求I或2所述的一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，其特征在于还设有一次性吸管(4)和空试剂瓶(5)。
4.根据权利要求3所述的一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，其特征在于所述装有荧光探针标记物干粉的试剂瓶为密闭的安瓿瓶(2)，盒体内还设有开启安瓿瓶的砂轮⑶。
5.根据权利要求4所述的一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，其特征在于所述空试剂瓶上设有体积刻度。
6.根据权利要求5所述的一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，其特征在于所述装有荧光探针标记物干粉的安瓿瓶规格为lmL，所述装有溶解溶剂的试剂瓶(8)规格为5mL，所述装有稀释液的试剂瓶(7)规格为IOOmL,所述一次性吸管为3根，所述空试剂瓶为6个，每个空试剂瓶上的刻度均为1-lOmL。
7.根据权利要求I所述的一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，其特征在于所述溶解溶剂为二甲基亚砜溶液。
8.根据权利要求I所述的一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，其特征在于所述稀释液为Hank’ s平衡盐溶液。
专利摘要本实用新型提供一种基于钙离子通道的药物筛选试剂盒，属于试剂盒测定技术领域。包括盒体；盒体内设有三个试剂瓶，其中一个装有荧光探针标记物干粉，一个装有溶解溶剂，另一个装有稀释液。将该试剂盒用于测定钙离子浓度，并且测定的灵敏度高、选择性强，还对生物体的细胞毒性低。适合用于测定细胞内钙离子浓度，辅助作用原理是基于钙离子通道药物的筛选。
文档编号C12M1/34GK202543210SQ2012201847
公开日2012年11月21日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者武婕, 魏军 申请人:广州威佳科技有限公司