一种核酸预扩增方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种核酸预扩增方法及其应用，本发明的方法包括以下步骤：1）选择能对双链DNA酶切后产生3-9nt随机碱基粘性末端的内切酶对包括待检测基因的核酸进行酶切，获得酶切片段；2）使用针对目标基因酶切片段设计的接头与1）中酶切片段在DNA连接酶的作用下进行连接，获得连接产物；3）以2）中的连接产物为模板，以通用引物为引物进行预扩增PCR反应。预扩增产物可作为特异性DNA检测方法的模板，进行针对目标基因的特异性扩增以确定是否存在目的基因。该方法能够在大量背景核酸存在的情况下使极微量的目标基因得到大量扩增，通过与其他特异性核酸检测方法的结合，可达到灵敏度与特异性的兼顾，可普遍应用于食品中微生物的核酸检测及其他相关领域。
【专利说明】一种核酸预扩增方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子检测【技术领域】，具体涉及一种核酸预扩增方法及其应用，更具体涉及一种能够将大量背景核酸中极微量目标DNA进行有效扩增以满足现有的核酸检测技术的方法及其在食品中微生物的核酸检测及其他相关领域方面的应用。
【背景技术】
[0002]DNA的扩增和检测技术在分子生物学及生物技术各领域起着无可替代的重要作用。其中1985年建立起来的PCR技术(发明人Mullis获1993年诺贝尔化学奖)发展迅速，在生物学、医疗、食品、环境卫生、法医鉴定等各个领域得到了广泛应用。但即使这一原理简单，广泛为大家乐于使用的关键技术，在针对各种样品的实际应用中也出现了许多严重问题，如易受污染产生假阳性，有聚合酶抑制剂时使用困难，背景核酸大量存在时灵敏度大幅降低等。
[0003]在食品的原料溯源和安全检测方面，需要面对食品各种组分掺杂在一起，加工方式对核酸破坏严重，大量样品需要同时处理等诸多复杂问题。例如，在DNA样品不够纯净或含有大量背景DNA的情况下(如检测水产品中的病毒时，其含量可能小于总DNA的亿分之一)，常规PCR容易发生非特异性扩增，引物设计更加困难，假阳性经常出现。这使得核酸的扩增远远没有处理提纯 的病毒、细菌、细胞组织那样简单。在食品领域，虽然针对不同的生物对象有很多学术论文发表和专利申请，但绝大多数相关研究停留在引物设计，条件优化，并只针对少数样品有条件地进行检测的阶段。因此，在食品领域对核酸扩增技术提出了更高的要求，需要开发新的方法或对现有方法进行根本的改进，以达到核酸检测在食品领域真正广泛应用的目标。
[0004]基于以上问题，国际上开发了几项恒温DNA扩增技术以补充PCR技术的不足。例如，日本荣研化学公司的LAMP法，可在60-65度的温度下对小于300bp的较短的DNA进行扩增。但是因其在没有任何模板DNA的存在下也会大量扩增引物，极易受到污染而产生假阳性结果。因此，其引物设计困难，对实验条件要求严格，难以达到较准确的定量分析。解旋酶扩增方法(tHDA)可用于在恒温条件下扩增和检测70-120bp的DNA序列，但是对于较长DNA扩增效率低。另外还有ICAN法(US6，951，722，2005年)和利用T4或T7噬菌体体系进行常温扩增的方法，但都存在灵敏度低，或难以实现高特异性等问题，未能得到足够的实际应用。究其原因，这些方法都未能从根本上解决高灵敏度与高特异性的矛盾。
[0005]此外，DNA芯片(DNA chip)技术具有高通量、平行性好等优点，再加上各种基因数据库的不断完善，是近年来蓬勃发展并具有广泛应用前景的新技术。由于近年来纳米技术和表面技术的发展，在固体表面进行准确、高密度固定寡核苷酸的技术已经非常成熟。然而，DNA芯片技术的主要缺点是灵敏度差，对复杂的高级结构的靶DNA (Target DNA)难以杂交，难以识别单碱基变异等。而现有的方法难以实现在固体表面的特异性扩增。RCA(Rolling Circle Amplification)技术可实现在常温(25-30度)对环状DNA进行指数型高效扩增，并可在固体表面进行。但是在应用过程中，这一方法主要是使加入的单链DNA探针(而非目标序列)进行环化，然后进行RCA。实际上只是对探针进行了扩增，并没有对目标序列进行扩增。可以看出，传统的RCA只是一种信号扩增，存在不能直接检测双链DNA和易发生假阳性结果的严重问题。
[0006]在不远的将来，转基因食品的出现和食品安全问题的频发必将使得食品领域的核酸检测成为常规手段。我国食品领域中以次充好、掺假等问题愈演愈烈，国际上也出现了类似问题。无疑，核酸检测将成为食品领域重要的日常检查和监测手段，为保障人们的身体健康少受侵害提供技术支持。因此，一种能够攻克食品领域等检测过程中的重现性差，容易产生假阳性和假阴性等错误判断的关键问题，可以同时提高灵敏度和特异性的检测方法亟待开发。
【发明内容】
[0007]本发明的首要目的在于提供一种大量核酸背景下极微量目标基因的核酸预扩增方法，该方法能够在大量背景核酸存在的情况下高灵敏度的扩增极微量的目标基因，使体系中目标基因的丰度大大提高，达到现有核酸检测技术对灵敏度及特异性的要求，继而可与之结合实现对目标基因的特异性检测，达到灵敏度与特异性的兼顾，避免假阴性的产生。
[0008]本发明所涉及的核酸预扩增方法是一种核酸前处理方法，主要通过连接介导PCR技术(Ligation-mediated PCR, LM-PCR)来实现。通过引入一条外源通用引物进行特异性较低但是灵敏度较高的PCR反应，从而使目标基因的含量在整个体系中所占比例大大提高，得到的预扩增产物可作为现有通用核酸检测技术的模板，包括:基于PCR技术的各类检测方法(如RT-qPCR)，以及恒温核酸扩增技术(如SDA、LAMP等)。进而通过二者结合可实现对目标基因高灵敏度而又特异性的检测。
[0009]本发明的另一目的在于提供上述核酸预扩增方法在核酸检测发明的应用，尤其是在食品中微生物的核酸检测及其他相关领域的应用。
[0010]本发明是这样实现的，一种核酸`预扩增方法，包括以下步骤:
[0011]I)选择能对双链DNA酶切后产生3_9nt随机碱基粘性末端的内切酶对包括待检测基因的核酸进行酶切，获得酶切片段；
[0012]2)使用针对目标基因酶切片段设计的接头与I)中酶切片段在DNA连接酶的作用下进行连接，获得连接产物；
[0013]3)以2)中的连接产物为模板，以通用引物进行预扩增PCR反应。
[0014]优选地，所述步骤I)中的内切酶为一类可以将双链DNA酶切产生3_9nt随机碱基粘性末端(NNN)的限制性内切酶。
[0015]优选地，所述限制性内切酶包括Ajul, Alw26I, AlwNI, BbsI, BbvI, BfuAI, BglI,BplI,BsaI,BseXI,BslI,BsmAI,BsmBI,BsmFI,BspMI,BspQI,BstAPI,BstXI,BtgZI,DraIII,Earl, Eco31I, FokI, HgaI, HpyFlOVI, PflMI, PspFI, SfaNI, TspRI, MwoI, SapI 限制性内切酶。
[0016]优选地，所述步骤2)中的接头为针对目标基因酶切片段设计，其由双链寡核苷酸组成并含有与目标酶切片段互补的粘性末端，且含有粘性末端链的互补链为一段通用引物序列，用作预扩增PCR反应的引物。
[0017]优选地，所述接头为分别针对不同目标基因设计的多种接头，且所述多种接头分别对不同目标基因进行预扩增。
[0018]优选地，所述步骤3)中预扩增PCR所用的聚合酶为不具有3' —5,外切酶活性的DNA聚合酶，或者为具有3' —5,外切酶活性的DNA聚合酶；所述通用引物的Tm值选择55-65°C，反应的退火温度为引物Tm-3°C，反应循环数为25-35。
[0019]本发明进一步提供了上述核酸预扩增方法在核酸检测方面的应用。
[0020]优选地，所述核酸预扩增方法在核酸检测方面的应用，包括在食品中微生物的核酸检测方面的应用。
[0021]优选地，所述核酸检测的方法包括以下步骤:
[0022]根据所述权利要求1至7任一项所述的核酸预扩增方法得到预扩增产物，以所述预扩增产物作为模板，进行针对目标基因的特异性扩增，对扩增产物进行检测确定是否存在目的核酸片段。
[0023]优选地，所述特异性扩增包括常规PCR、实时荧光定量PCR或恒温核酸扩增方法，所述扩增产物的检测通过凝胶电泳等常规方法进行。
[0024]相比与现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:
[0025]本发明能够在大量核酸背景存在下对极微量目标基因进行高灵敏度扩增，降低背景核酸对PCR等核酸扩增反应的干扰，提供适用于通用核酸检测技术的模板，大大降低了现有核酸检测技术对灵敏度及特异性的要求，弥补了现有核酸检测技术无法达到灵敏度与特异性兼顾的不足，且可以实现同时对多个目标的预扩增，具有较高的实际应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1:本发明方法的路线示意图；
[0027]图2:本发明实施例1的核酸电泳结果图；其中，M为DNA ladder，N为无模板空白，下同；
[0028]图3:与图2对比的普通PCR电泳结果；
[0029]图4:本发明实施例2的核酸电泳结果图；其中，C为以预扩增空白为模板的对照，“ + ”表示添加了 T4DNA连接酶，表示未添加T4DNA连接酶；
[0030]图5:与图4对比的普通PCR电泳结果；
[0031]图6:本发明实施例3的特异性PCR电泳结果图；其中:数字1-4代表不同目标，1:副溶血弧菌，2:霍乱弧菌，3:鼠伤寒沙门氏菌，4:单增李斯特菌；
[0032]图7:本发明实施例3的四重PCR电泳结果图；
[0033]图8:本发明实施例4的预扩增PCR电泳结果图。
【具体实施方式】
[0034]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0035]对于本发明中所涉及的术语进行如下的解释:
[0036]1、预扩增:目标基因在样品中的丰度很低无法达到检测灵敏度要求时，需要对其进行预扩增(pre-amplification)使其在样品中的丰度提高，以提供符合实验要求的起始材料。
[0037]2、PCR:Polymerase Chain Reaction,即聚合酶链式反应。
[0038]3、粘性末端:限制性内切酶切割DNA时在切口处留下的数个未配对的碱基。
[0039]4、接头:可与酶切片段互补的寡核苷酸片段，一般由两条部分互补的单链寡核苷酸组成，可与酶切片段在DNA连接酶的作用下连接。
[0040]下面结合图1对本发明的方法进行一个总体上的描述:
[0041]I)选择能对双链DNA酶切后产生随机碱基粘性末端的内切酶对包含目标基因的待检测样品进行酶切；获得酶切片段:
[0042]在掌握目标基因序列的前提下，使用能够产生3_9nt随机序列粘性末端的限制性内切酶(如Alw26I限制性内切酶，识别位点GTCTCN'NNNN)对包括目标基因及大量背景核酸在内的模板DNA进行酶切，所选取的内切酶是一类可以产生3-9nt随机碱基粘性末端的内切酶，但其必须在目标基因中存在两个或两个以上的酶切位点以保证目标基因片段两端都具有该粘性末端。经过酶切反应包括背景核酸在内的模板DNA被切割成若干个粘性末端片段，其共同点是粘性末端具有相同的碱基长度，而各个片段的总长度、碱基组成以及粘性末端两端碱基组成则一般不相同。
[0043]2)对酶切片段进行接头连接，所述的接头为针对目标基因酶切片段设计，其由双链寡核苷酸组成并含有与目标基因酶切片段完全互补的粘性末端，且含有粘性末端链的互补链为一段通用引物序列，用作预扩增PCR反应的引物，连接产物作为预扩增PCR反应的模板:
[0044]选取被两端酶切后的目标基因作为靶序列，其序列长度可以选择200_800bp之间，但也可以根据要检测的目标序列进行调整；根据这一靶序列粘性末端的具体碱基组成设计与之两端完全互补的接头组。在DNA连接酶的作用下，该接头组与靶序列两端互补并连接，连接温度为16-37°C，连接时间lh-16h。同时，模板中除了靶序列外，背景核酸酶切片段中与靶序列粘性末端碱基组成部分相同甚至完全相同的限制性片段也同时与接头组中的一个或者两个退火连接，并连同靶序列一起成为预扩增PCR反应的模板，从而大大增加了预扩增PCR时起始模板的数量，包括靶序列在内的所有预扩增模板将同时得到高效的扩增。尤其当体系中模板数量极少时，这一过程将显著提高反应的灵敏度。在接头连接过程中，只有与设计的接头互补连接的片段才能得到下一步的扩增，因此相对于传统核酸扩增检测方法，通过与本方法结合可将反应的特异性提高42n倍(η等于粘性末端碱基数)，达到灵敏度与特异性的兼顾。
[0045]3)以2)中的连接产物为模板，以上述通用引物为引物进行预扩增PCR反应:
[0046]在正式的PCR循环开始之前，应使体系于72°C保温3_5min以完成引物延伸过程。DNA聚合酶可以选择不具有:V - 外切酶活性的聚合酶(如Taq DNA聚合酶)，也可以选择具有Y —5'外切酶活性的聚合酶(如pfu DNA聚合酶)，通用引物Tm值可选择55-65°C，反应的退火温度为引*Tm-3°C，25-35个循环，依聚合酶种类不同而异。
[0047]通过预扩增反应可使极微量目标基因在整个体系中的含量大大提高，因此可作为通用核酸检测技术的模板，最终实现对大量核酸背景下极微量目的基因的高灵敏度及特异性的检测。
[0048]下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细的描述。[0049]实施例1牡蛎中副溶血弧菌的检测
[0050]1、DNA的提取及模板制备
[0051]提取太平洋牡贩(PacificOyster)及副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,ATCC17802)的基因组，并使用NanoDrop2000(Thermo Scientif ic)进行浓度纯度测定。将副溶血弧菌基因组与太平洋牡蛎基因组以一定比例混合并溶于TE溶液中(IOmM Tris-HCl,ImM EDTA, ρΗ8.0),使每 400ng/ μ L 牡蛎基因组中依次含有 IO6, IO5, IO4, IO3,100，10，I 个副溶血弧菌基因组拷贝，备用。
[0052]2、酶切反应
[0053]使用Alw26I限制性内切酶(识别位点GTCTCN~NNNN)对上述模板进行酶切反应。酶切体系中含有 I P LlOXFastDigest buffer, I μ L 模板DNA, 0.4 μ L FastDigest Alw26I 限制性内切酶(Thermo Scientific)，用水补至10 μ L后混匀，于37°C反应10min后65°C反应5min灭酶。
[0054]3、连接反应
[0055]向酶切体系中加入针对副溶血弧菌trh基因酶切片段设计的寡核苷酸序列ad-1、ad-2和ad-3，使其在体系中浓度依次为lOOnM，IOOnM和200nM，其中ad_l可与ad_3互补形成一条针对trh基因酶切片段一端设计的双链接头，ad-2可与ad_3形成另一条双链接头与trh基因酶切片段的另一端互补结合。将体系于65°C温育5min后置于室温冷却5min,加入 6nmole ATP，4U T4DNA ligase，轻轻混匀后于 22°C反应 2h。
[0056]4、预扩增PCR反应
[0057]以连接产物为模板`，通用引物ad-3为引物进行预扩增PCR反应，50 μ L体系中含有 5yL10Xpfu buffer (200mM Tris-HCl, IOOmM (NH4) 2S04, IOOmM KCl, lmg/mL BSA,l%Triton X-100,20mM MgSO4, ρΗ8.8)，0.4 μ M 通用引物 ad_3，0.2mM dNTPs，2U pfu DNA 聚合酶(Thermo Scientific)。整个加样操作必须在冰上进行,并立即放入已预热好的热循环仪中。预扩增PCR参数为:72°C引物延伸5min，94°C预变性3min，94°C变性30s，63°C退火30s，72°C延伸90s，30个循环后72°C保温5min。
[0058]5、特异性PCR反应
[0059]将预扩增PCR产物使用ddH20稀释100倍，取I μ L作为特异性PCR模板，20 μ L体系中还含有 2 μ LlOXpfu buffer，0.3μΜ 正向引物 ρ1，0.3μΜ 反向引物 ρ2，0.2mM dNTPs,IU pfu DNA聚合酶，补水至20 μ L，并设置未添加模板的空白。其中pi与p2为针对trh基因经Alw26I酶切后产生的片段而设计的一对引物，可特异性的扩增该酶切片段内部一段198bp的序列。整个加样操作在冰上进行并立即放入已预热的热循环仪中。PCR反应参数为:94°C预变性3min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，30个循环后72°C保温5min。产物于2%琼脂糖凝胶进行电泳,上样量2 μ L,溴化乙锭(EB)染色。实验结果电泳图见图2。
[0060]同时设置了与本方法对照的普通PCR反应，反应体系中含有2μ LlOXpfubuffer，0.3μΜ正向引物 pl，0.3μΜ 反向引物 p2，0.2mM dNTPs，400ng 牡蛎基因组，I μ L 梯度稀释的副溶血弧菌基因组，IU pfu DNA聚合酶，补水至20 μ L，PCR反应参数为:94°C预变性 3min，94°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 60s，30 个循环后 72°C保温 5min。
[0061]图2中电泳结果表明，在体系中存在400ng背景基因的情况下，使用Alw26I内切酶及相应接头引物体系时，通过预扩增方法可检测至10拷贝(~55fg)的目标拷贝数。而普通的PCR实验电泳结果显示，当体系中存在400ng背景基因时，只可检测至10000拷贝的目标模板(图3)，远低于本发明方法10拷贝的检测灵敏度。
[0062]表1.实施例1中使用的接头、引物序列
[0063]
【权利要求】
1.一种核酸预扩增方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)选择能对双链DNA酶切后产生3-9nt随机碱基粘性末端的内切酶对包括待检测基因的核酸进行酶切，获得酶切片段； 2)使用针对目标基因酶切片段设计的接头与I)中酶切片段在DNA连接酶的作用下进行连接，获得连接产物； 3)以步骤2)中的连接产物为模板，以通用引物进行预扩增PCR反应。
2.根据权利要求1所述的核酸预扩增方法，其特征在于，所述步骤I)中的内切酶为一类可以将双链DNA酶切产生3-9nt随机碱基粘性末端(NNN)的限制性内切酶。
3.如权利要求2所述的核酸预扩增方法，其特征在于，所述限制性内切酶包括Ajul，Alw26I, AlwNI, BbsI, BbvI, BfuAI, BglI, BplI, BsaI, BseXI, BslI, BsmAI, BsmBI, BsmFI,BspMI, BspQI, BstAPI, BstXI, BtgZI, DraIII, Earl, Eco31I, FokI, HgaI, HpyFlOVI, PflMI,PspFI, SfaNI, TspRI, MwoI, SapI 限制性内切酶。
4.根据权利要求1所述的核酸预扩增方法，其特征在于，所述步骤2)中的接头为针对目标基因酶切片段设计，其由双链寡核苷酸组成并含有与目标酶切片段互补的粘性末端，且含有粘性末端链的互补链为一段通用引物序列，用作预扩增PCR反应的引物。
5.如权利要求4所述的核酸预扩增方法，其特征在于，所述接头为分别针对不同目标基因设计的多种接头，且所述多种接头分别对不同目标基因进行预扩增。
6.根据权利要求1所述的核酸预扩增方法，其特征在于，所述步骤3)中预扩增PCR所用的聚合酶为不具有3' —5,外切酶活性的DNA聚合酶，或者为具有3' —5'外切酶活性的DNA聚合酶；所述通用引物的Tm值选择55-65 °C，反应的退火温度为引物Tm_3 °C，反应循环数为25-35。
7.权利要求1至6任一项所述的核酸预扩增方法在核酸检测方面的应用。
8.如权利要求7所述的核酸预扩增方法在核酸检测方面的应用，其特征在于，包括在食品中微生物的核酸检测方面的应用。
9.如权利要求8所述的核酸预扩增方法在核酸检测方面的应用，其特征在于，所述核酸检测的方法包括以下步骤: 根据所述权利要求1至6任一项所述的核酸预扩增方法得到预扩增产物，以所述预扩增产物作为模板，进行针对目标基因的特异性扩增，对扩增产物进行检测确定是否存在目的核酸片段。
10.如权利要求9所述的核酸预扩增方法在核酸检测方面的应用，其特征在于，所述特异性扩增包括常规PCR、实时荧光定量PCR或恒温核酸扩增方法，所述扩增产物的检测通过凝胶电泳等常规方法进行。
【文档编号】C12Q1/68GK103866025SQ201410100360
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】梁兴国, 潘孝明 申请人:中国海洋大学