一种微生物转化异丁香酚生产香兰素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物转化异丁香酚生产香兰素的方法，选取从土壤中筛选获取的微生物菌种SW-B9，其能耐受高底物浓度，可将异丁香酚转化为香兰素，保藏号为CGMCC1347；菌种在斜面培养基培养后转入种子培养基内培养，然后加入到发酵培养液中进行发酵，在发酵液中加入0.03%~0.20%w/v的促进剂；所述促进剂包括40%~65%的十二烷基硫酸钠和余量的氯化亚铁。本发明公开的利用微生物转化异丁香酚生产香兰素的方法具有较高的转化率，发酵液中的目标产物的含量增加，减少了发酵时间。
【专利说明】—种微生物转化异丁香酚生产香兰素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及香兰素的生产方法，具体涉及到一种微生物转化异丁香酚生产香兰素的方法。
【背景技术】
[0002]异丁香酚是用于配制香精和制备香兰素，可用于配制依兰、肉豆蘧等精油；也可用以配制悬钩子、桃子、辛香型、丁香型香味的食用香精。是半合成香兰素的原料。香兰素，又名香草醛，为一种广泛使用的可食用香料，可在香荚兰的种子中找到，也可以人工合成，有浓烈奶香气息。广泛运用在各种需要增加奶香气息的调香食品中，如蛋糕、冷饮、巧克力、糖果；还可用于香皂、牙膏、香水、橡胶、塑料、医药品。现有的香兰素生产方法有化学转化合成和微生物法，如申请号为200510064494.0的发明专利，公开了微生物转化异丁香酚生产香草醛的菌种和方法，该菌种的生物保藏号为CGMCC1347，该发明专利公开了一种转化异丁香酚的微生物以及利用该微生物转化香草醛的方法，在该专利中，所公开的制备方法较为常规，其转化率等指标仍然具有较大的提升空间。
[0003]为了解决现有技术中的上述不足，本发明提出了一种新的解决方案。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种微生物转化异丁香酚生产香兰素的方法。
[0005]为达上述目的，本发明所采用的技术方案是:提供一种微生物转化异丁香酚生产香兰素的方法，选取从土壤中筛选获取的微生物菌种SW-B9，其能耐受高底物浓度，可将异丁香酚转化为香兰素，保藏号为CGMCC1347 ;菌种在斜面培养基培养后转入种子培养基内培养，再加入到发酵培养液中进行发酵培养，然后加入含有异丁香酚的生物转化底物中进行转化反应，在生物转化底物中加入0.03%~0.20%w/v的促进剂；所述促进剂包括40%~65%的十二烷基硫酸钠和余量的氯化亚铁，其中氯化亚铁的浓度为lmmol/L。
[0006]综上所述，本发明具有以下优点:
本发明公开的利用微生物转化异丁香酚生产香兰素的方法具有较高的转化率，发酵液中的目标产物的含量增加，减少了发酵时间。
【具体实施方式】
[0007]菌种的选取
从中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心获得保藏号为CGMCC 1347的纺锤芽孢杆菌。
[0008]本发明一个实施例中微生物的培养过程包括以下过程:
斜面培养:将菌种接种到斜面培养基上，斜面培养基为葡萄糖琼脂培养基。
[0009]种子培养:将斜面培养后的菌种接入到25ml的种子培养基内继续培养，种子培养基包括玉米浆1%~10%，磷酸氢钾0.01%~0.05%,磷酸二氢钾0.01%~0.5%，硫酸镁0.01%~0.5%，葡萄糖0.1%~?%，硫酸铵0.1-0.2%和酵母粉0.2%~0.5%。菌种在种子培养基的培养条件为--温度38°C，180r/min摇床振荡培养12小时，获得种子培养液。
[0010]发酵培养:发酵培养基包括玉米浆1%~10%，磷酸氢钾0.P/1-0.5%，硫酸镁
0.1%~0.5%，蛋白胨0.2%~0.5%，氯化锌0.01%~0.02%。在发酵培养基中加入种子培养液，并于37°C，pH7.5，180r/min摇床振荡培养10小时后加入香兰素使香兰素的最终浓度为lmmol/L，作为诱导剂继续培养8小时，最终获得发酵培养液。
[0011]转化培养:在生物转化底物中加入从发酵培养液获取的湿菌体，其中生物转化底物为按照重量计80%异丁香酚和20%水的混合物，然后在生物转化底物中加入
0.03%~0.20%w/v的促进剂和8~80g/L的湿菌体，控制发酵温度为37°C，pH5~8，转化24~240小时，同时每隔12小时检测生物转化底物中异丁香酚的浓度和产物香兰素的浓度。
[0012]实施例1 取菌种经斜面培养和种子培养后进行发酵培养，其中斜面培养基为葡萄糖琼脂培养基，种子培养基为包括玉米浆1%，磷酸氢钾0.01%,磷酸二氢钾0.01%,硫酸镁0.01%,葡萄糖0.1%，硫酸铵0.1%和酵母粉0.2%，其余为培养基载体，可以为水；发酵培养基包括玉米浆1%，磷酸氢钾0.1%，硫酸镁0.1%，蛋白胨0.2%，氯化锌0.01%，其余为培养基载体。
[0013]转化培养:在生物转化底物中加入8g/L的湿菌体和0.03%w/v的促进剂，其中促进剂为按重量计的40%的十二烷基硫酸钠和60%的lmmol/L的氯化亚铁溶液。然后控制发酵温度为37°C，pH7，转化72小时，同时每隔12小时检测生物转化底物中异丁香酚的浓度和产物香兰素的浓度。
[0014]实施例2
取菌种经斜面培养和种子培养后进行发酵培养，其中斜面培养基为葡萄糖琼脂培养基，种子培养基为包括玉米浆1%，磷酸氢钾0.01%,磷酸二氢钾0.01%,硫酸镁0.01%,葡萄糖0.1%，硫酸铵0.1%和酵母粉0.2%，其余为培养基载体，可以为水；发酵培养基包括玉米浆1%，磷酸氢钾0.1%，硫酸镁0.1%，蛋白胨0.2%，氯化锌0.01%，其余为培养基载体。
[0015]转化培养:在生物转化底物中加入80g/L的湿菌体和0.03%w/v的促进剂，其中促进剂为按重量计的40%的十二烷基硫酸钠和60%的lmmol/L的氯化亚铁溶液。然后控制发酵温度为37°C，pH7，转化72小时，同时每隔12小时检测生物转化底物中异丁香酚的浓度和产物香兰素的浓度。
[0016]实施例3
取菌种经斜面培养和种子培养后进行发酵培养，其中斜面培养基为葡萄糖琼脂培养基，种子培养基为包括玉米浆10%，磷酸氢钾0.05%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.05%,葡萄糖1%，硫酸铵0.2%和酵母粉0.5%，其余为培养基载体，可以为水；发酵培养基包括玉米浆10%,磷酸氢钾0.5%，硫酸镁0.5%，蛋白胨0.5%，氯化锌0.02%,其余为培养基载体。
[0017]转化培养:在生物转化底物中加入50g/L的湿菌体和0.2%w/v的促进剂，其中促进剂为按重量计的40%的十二烷基硫酸钠和35%的lmmol/L的氯化亚铁溶液和35%的丁内酰胺。然后控制发酵温度为37°C，pH8，转化72小时，同时每隔12小时检测生物转化底物中异丁香酚的浓度和产物香兰素的浓度。
[0018]实施例4
取菌种经斜面培养和种子培养后进行发酵培养，其中斜面培养基为葡萄糖琼脂培养基，种子培养基为包括玉米浆10%，磷酸氢钾0.05%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.05%，葡萄糖1%，硫酸铵0.2%和酵母粉0.5%，其余为培养基载体，可以为水；发酵培养基包括玉米浆10%，磷酸氢钾0.5%，硫酸镁0.5%，蛋白胨0.5%，氯化锌0.02%，其余为培养基载体。
[0019]转化培养:在生物转化底物中加入40g/L的湿菌体和0.2%w/v的促进剂，其中促进剂为按重量计的65%的十二烷基硫酸钠和35%的lmmol/L的氯化亚铁溶液和10%的丁内酰胺。然后控制发酵温度为37°C，pH8，转化72小时，同时每隔12小时检测生物转化底物中异丁香酚的浓度和产物香兰素的浓度。
[0020]实施例5
取菌种经斜面培养和种子培养后进行发酵培养，其中斜面培养基为葡萄糖琼脂培养基，种子培养基为包括玉米浆10%，磷酸氢钾0.05%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.05%,葡萄糖1%，硫酸铵0.2%和酵母粉0.5%，其余为培养基载体，可以为水；发酵培养基包括玉米浆10%,磷酸氢钾0.5%，硫酸镁0.5%，蛋白胨0.5%，氯化锌0.02%,其余为培养基载体。
[0021]转化培养:在生物转化底物中加入50g/L的湿菌体。然后控制发酵温度为37°C，pH8，转化72小时，同时每隔12小时检测生物转化底物中异丁香酚的浓度和产物香兰素的浓度。
[0022]实验结果
采取高效液相色谱法或者其他方法，对实施例广实施例5中的香兰素含量进行检测，其结果如下。
[0023]实施例1中每隔12小时香兰素的含量分别为:9.6g/L ；18.5 g/L ；24.9 g/L ；31.8g/L ；28.9 g/L。
[0024]实施例2中每隔12小时香兰素的含量分别为:12.8g/L ;19.6 g/L ；23.4 g/L ；31.9g/L ；27.9 g/L。
[0025]实施例3中每隔12小时香兰素的含量分别为:16.8g/L ;23.2 g/L ；29.6 g/L ；36.8g/L ；30.2 g/L。
[0026]实施例4中每隔12小时香兰素的含量分别为:15.5g/L ；22.5 g/L ；29.9 g/L ；35.8g/L ；29.8 g/L。
[0027]实施例5中每隔12小时香兰素的含量分别为:7.2g/L ；12.5 g/L ；18.5 g/L ；22.5g/L ；24.6 g/L。
[0028]结果分析:
实施例1至实施例4为添加促进剂进行生物转化培养。从结果可知，加入促进剂的量越多，生物转化的效率越多，转化液中的目标产物香兰素含量越高。同时，从发酵时间看，香兰素最高含量实在发酵后的48小时至72小时之间，大大减低了发酵时间。因此，从实施例4和实施例5中的数据对比可知，加入促进剂的实施例4比没有添加促进剂的实施例5，香兰素的发酵时间缩短，含量明显增加。
【权利要求】
1.一种微生物转化异丁香酚生产香兰素的方法，选取从土壤中筛选获取的微生物菌种SW-B9，其能耐受高底物浓度，可将异丁香酚转化为香兰素，保藏号为CGMCC1347 ;菌种在斜面培养基培养后转入种子培养基内培养，再加入到发酵培养液中进行发酵培养，然后加入含有异丁香酚的生物转化底物中进行转化反应，其特征在于:在生物转化底物中加入0.03%~0.20%w/v的促进剂；所述促进剂包括40%~65%的十二烷基硫酸钠和余量的氯化亚铁，其中氯化亚铁的浓度为lmmol/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述斜面培养基为葡萄糖琼脂培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述种子培养基包括玉米浆1%~10%，磷酸氢钾0.01%~0.05%,磷酸二氢钾0.01%~0.5%，硫酸镁0.01%~0.5%，葡萄糖0.1%~?%，硫酸铵0.1~0.2% 和酵母粉 0.2%~0.5%O
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述发酵培养基包括玉米浆ι%~ιο%，磷酸氢钾0.1%~0.5%，硫酸镁0.1%~0.5%，蛋白胨0.2%~0.5%,氯化锌0.01%~0.02%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述促进剂包括40%~65%的十二烷基硫酸钠和35%的氯化亚铁，余量为丁内酰胺。
6.根据权利要求1 或5所述的方法，其特征在于:所述促进剂包括40%的十二烷基硫酸钠、35%的氯化亚铁和35%的丁内酰胺。
【文档编号】C12R1/07GK103911399SQ201410142056
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】尹昌树 申请人:四川省申联生物科技有限责任公司