猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量pcr检测引物、探针和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒，所述引物的序列如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示，所述探针的序列如SEQ?ID?NO:3所示。所述猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测试剂盒包括SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的引物和SEQ?ID?NO:3所示的探针。该引物特异性和灵敏度都较高，能够检测出PRV野毒株，可以对各种临床样品进行检测，从而可以快捷地对猪伪狂犬病毒野毒株进行病原诊断，操作简单、实用。
【专利说明】猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物【技术领域】，具体涉及猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002]伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又名奥叶兹基病(Aujeszky，s disease, AD),是由症疫病毒科(Herpesviridae) α症疫病毒亚科伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的包括牛、羊、家兔、狗、豚鼠、鼠等在内的多种家畜和野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性、急性传染病(Roizmorn B.Desrosiers R, Fleebenstein
B,LoPez C，Minson Ad and studdert MJ.The Family Herpesviridae ；an update.ArchVirol, 1992，123:425-449)。猪是该病原的储藏者和传染源，但猪感染该病后并不表现出奇痒的症状，不同日龄的猪感染本病后表现出不同的临床症状:新生仔猪在出生后I周内大量死亡；断奶仔猪表现出腹泻及神经症状；育肥猪生长迟缓，饲料利用率降低等；妊娠母猪发生流产，产死胎、木乃伊胎等现象；母猪返情率高，屡配不孕(衰子国.表达伪狂犬病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及免疫试验研究.[博士论文].吉林大学，2008)。
[0003]伪狂犬病最早发现于美国的牛群，当时症状主要描述为“奇痒”，匈牙利狂犬病科学家Aujeszky通过动物试验将其与狂犬病区分开来，后来人们称其为Aujes’ sdisease,该病的病原伪 狂犬病毒由schmiedhoffer博士首先成功分离得到(Charles Ecet al.Advances in veterinary Science and Compartive Medieine:Seleted AnimalHerPesvirus.New concepts and technologiesl985, 35:4786-4792)。最初猪发生该病表现出的临床症状并不显著，直到上世纪80年代，该病在猪场中爆发的次数急剧上升，造成的危害越来越严重，才引起了世界范围的广泛关注(张鲁安.新疆猪伪狂犬病流行病学调查及病毒株的分离鉴定.[硕士论文].西北农林科技大学，2005)。
[0004]目前对伪狂犬病最有效的防控措施无疑是对猪群进行疫苗接种、淘汰猪场带毒的生产母猪以及严格的生物安全措施。当前，应用于规模化猪场的猪伪狂犬病疫苗主要有猪伪狂犬病灭活疫苗和基因缺失疫苗两种，其中gE基因缺失疫苗应用最为普遍。gE基因缺失的疫苗不但对种猪、仔猪十分有效，对初生仔猪超前免疫也十分安全，具有坚强的保护力，对于发病猪还具有较好的紧急免疫防控效果；并且可以通过血清学(ELISA)方法对免疫猪群和野毒感染猪群进行区分，通过一系列的措施可以达到猪群净化的效果。
[0005]但在国内，猪伪狂犬病毒野毒株仍在一定程度上流行，并存在爆发的可能性。现有检测猪伪狂犬病毒野毒株的引物、探针和试剂盒的特异性和灵敏性较低，不能快速对PRV野毒株进行检测。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，通过对猪伪狂犬病毒gE基因的分析，设计引物和探针，可以快速、特异的对伪猪狂犬病毒野毒株进行扩增、诊断；并将该引物和探针制备成试剂盒或应用于检测猪伪狂犬病毒野毒株的试剂中。
[0007]本发明通过以下技术方案实现上述目的:
[0008]猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2 所示。
[0009]猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测探针，所述探针的序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0010]优选地，所述探针的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。
[0011]更优选地，所述探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。
[0012]一种猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测试剂盒，包括SEQ ID NO:1和SEQID N0:2所示的引物和SEQ ID N0:3所示的探针。
[0013]优选地，所述猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括定量PCR预混液，所述定量PCR预混液由以下组分组成:预混酶体系10 μ L，SEQ ID NO:1所示的引物0.2yL，SEQ ID NO: 2所示的引物0.2 μ L，SEQ ID NO: 3所示的探针0.1 μ L，R0X0.04 μ L,和无菌 双蒸水7.46 μ L。
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:本发明猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒，该引物和探针特异性和灵敏度都较高，且能够检测PRV野毒株，可以对各种临床样品进行检测，从而可以快捷地对PRV野毒进行诊断，操作简单、实用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为实施例1中多种样品的扩增曲线，其中曲线I为扁桃体病料PRV野毒株扩增曲线，曲线2为淋巴结病料PRV野毒株扩增曲线。
[0016]图2为实施例3特异性检测结果，其中曲线I为PRV野毒株阳性病料样品的扩增曲线；曲线2-7分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病疫苗的扩增曲线。
[0017]图3为实施例4灵敏度检测结果，曲线1-8分别代表的拷贝数分别为6.27 X IO9,
6.27Χ108、6.27Χ107、6.27Χ106、6.27Χ105、6.27Χ104、6.27Χ103、6.27X IO2Copies/μ L。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例进一步对本发明进行解释，以使本领域技术人员能更好地理解本发明并能予以实施，但实施例并不作为对本发明的限定。
[0019]实施例1荧光定量PCR方法检测猪伪狂犬病毒野毒株
[0020]根据NCBI登陆的猪伪狂犬病毒gE基因组序列，登录号:AY170318、AF403049、EF552427、KC415026、KC415029、KC415028、KC415027EU561349、JF797219 提供的信息，经过比对分析，设计了荧光定量PCR的引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID N0:1和SEQ IDNO:2所示,所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0021]SEQ ID NO:1:AACCGGAAGTGACGAATGGA ；
[0022]SEQ ID NO:2:CGGTTCTCCCGGTATTTAAGC ；[0023]SEQ ID NO:3:CCAACCGCCTGTTGATGTCCCG。
[0024]使用上述引物和探针进行荧光定量PCR扩增，通过扩增曲线快速、准确的鉴别猪伪狂犬病毒野毒株。具体的荧光定量PCR方法为:
[0025](I)提取待检样品DNA =IOOmg的扁桃体病料和IOOmg淋巴结以及200 μ L DMEM细胞培养基作为待检样品。其中，DMEM细胞培养基，不含PRV野毒，为阴性对照。具体的提取样品DNA的操作如下:
[0026]向待检样品中加入ImL PBS缓冲液进行充分研磨，_20°C反复冻融3次，8000rpm离心lOmin，取上清液200 μ L，用商品化DNA抽提试剂盒进行抽提，提取的DNA保存于_20°C，作为后续实验的DNA模板。
[0027](2)扩增体系:将2 μ L DNA模板加入到定量PCR预混液中，配制20 μ L反应体系，并混合均匀。其中定量PCR预混液为:
[0028]①.预混酶体系:THUNDERBIRDProbe qPCR MixlO μ L，购自 TOYOBO 公司；
[0029]②.上游引物F和下游R各0.2yLO^S20pmol);所述上游引物F的序列为SEQID NO:1所示；所述下游引物R的序列为SEQ ID NO: 2所示；由大连宝生物工程有限公司合成；
[0030]③.ROX0.04 μ L ;
[0031]④.探针P(20pmol)0.1 μ L,探针P的序列为SEQ ID NO: 3所示，由上海基康生物技术有限公司合成，探针P的5’端和3’端分别标记FAM和TAMRA ；
[0032]⑤.自制无菌双蒸水7.46 μ L。
[0033](3)扩增条件:将步骤⑵的PCR管置于ABI公司7500Fast定量PCR仪上进行扩增反应，扩增条件为:50°C，保持2min ;95°C，保持IOmin ;95°C，15s，60°C，lmin，共40个循环。
[0034](4)结果判定:有扩增曲线出现且CT值小于35的即是PRV野毒阳性。其中扩增曲线CT值小于35的判断为阳性，CT值大于35的超出本方法灵敏度，判为阴性。检测结果见表1。
[0035]表1待检样品检测结果
[0036]
【权利要求】
1.猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQID NO:1 和 SEQ ID NO: 2 所示。
2.猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述探针的序列如SEQID NO:3 所示。
3.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述探针的3’端结合荧光淬灭基团，5’端结合荧光报告基团。
4.根据权利要求3所述的猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。
5.一种猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括SEQ IDN0:1和SEQ ID N0:2所示的引物和SEQ ID N0:3所示的探针。
6.根据权利要求5所述猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括定量PCR预混液，所述定量PCR预混液由以下组分组成: 预混酶体系?ο μ L, SEQ ID NO:1所示的引物0.2 μ L， SEQ ID NO: 2所示的引物0.2 μ L， SEQ ID NO:3所示的探针0.1 μ L，
R0X0.04 μ L, 和无菌双蒸水7.46 μ L0
【文档编号】C12Q1/68GK103952500SQ201410217702
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】潘永飞, 王东东, 宋延华, 周庆丰, 李春梅, 卢围, 廖承球, 蔡新斌 申请人:广东温氏食品集团股份有限公司