一种连续低剂量辐射富集肿瘤干细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及一种连续低剂量辐射富集肿瘤干细胞的方法，所述方法包括培养癌细胞系，经过低剂量辐射处理，培养一段时间后，再次接受低剂量辐射处理，共计辐射n次，即可富集细胞系中的肿瘤干细胞，提高肿瘤干细胞比例。所述癌细胞系优选为乳腺癌细胞系。所述低剂量辐射处理优选为通过60Co进行低剂量辐射处理。所述低剂量优选为1.5-3Gy，更优选为2Gy。所述培养一段时间优选为培养1-2周。所述共计辐射n次优选为共计辐射三次。本发明提供了一种非常简单、实用的富集肿瘤干细胞的方法，为后续进一步研究肿瘤干细胞的特性开拓了新途径。
【专利说明】一种连续低剂量辐射富集肿瘤干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种连续低剂量辐射富集肿瘤干细胞的方 法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是一群异质性细胞的集合体，其中存在一群具有较强自我更新能力和致瘤 能力的细胞亚群，人们将其定义为肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells)。肿瘤干细胞理论认 为，在原发肿瘤病灶处存在一定量的肿瘤干细胞，经过手术、化疗和放疗等常规治疗后，虽 然能够杀死几乎全部的肿瘤细胞，但是还存留有一定的肿瘤干细胞，由于肿瘤干细胞具有 很强的自我更新能力，会在原病灶处重新产生肿瘤，使疾病复发，同时肿瘤干细胞能够在机 体内转移，形成转移灶（见 Vermeulen, L.，Sprick, M. R.，Kemper, K.，Stassi, G. &Medema，J. P. Cancer stem cells--〇1d concepts,new insights. Cell Death Differ 15, 947-958, 2008 和 Clarke，M. F. et al. Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions:AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer research 66, 9339-9344, 2006)。因此对肿瘤干细胞的深入研究有助于理解肿瘤的发生、发展及转移 的分子机制，对肿瘤的检测及治疗具有重要的临床意义。
[0003] 肿瘤干细胞在肿瘤中的比例极小，利用现有的分离方法，如利用特定肿瘤细胞表 面的特异性抗原分子标记，只能从大量的肿瘤组织或肿瘤细胞系中获取极少量的肿瘤干细 胞进行生物学研究，在一些需要样品量较多的实验上，样品获取就更加不易。
[0004] 关于肿瘤干细胞与辐射之间的关系，2006年，Pajonk，F.及其研究团队发现 ⑶44 +CD24_/lOT细胞对辐射具有抗性，并且乳腺癌细胞在经历连续低剂量处理之后，其中 的 CD44+CD24-/1? 细胞比例能够得到提升（见 Phi 11 ips, Τ· M.，Mcfcide, W. H. &Pa jonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute 98, 1777-1785, 2006)。2012 年，Yawei Yuan及其同事的研究也发现自我更新能力强的细胞表现出更强的耐辐射能力（见Xie，G. et al. Mammosphere cells from high-passage MCF7cell line show variable loss of tumorigenicity and radioresistance. Cancer letters 316, 53-61，2012) 〇 因此，在现有 的研究基础之上，发明人模拟临床放射治疗手段，充分研究肿瘤干细胞富集与连续低剂量 辐射之间的关系，旨在发明一种切乎实际的富集肿瘤干细胞的手段，用以改变本研究领域 肿瘤干细胞样品稀少的局面。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种切乎实际的富集肿瘤干细胞的方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供一种连续低剂量辐射富集肿瘤干细胞的方法。
[0007] 所述方法包括培养癌细胞系，经过低剂量辐射处理，培养一段时间后，再次接受低 剂量辐射处理，如此重复辐射，共计辐射η次，即可富集细胞系中的肿瘤干细胞，提高肿瘤 干细胞比例。η为大于或等于1的整数。
[0008] 优选地，所述癌细胞系为乳腺癌细胞系。
[0009] 优选地，所述低剂量辐射处理为通过6°Co进行低剂量辐射处理。
[0010] 优选地，所述低剂量为1. 5-3Gy。
[0011] 优选地,所述低剂量为2Gy。
[0012] 优选地，所述培养一段时间为培养1-2周。
[0013] 优选地，所述共计辐射η次为共计辐射三次。
[0014] 可以通过以下至少三种方法鉴定肿瘤干细胞是否得到富集：
[0015] 鉴定方法一：
[0016] 将分别经过连续低剂量处理的细胞系进行生物学鉴定，首先是通过抗体识别乳腺 癌肿瘤干细胞表面特异性抗原⑶44+⑶24_/1<w，利用流式细胞仪对细胞系中⑶44+⑶24_A° W的 比例进行分析，若细胞系中的CD44+CD24-/lOT比例得到提升，则说明细胞系中肿瘤干细胞得 到了有效富集。
[0017] 鉴定方法二：
[0018] 将经过连续低剂量处理的细胞系进行生物学鉴定，利用肿瘤干细胞鉴定的"金标 准"--小鼠成瘤实验对富集得到的肿瘤干细胞进行鉴定；将一定数目的细胞注射到免疫 系统缺陷的小鼠体内，观察并统计其成瘤情况。理论上讲，肿瘤干细胞的比例得到提升之后 细胞群体的致瘤能力增强，所以在小鼠体内成瘤所需的细胞数目就会减少，因此只要实验 数据与理论数据趋势相一致，则说明细胞系中的肿瘤干细胞得到了有效富集。
[0019] 鉴定方法三：
[0020] 将经过连续低剂量处理的细胞系进行生物学鉴定，根据肿瘤干细胞自我更新能力 增强的特性，对经过连续低剂量处理的细胞系进行悬浮培养以及对细胞中干性因子进行检 测，若分析得到经过多次照射的细胞系的自我更新能力较强且其中的干性因子表达量明显 升高，则说明细胞系中的肿瘤干细胞得到了有效富集。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 本发明提供了一种非常简单、实用的富集肿瘤干细胞的方法，为后续进一步研究 肿瘤干细胞的特性开拓了新途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为乳腺癌细胞系在经过连续低剂量辐射之后细胞的⑶44+CD24_A° w的比例统 计分析结果。
[0024] 图2为乳腺癌细胞系MDA-MB-231在经过连续低剂量辐射之后细胞干性因子的 q-PCR定量分析结果。
[0025] 图3为乳腺癌细胞系MCF7在经过连续低剂量辐射之后细胞干性因子的q-PCR定 量分析结果。
[0026] 图4为乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7在经过连续低剂量辐射之后细胞利用悬 浮培养系统鉴定其自我更新能力实验结果。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于举例说明本发明，其并不用于限制本发明。
[0028] 实施例1 MDA-MB-231肿瘤干细胞的富集
[0029] 常规实验室条件下培养乳腺癌细胞系MDA-MB-231，经过同位素6°Co放射源、2Gy照 射处理（以139. 09cGy/min的剂量处理1:17min)，处理后常规培养1-2周，待细胞生长状况 稳定，再次接受6°C 〇、2Gy照射处理，如此重复照射，分别收集辐射l*2Gy、2*2Gy和3*2Gy的 细胞（n*2Gy)。
[0030] 实施例2 MCF7肿瘤干细胞的富集
[0031] 常规实验室条件下培养乳腺癌细胞系MCF7,经过同位素6°Co放射源、2Gy照射处理 (以139. 09cGy/min的剂量处理1:17min)，处理后常规培养1-2周，待细胞生长状况稳定， 再次接受6°C 〇、2Gy照射处理，如此重复照射，分别收集辐射l*2Gy、2*2Gy和3*2Gy的细胞 (n*2Gy)。
[0032] 实施例3流式细胞术分析肿瘤干细胞的富集
[0033] 将实施例1和2所获得的细胞，分别通过⑶24-APC和⑶44-FITC两种抗体对细胞 进行孵育，利用流式细胞仪分析发现在两种细胞系中连续低剂量辐射能将CD44 +CD2€/lw的 比例提升，尤其是在MCF7细胞系中，肿瘤干细胞的比例升高将近10倍，因此说明利用连续 低剂量辐射乳腺癌细胞系是能够提高其中的肿瘤干细胞比例（见图1)。
[0034] 上述流式细胞术实验过程简述如下：利用流式细胞仪分选的方法，首先分别收集 不同批次处理的细胞，用磷酸缓冲液PBS清洗干净之后，用⑶24-APC和⑶44-FITC两种抗 体对细胞进行孵育，分别选用635nm和488nm激发光，对比阴性对照和单阳对照进行象限分 析。
[0035] 实施例4通过干性因子mRNA水平分析肿瘤干细胞的富集
[0036] 为了确定连续低剂量辐射之后细胞中多种干性因子的表达水平，发明人利用实时 定量Real-Time RT-PCR方法对实施例1和2所获得的细胞中的干性因子mRNA水平进行 了检测。检测结果显示：MDA-MB-231细胞系在连续低剂量照射两次之后，干性因子0CT4/ S0X2/KLF4等均有不同水平的显著性升高，其中S0X2因子更是比对照组高出7倍之多； MCF7细胞系则是在经过一次低剂量照射之后，细胞中的干性因子就有明显的增高，其中的 NAN0G因子超过对照组18倍（见图2、图3)。
[0037] 实施例5悬浮培养分析肿瘤干细胞的富集
[0038] 为了确定利用连续低剂量辐射之后富集得到的是否为肿瘤干细胞，因此根据肿瘤 干细胞具有较强的自我更新能力这一特性，发明人利用悬浮培养体系来检测细胞系的自我 更新能力。实验流程如下：首先通过正常培养体系得到各种经过连续低剂量处理的细胞系， 用培养基稀释到一定比例，利用血球计数板计数，接种细胞密度为10, 〇〇〇/ml进行悬浮培 养，生长7天之后，观察并统计各种处理细胞的成球情况。根据观察统计，可以看出两种细 胞系在接受连续低剂量辐射之后细胞的自我更新能力都得到明显增强，说明细胞系中的肿 瘤干细胞得到了有效富集（见图4)。
[0039] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种连续低剂量辐射富集肿瘤干细胞的方法，其特征在于： 培养癌细胞系，经过低剂量辐射处理，培养一段时间后，再次接受低剂量辐射处理，如 此重复辐射，共计辐射η次；η为大于或等于1的整数。
2. 根据权利要求1所述的方法，所述癌细胞系为乳腺癌细胞系。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，所述低剂量辐射处理为通过6°Co进行低剂量辐射 处理。
4. 根据权利要求3所述的方法，所述低剂量为1. 5-3Gy。
5. 根据权利要求4所述的方法，所述低剂量为2Gy。
6. 根据权利要求3所述的方法，所述培养一段时间为培养1-2周。
7. 根据权利要求3所述的方法，所述共计辐射η次为共计辐射三次。
8. 根据前述任一项所述的方法，还包括鉴定肿瘤干细胞是否得到富集的步骤。
【文档编号】C12N13/00GK104152434SQ201410367053
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】孙英丽, 于慧 申请人:中国科学院北京基因组研究所