利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法
【专利摘要】本发明提供一种利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法，包括以下步骤：(1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs；(2)培养二代RMMVECs，将小檗碱溶解于维持培养基中，浓度为10μg/ml，在37℃、5％CO2的条件下，将RMMVECs继续培养9h；等九步步骤；本发明成功培养了RMMVECs，并且利用基因芯片技术从基因表达水平充分验证了，提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分Ast和Ber能双向调节RMMVECs相关细胞因子的表达，维持细胞因子分泌的平衡，维持MVECs的正常生理功能，从而阻断了致病因子对微血管内皮细胞的伤害，发挥治疗疾病的作用。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，尤其是涉及一种利用基因芯片检测小檗碱诱导 RMMVECs基因表达谱的方法。 利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法
【背景技术】
[0002] 基因芯片（gene chip)又称为DNA阵列，为生物芯片的一种，是指将大量DNA或寡 核苷酸探针密集排列形成的探针阵列。基因芯片的技术原理是DNA的碱基配对和互补，基 础是杂交测序（SBH)。基因芯片采用光导原位合成或微量点样的方法，将寡核苷酸或cDNA 有序地固化于支持物的表面，与已标记的待测生物样品的cDNA或cRNA杂交，通过激光共 聚焦扫描等特殊设备对杂交信号的强度进行检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。从 二十世纪八十年代初SBH概念的提出，到目前的商品化基因芯片在这十几年时间里，芯片 的制作技术不断完善、芯片的概念不断延伸、芯片的应用范围不断拓展，使得生物芯片技术 对二十一世纪生命科学和医学的发展产生无法估量的影响。芯片所带来的巨大学术价值、 社会价值和经济价值引起了多家大公司及多国政府机构的极大兴趣，并投以可观的财力， 这又使芯片技术得以迅速发展。
[0003] 目前基因芯片按功能可以分为表达谱基因芯片和DNA测序芯片两大类；按探针的 长短可分为长探针芯片和短探针芯片。
[0004] 基因芯片是后基因组时代一项重要技术，它的出现为中医药学的现代化提供了一 个很好的切入点，其特点是可以在同一时刻对成千上万个基因的表达情况进行分析，形成 完整的细胞基因表达谱，解决了传统中药药理研究方法周期长、耗时多、产出少的问题。微 血管内皮细胞能够通过其分泌功能发挥信息的传导和调节功能，保证血液与组织液之间、 血液与淋巴液之间以及血液本身的有形成分与血浆之间复杂的生理、生化以及血流动力 学的内环境平衡，同时分泌多种细胞因子和局部激素，参与一系列生理和病理过程。但是 在现今的微血管内皮细胞的相关研究领域中，基因芯片技术的应用还不是很普遍。张斌 等应用基因芯片技术分别检测正常浓度和高浓度D-葡萄糖培养基中培养后内皮细胞的 基因表达谱。结果表明高糖可能通过影响微血管内皮物质代谢、信号转导、细胞膜结构和 细胞外基质等的表达而导致血管内皮功能素乱，为进一步研究1?糖对微血管内皮细胞基 因表达谱的影响提供资料。ΥμΕ Fei等采用基因芯片技术研究了碱性成纤维细胞生长因 子（basic fibroblast growth factor, bFGF)对小鼠脑微血管内皮细胞（microvascylar endothelial cell, MVEC)株bEnd. 3中血管新生相关基因表达谱的改变，结果提示：bFGF具 有上调促血管新生基因表达，下调抑制血管新生基因表达的作用，两者协同作用，促进血管 新生。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的一个技术问题就是通过对小檗碱诱导体外培养的RMMVECs产生的 差异性基因表达谱的分析，来探讨提高微血管舒缩活动振幅的分子机制，从基因表达水平 充分验证了，提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分Ber能双向调节RMMVECs相关细胞 因子的表达，维持细胞因子分泌的平衡，维持MVECs的正常生理功能，从而阻断了致病因子 对微血管内皮细胞的伤害，发挥治疗疾病的作用。
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供一种利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因 表达谱的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs ;
[0008] (2)培养二代RMMVECs，将小檗碱溶解于维持培养基中，浓度为10 μ g/ml，在37°C、 5% C02的条件下，将RMMVECs继续培养9h ;
[0009] (3)将RMMVECs充分裂解，提取总RNA ;
[0010] (4)纯化、定量总RNA ;
[0011] ⑶反转录合成 First-strand cDNA ;
[0012] (6)合成 Second-strand cDNA ;
[0013] (7)体外转录合成cRNA ;
[0014] (8)cRNA 反转录；
[0015] (9)荧光标记后进行基因芯片杂交，最后进行数据分析。
[0016] 所述方法，步骤（1)中采用差速贴壁法对所制备的RMMVECs进行纯化。
[0017] 所述方法，步骤（3)中充分裂解的方法为：将RMMVECs用37°C预热的PBS清洗3 遍，加入2ml Trizol溶液，静置5min，用移液枪吹打，使RMMVECs充分裂解，转入离心管， 于-80°C冰箱保存待用；
[0018] 提取总RNA的方法为：将于-80°c冰箱保存的溶于Trizol液中的细胞样品解冻， UOOOrpnufC离心5min，弃沉淀，将上清转入一新的离心管内；按Trizol :氯仿为5 :1的体 积量加入氯仿，剧烈振荡混勻至粉牛奶状，室温静置3min，12000rpm，4°C离心15min，取上 清至一新离心管，加入等体积异丙醇，混勻，室温静置5min，12000rpm，4°C离心15min，可见 白色RNA沉淀；弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇lml，使沉淀悬浮于乙醇中，7500rpm， 4°C离心15min ;弃去上清，再加入75%乙醇lml，重复上步；而后吸去所有上清，待残余乙醇 挥发尽后加入50 μ 1 DEPC水溶解RNA沉淀，-20°C冷冻保存。
[0019] 所述方法，步骤（5)中反转录合成First-strand cDNA的方法步骤为：
[0020] E.取总RNA 500ng，调整体积到4μ L ;
[0021] F.加入基因表达谱外参1 μ 1 ;
[0022] G.配制反转录Master Mix，其中 First Strand Β μ ffer Mix4 μ L，First Strand Enzyme Mix 1 μ L，轻轻混勻，短暂离心置于冰上；取配好的5 μ L Master Mix分别转移至含 有总RNA样品的0. 2mL离心管中；
[0023] H.轻轻混匀溶液，瞬时离心后42°C反应2小时；将PCR仪的热盖温度也设置成 42°C,避免溶液蒸到管壁上；反应完后冰浴5分钟。
[0024] 5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（6)中合成Second-strand cDNA的方法步骤为：
[0025] D.配制 Second-strand Master Mix,其中 Ν μ clease-free Water 13 μ L, Second-strand Buffer Mix 5 μ L，Second-strand Enzyme Mix 2 μ L，轻轻混勻，短暂离心 后冰浴；取上步反应完毕的样品管中加入配好的20 μ L Second Strand Master Mix ;
[0026] Ε·轻轻混匀，16°C反应 1 小时，65°C lOmin ;
[0027] F.反应结束后将反应物置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于_20°C。
[0028] 6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（7)中体外转录合成cRNA 的方法步骤为：
[0029] E. cRNA 合成：配制体外转录 Master Mix，其中 Νμ clease-free Water4 μ L，T7 B μ ffer Mix 20 μ L，T7 Enzyme Mix 6L，轻轻混勻，短暂离心，往上一反应中准备好的样品 管中加入 30 μ L Master Mix ;
[0030] R轻柔混勻，40°C反应16. 5小时；
[0031] G.反应完成后，准备纯化cRNA ;
[0032] Η·纯化、定量 cRNA。
[0033] 所述方法，步骤（8)中cRNA反转录的方法步骤为：
[0034] A.取cRNA纯化产物5 μ g，调整体积到7. 5 μ 1，加入到0. 2ml无核酸酶离心管中， 加入4 μ 1随机引物，混匀，65°C反应5分钟，冰浴5分钟；
[0035] B.配制反转录Master Mix，其中4XCbcScript II Βμ ffer 5μ L，0. 1M DTT 2μ L， CbcScriptll 1.5yL，轻轻混勻，短暂离心；往反应完的样品管中加入8. 5μ1 Master Mix ；
[0036] C.轻轻混匀，25°C反应10分钟，37°C反应1. 5小时；
[0037] D.反应结束后加入 Terminate Sol μ tion 5 μ 1，混勻；
[0038] Β. (5) 65 °C反应10分钟，室温5分钟；
[0039] E.加入 Ne μ tralize Sol μ tion 1 μ 1，混勻，准备纯化；
[0040] F.纯化、定量反转录产物。
[0041] 所述方法，步骤（9)中荧光标记的方法步骤为：
[0042] Ε.将纯化后反转录得到的cDNA真空浓缩到14μ L，60°C，5min，加入4μ L随机引 物，混匀；95 °C反应3分钟，冰浴5分钟；
[0043] F.反应结束后加入1 μ L Cy3 ;
[0044] G.配制 Mix，其中 5 XKlenow Β μ ffer 5 μ L，Klenow Fragment 1· 2 μ L，向上述混 合液中加入6. 2 μ L Mix，混匀，瞬离，37°C反应1. 5小时，70°C反应5分钟，冰浴5分钟，准备 纯化；
[0045] H.纯化、定量标记产物；
[0046] 所述方法，步骤（9)中基因芯片杂交的方法步骤为：
[0047] A.芯片的准备：
[0048] a.水合：已选定的芯片于65°C水浴锅上离水面10cm左右，蒸10-15秒；瞭干10-15 秒，再蒸10-15秒；
[0049] b.紫外交联：设置250 ;
[0050] c.第一遍洗：0· 5% SDS，微波炉加热至42-45°C，摇床lOmin,洗去cy3 ;
[0051] d.第二遍洗：纯水42°C，漂洗去SDS，转入下一个洗片槽；
[0052] e.第三遍洗：纯水42°C，摇床l_2min，将SDS洗去，甩干；
[0053] B.样品的准备：
[0054] a.将cy3/cy5分别浓缩至19. 2 μ L左右，在cy3 (cy5)中加杂交液41. 6 μ L，再将 cy5(cy3)吸至cy3(cy5)中，混勻，震荡，瞬离；
[0055] b.其中杂交液配制：甲酰胺 20yL，20*SSC 12yL，10*SDS 1.6yL，50*Dehart 8 μ L ；
[0056] c. 95°C，3min，期间剪1 X4cm滤纸，放入芯片盒中，加100-180 μ L蒸馈水，准备洗 液 l:600mL，洗液 2:1L ;
[0057] cL取出PCR管，骤冷，放入架子上，准备上样；
[0058] e.用吸耳球吹吹芯片，加样时靠左点成1.5cm左右的直线，然后用枪头辅助将盖 玻片盖上；
[0059] f.用枪头调整一下盖玻片的整齐程度，放入芯片盒，放入杂交仪，配平，放一水瓶 保湿；设置：42°C，23小时，6转，开始Hyb杂交，杂交23小时；
[0060] C.杂交结束准备读片：杂交后洗片，扫描仪预热lOmin，选择小块区域：power-80， PMT-800,先扫红通道，再扫绿通道，保证饱和点（白点数）小于千分之5,扫描完成后，保存。
[0061] 所述方法，步骤（9)中数据分析的方法步骤为：用Lμ xScan 3. 0软件将扫描图像 转化为信号值；根据探针信号值的P值确定基因表达（P值< 〇. 05)、临界表达（0. 05 < P 值< 0. 065)和不表达（P值> 0. 065);分别对6张芯片的信号值做归一化处理后，将6组 分别与空白组比较，判别某一基因是否发生表达变化：当信号比值> 2时，视为基因表达上 调；当信号比值< 〇. 5时，视为基因表达下调；当比值介于两者之间时，视为基因未发生有 生物学意义的表达变化；最后用Microsoft Excel、S μ Μ和C1 μ ster等软件对各组数据进 行统计和聚类分析。
[0062] 1(^8/!^的六8七和861'分别作用冊1^〇8 911后基因芯片结果显示，各组与空白对 照组相比，差异表达基因数量如下：Ast组共2231个，其中上调2166个，下调65个；Ber组 共576个，其中上调513个，下调63个。结合pathway分析结果表明，Ast和Ber组中大多 数通路上有功能相近、差异表达却相反的成对基因，说明两者能双向调节RMMVECs相关细 胞因子的表达。Ast和Ber组共同发生差异性表达的基因共47个，参与22个信号通路，包 括肌动蛋白细胞骨架调节、钙信号通路、Notch蛋白介导的信号通路、紧密连接、粘着连接等 信号通路，涉及血管容量调节、N0合酶生物合成的调节，内皮细胞分化，细胞生长和维持，平 滑肌细胞的调节，蛋白质代谢与修饰，糖代谢，DNA复制等功能。
[0063] 本发明成功培养了 RMMVECs，并且利用基因芯片技术从基因表达水平充分验证了， 提高微血管舒缩活动振幅的中药有效成分Ast和Ber能双向调节RMMVECs相关细胞因子的 表达，维持细胞因子分泌的平衡，维持MVECs的正常生理功能，从而阻断了致病因子对微血 管内皮细胞的伤害，发挥治疗疾病的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0064] 图1为RMMVECS正常形态A :倒置显微镜镜下照片（10X4) ;B :爾F-Ag免疫细胞 化学鉴定阳性结果（10X20);
[0065] 图2为甲醛变性电泳的生物质量鉴定，其中：（1-6:对照组RMMVECs, 7-9:Ast处理 组 RMMVECs ; 10-12: Ber 处理组 RMMVECs ;上为 28S,下为 18S);
[0066] 图3RMMVECS的Ast组比对照组组的信号散点图；
[0067] 图4RMMVECS的Ber组比对照组的信号散点图；
[0068] 图5RMMVECs的Ast组比对照组3个生物学重复的聚类图；
[0069] 图6RMMVECS的Ber组比对照组的3个生物学重复的聚类图。
【具体实施方式】
[0070] 下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的 情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
[0071] 1.1主要仪器设备
[0072]
【权利要求】
1. 利用基因芯片检测小檗碱诱导RMMVECs基因表达谱的方法，其特征在于：包括以下 步骤： (1) 制备并纯化大鼠心肌膜微血管内皮细胞RMMVECs ; (2) 培养二代RMMVECs，将小檗碱溶解于维持培养基中，浓度为10μ g/ml，在37°C、5% C02的条件下，将RMMVECs继续培养9h ; (3) 将RMMVECs充分裂解，提取总RNA ; (4) 纯化、定量总RNA ; (5) 反转录合成 First-strand cDNA; (6) 合成 Second-strand cDNA ; (7) 体外转录合成cRNA ; (8) cRNA反转录； (9) 荧光标记后进行基因芯片杂交，最后进行数据分析。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)中采用差速贴壁法对所制 备的RMMVECs进行纯化。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)中充分裂解的方法为：将 RMMVECs用37°C预热的PBS清洗3遍，加入2ml Trizol溶液，静置5min，用移液枪吹打，使 RMMVECs充分裂解，转入离心管，于-80°C冰箱保存待用； 提取总RNA的方法为：将于-80 °C冰箱保存的溶于Trizol液中的细胞样品解冻， UOOOrpnufC离心5min，弃沉淀，将上清转入一新的离心管内；按Trizol :氯仿为5 :1的体 积量加入氯仿，剧烈振荡混勻至粉牛奶状，室温静置3min，12000rpm，4°C离心15min，取上 清至一新离心管，加入等体积异丙醇，混勻，室温静置5min，12000rpm，4°C离心15min，可见 白色RNA沉淀；弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇lml，使沉淀悬浮于乙醇中，7500rpm， 4°C离心15min ;弃去上清，再加入75%乙醇lml，重复上步；而后吸去所有上清，待残余乙醇 挥发尽后加入50 μ 1 DEPC水溶解RNA沉淀，-20°C冷冻保存。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（5)中反转录合成 First-strand cDNA的方法步骤为： A.取总RNA500ng，调整体积到4 μ L ; Β.加入基因表达谱外参1 μ 1 ; C. 配制反转录 Master Mix，其中 First Strand Buffer Mix4 μ L，First Strand Enzyme Mix 1 μ L，轻轻混勻，短暂离心置于冰上；取配好的5yL Master Mix分别转移至含 有总RNA样品的0. 2mL离心管中； D. 轻轻混匀溶液，瞬时离心后42°C反应2小时；将PCR仪的热盖温度也设置成42°C， 避免溶液蒸到管壁上；反应完后冰浴5分钟。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（6)中合成Second-strand cDNA的方法步骤为： A. 配制 Second-strand Master Mix，其中 Νμclease-free Water 13 μ L， Second-strand Buffer Mix 5yL，Second_strand Enzyme Mix 2μ?，轻轻混勻，短暂离心 后冰浴；取上步反应完毕的样品管中加入配好的20 μ L Second Strand Master Mix ; B. 轻轻混匀，16°C反应1小时，65°C lOmin ; C.反应结束后将反应物置于冰上继续合成反应，或者迅速冻存于-20°c。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（7)中体外转录合成cRNA的方 法步骤为： A. cRNA合成：配制体外转录Master Mix，其中Nyclease-free Water4yL，T7 Buffer Mix 20 μ L，Τ7 Enzyme Mix 6L，轻轻混勻，短暂离心，往上一反应中准备好的样品管中加入 30 μ L Master Mix ； B. 轻柔混匀，40°C反应16. 5小时； C. 反应完成后，准备纯化cRNA ; D. 纯化、定量cRNA。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（8)中cRNA反转录的方法步骤 为： A. 取cRNA纯化产物5 μ g，调整体积到7. 5 μ 1，加入到0. 2ml无核酸酶离心管中，加入 4 μ 1随机引物，混勻，65°C反应5分钟，冰浴5分钟； B. 配制反转录 Master Mix，其中 4XCbcScript II Β μ ffer 5 μ L，0· 1M DTT 2 μ L， CbcScriptll 1.5yL，轻轻混勻，短暂离心；往反应完的样品管中加入8. 5μ1 Master Mix ； C. 轻轻混匀，25°C反应10分钟，37°C反应1. 5小时； D. 反应结束后加入Terminate Solution 5 μ 1，混勻； A. (5) 65°C反应10分钟，室温5分钟； E. 加入 Neutralize Solution 1 μ 1，混勻，准备纯化； F. 纯化、定量反转录产物。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（9)中荧光标记的方法步骤为： Α.将纯化后反转录得到的cDNA真空浓缩到14 μ L，60°C，5min，加入4 μ L随机引物，混 匀；95 °C反应3分钟，冰浴5分钟； B. 反应结束后加入1 μ L Cy3 ; C. 配制Mix，其中 5XKlenow Buffer 5uL，Klenow Fragment 1.2uL，向上述混合液 中加入6. 2 μ L Mix，混匀，瞬离，37°C反应1. 5小时，70°C反应5分钟，冰浴5分钟，准备纯 化； D. 纯化、定量标记产物。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（9)中基因芯片杂交的方法步 骤为： A. 芯片的准备： a. 水合：已选定的芯片于65°C水浴锅上离水面10cm左右，蒸10-15秒；瞭干10-15秒， 再蒸10-15秒； b. 紫外交联：设置250; c. 第一遍洗：0. 5% SDS，微波炉加热至42-45°C，摇床lOmin，洗去cy3 ; d. 第二遍洗：纯水42°C，漂洗去SDS，转入下一个洗片槽； e. 第三遍洗：纯水42°C，摇床l_2min，将SDS洗去，甩干； B. 样品的准备： a. 将cy3/cy5分别浓缩至19. 2yL左右，在cy3(cy5)中加杂交液41.6yL，再将 cy5(cy3)吸至cy3(cy5)中，混勻，震荡，瞬离； b. 其中杂交液配制：甲酰胺 20yL，20*SSC 12yL，10*SDS L6yL，50*Dehart 8yL; c. 95°C，3min，期间剪lX4cm滤纸，放入芯片盒中，加100-180 μ L蒸馏水，准备洗液 1:60〇11^，洗液2:比； d. 取出PCR管，骤冷，放入架子上，准备上样； e. 用吸耳球吹吹芯片，加样时靠左点成1.5cm左右的直线，然后用枪头辅助将盖玻片 盖上； f. 用枪头调整一下盖玻片的整齐程度，放入芯片盒，放入杂交仪，配平，放一水瓶保湿； 设置：42°C，23小时，6转，开始Hyb杂交，杂交23小时； C.杂交结束准备读片：杂交后洗片，扫描仪预热lOmin，选择小块区域：power-80， PMT-800,先扫红通道，再扫绿通道，保证饱和点（白点数）小于千分之5,扫描完成后，保存。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（9)中数据分析的方法步骤 为：用L μ xScan3. 0软件将扫描图像转化为信号值；根据探针信号值的P值确定基因表达 (P值< 0. 05)、临界表达（0. 05 < P值< 0. 065)和不表达（P值> 0. 065);分别对6张芯片 的信号值做归一化处理后，将6组分别与空白组比较，判别某一基因是否发生表达变化：当 信号比值彡2时，视为基因表达上调；当信号比值< 0. 5时，视为基因表达下调；当比值介 于两者之间时，视为基因未发生有生物学意义的表达变化；最后用Microsoft Excel、Sy Μ 和Cl μ ster等软件对各组数据进行统计和聚类分析。
【文档编号】C12Q1/68GK104087681SQ201410369360
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】董虹, 张涛, 姜代勋, 胡格, 段慧琴, 穆祥, 陈武 申请人:北京农学院