一种快速灵敏检测小分子rna的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，属于分子生物领域，包括以下步骤：（1）提取、纯化待检测小分子RNA；（2）探针设计：探针用生物素或地高辛进行标记；（3）液相杂交：将所述待检测小分子RNA与所述探针在缓冲液中进行杂交，用外切酶切除未杂交的多余单链后进行凝胶电泳；（4）转膜：将电泳后的凝胶上的杂交产物转移到固相支持物（如尼龙膜，纤维素膜）上；（5）抗体孵育：将步骤（4）所得到的含有杂交产物的固相支持物与特异性抗体进行孵育杂交；（6）信号检测。本方法最低可以检测0.005fmol的miRNA，灵敏度比现有技术提高了至少10倍。本方法检测速度快，可实现高通量检测和定量检测。
【专利说明】一种快速灵敏检测小分子RNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物领域，特别涉及一种快速灵敏检测小分子RNA的方法。
【背景技术】
[0002]小分子RNAs (miRNAs)是一类非编码的内源性RNAs，在多细胞物种乃至单细胞物种中都有被发现，小RNA可以反应转录到翻译水平的基因表达情况，因此，在不同组织和不同发育阶段，其表达量有很大的差异，不同小RNA之间也有很大差异。一系列的研究数据表明，小RNA CmiRNAs)能够通过互补碱基修复模式在转录后水平上调控基因表达，也可以在DNA水平上通过促使DNA甲基化来调控基因表达。因此，小RNA在几乎所有生物学方面包括生理的，生化的，发育的及病理的反应过程中都起着重要的作用。此外，在活细胞中还有许多其他的非编码小分子RNAs，它们也在基因表达过程中起着重要而特别的作用，如21nt的siRNAs能够初始化RNA干扰从而对基因表达进行抑制，snRNA大概150nt，对于剪切类反应起到了催化作用，26-31 nt的piwiRNAs参与信使RNA (mRNA)的降解和转录抑制。
[0003]因此，要研究小RNA的功能和机制，必须掌握在活细胞生化过程中准确地测定小分子RNAs的方法。目前，小分子RNA检测包括下一代测序、Northern杂交、RT-PCR (实时PCR)及生物芯片。其中，下一代测序方法会得到大量的数据，需要人工及计算机进行长时间的分析和筛选，且需要用其他实验来验证；生物芯片的制作需要特别的工具材料及专业知识，普通实验室难以独立完成；RT_PCR虽然快速灵敏，但针对小RNA的检测，需要对反应的探针进行仔细的设计，且特异的探针花费较高。
[0004]1.Northern杂交可重复性高,结果好,经常作为RNA检测中的黄金标准来测定基因表达水平。但是传统方法灵敏度低，实验时间长，对人体和环境也有害。Wang等(Wang X，Tong Y, Wang S: Rapid and accurate detect1n of plant miRNAs by liquid northernhybridizat1n.1nt J Mol Sci 2010, 11:3138 - 3148)在2010年设计并提出了一种液相杂交快速检测小分子RNA的方法，弥补了传统Northern杂交耗时耗力并有危险性的缺点，但是，其灵敏度较低，约0.lpmol，不适用于检测表达量较低的小分子RNA。 Li等(Li X，Ni M, Zhang Y: Detecting miRNAs by liquid hybridizat1n and color development.Methods 2012，58:151-155.)在液相杂交的基础上提出了颜色观察法，将杂交后的核酸转移到膜上并通过免疫结合放大信号，使灵敏度提高到了 2.5fmol。但是这种方法不能显示条带，从而无法区分序列相似的小分子RNA，也难以实现多种小分子RNA的检测。郭耀辉等在“生物素标记探针一液相杂交一非变性PAG E检测非编码小RNA方法的建立和优化”(国际检验医学杂志2 O I 2年3月第3 3卷第6期)建立了生物素标记-液相杂交-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测非编码小RNA的方法，但这种方法由于无法去除多余探针，有较大的背景干扰问题，容易产生假阳性结果影响判断，难以实现灵敏、精确的检测。实际检测效果上，要获得较好的检测信号，该方法所需的探针浓度高达10 umol/L ;并且所需的时间较长，从杂交到检出信号，不包括电泳分离和转膜所花的时间就需时5小时。
【发明内容】
[0005]本发明的发明目的在于:针对上述存在的问题，提供一种兼顾灵敏度和检测效率的新的检测小分子RNA的方法。
[0006]本发明采用的技术方案是这样的，一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，包括以下步骤:
(1)提取、纯化待检测小分子RNA；
(2)探针设计:根据待检测小分子RNA的碱基序列设计探针，所述探针用生物素或地高辛进行标记；
(3)液相杂交:将所述待检测小分子RNA与所述探针在缓冲液中进行杂交，并消化掉未杂交的单链序列，然后进行凝胶电泳；
(4)转膜:将电泳后的凝胶上的杂交产物转移到固相支持物上；
(5)抗体孵育:将步骤(4)所得到的含有杂交产物的固相支持物与特异性抗体进行孵育杂交；
(6)信号检测:检测步骤(5)所得的固相支持物上的信号。
[0007]本发明将液相杂交与固相检测相结合的技术应用于小分子RNA的检测，同时在液相杂交时采用生物素或地高辛对探针进行标记，在大大提高小分子RNA检测灵敏度的同时，兼顾了小分子RNA的检测效率，单次检测时间缩短的同时，可以实现同时检测多种小分子 RNA。
[0008]作为优选的技术方案:还包括线性回归方程制作步骤:采用一系列浓度梯度的已知miRNA分别进行所述步骤(3) - (6)的操作，然后以已知miRNA的浓度为X轴，显色浓度为Y轴建立曲线坐标。
[0009]通过回归方程的制作，可以基于本发明的检测方法可以对小分子RNA进行定量检测。
[0010]固相支持物为尼龙膜、纤维素膜和PVDF膜中的任何一种，优选尼龙膜。
[0011]作为优选的技术方案:步骤(2)中，探针设计时，根据待检测小分子RNA的碱基序列，设计成DNA形式，根据此设计反向互补的寡核苷酸，并在5’端随机增加2个寡核苷酸后，再用生物素或地高辛标记。相对于在3’端进行标记生物素或地高辛，在5’端标记能让序列中所有碱基都可参与杂交，使得杂交完全，便于DNA外切酶消化，消除多余探针。
[0012]步骤(3)中，杂交反应体系于95°C变性0.5 min以上，优选为5 min，然后再42-65°〇杂交0.5 min以上，优选为42。。，lh。
[0013]作为优选的技术方案:步骤(3)中，所述凝胶为含IXTBE的10%_15%的聚丙烯酰胺凝胶。
[0014]作为优选的技术方案:步骤(3)中，用核酸外切酶消化了未杂交上的多余单链；杂交缓冲液中，磷酸根浓度为0-0.5 M，Na+浓度为0-1.5 M, EDTA浓度为0-0.5 M，pH为
6.0-9.5o
[0015]作为优选的技术方案:步骤(4)中，转膜时，根据凝胶的大小裁剪6张同样大小的滤纸，及I张固相支持物，按照从下到上依次为3层滤纸、凝胶、固相支持物、3层滤纸的顺序对齐摆放，然后将上述的滤纸、凝胶、固相支持物的“三明治”结构夹在两层湿润的固相支持物中间。
[0016]步骤(5)中，先将固相支持物加入封闭液后在20_37°C下孵育I min以上，优选为37°C、(5)min ;弃封闭液，然后加入稀释的抗体，在20_37°C下孵育5 min以上，优选为37°C，30mino
[0017]作为优选的技术方案:步骤(6)中，先将含有杂交产物的尼龙膜置于洗膜缓冲液中洗涤3次，每次lOmin，然后采用⑶P-Star检测方法或者X压片方法进行信号检测。
[0018]综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:
(1)、灵敏度高:本方法最低可以检测0.005fmol的miRNA(5aM=35fg =0.035pg)，相对以往的小RNA检测方法灵敏度提高了至少10倍，且无背景干扰；
(2)、快速:使用本方法检测小RNA分子，一次整个检测过程需时7h内；目前，传统的Northern杂交检测小分子RNA需时约2天，郭耀辉的方法在不包括小RNA提取，电泳分离以及转膜等步骤的情况下需要4.8h,而本方法在不包括这些操作步骤时只需要2.3h。本方法在实现了高灵敏度检测miRNA的同时，也大大缩短了检测的时间；
(3)、可以同时检测多种小分子RNA:本发明的检测方法可以在一个泳道同时检测多个小RNA分子，可以同时检测植物、动物和人类小分子RNA，并且灵敏度大幅度的提高；
(4)可以实现定量检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1是本发明实施例1的检测方法流程图；
图2是本发明实施例1中小分子RNA提取纯化后的电泳图；
图3是本发明实施例1中液相杂交后的电泳图；
图4是本发明实施例2中灵敏度试验结果图；
图5是本发明实施例3中实现小分子RNA定量检测结果图。
【具体实施方式】
[0020]下面对本发明作详细的说明。
[0021]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0022]实施例1:
本实施例以检测水稻叶片中的0sa-miR156及小鼠肝细胞、家鸡血液中的let_7_a为例。
[0023]整个检测方法的流程图如图1所示。
[0024]在实现本发明的目的过程中，通常包括以下步骤:
1.材料选择:新鲜的动植物组织、血液，或新鲜-70 0C冻存的样本。
[0025]2.试剂配置:
1)DEPC处理水RNasefree water:去离子水由Millpore水处理器处理,加入1/1000的DEPC水处理后高温高压灭菌30分钟，冷却至室温；
2)TBE:分别取 Tris:108g ；Na2EDTA.2H20:7.44g ;硼酸:55g，加入 800ml 的去离子水，充分搅拌溶解，加入去离子水定容至IL后，室温保存； 3)10% APS:lg过硫酸胺，1ml双蒸水溶解；
4)转膜缓冲液:0.5 X TBE缓冲液，将10XTBE稀释20倍；
5)马来酸缓冲液:0.15M马来酸，0.1M NaCl用ddH20溶解，调节pH至7.5 ;
6)封闭液:10Xblockingbuffer ( Roche)用马来酸缓冲液稀释至I X ；
7)洗膜缓冲液:1L马来酸缓冲液，3mlTween-20 ；
8)1X 杂交缓冲液:300mM 磷酸缓冲液(ΡΗ=8.0)，IM Nacl, 10mM EDTA_Na2，DEPC 处理水溶解；
9)检测缓冲液:0.1M Tris base, 0.1M Nacl, ρΗ9.5 ；
10)15%PAGE胶溶液(总量为12ml)按如下配方配置:
蒸懼水3.3ml
30%丙烯酰胺7.5ml
10XTBE 1.2ml
过硫酸铵(APS) 120 μ I
促凝剂四甲基二乙胺(TEMED ) 6 μ I
混匀后迅速灌胶。
[0026]3.试剂处理:
小分子RNA提取及杂交处理实验过程中涉及的所有塑料制品均经氯仿处理5min后，121 °C高压灭菌30min。玻璃、陶瓷器皿200°C干热灭菌8h ;所有相关试剂均使用DEPC处理水或者无RNA酶的双蒸水配置；
4.总RNA与小分子RNA的纯化:
提取方法按照TianGen公司的TRNzol试剂盒进行，步骤进行至加入异丙醇后，室温放置15min ；4°C 12000rpm离心10分钟，弃上清。加入400ulDEPC处理水，将沉淀溶解。总RNA 溶液用 50% PEG 8000 和 5mol/L NaCl (每 400 μ I 上清加入 50 μ I 的 50% PEG 8000 和50μ I的5mol/L NaCl)混匀，_20°C放置至少30min。4°C 12000rpm离心10分钟，弃沉淀。再重复加PEG 8000和NacL —次，取上清转移到新的管子，加入1/10体积的IM MgCl2和2.5倍体积的无水乙醇，-20°C放置至少lh。21:，15，00(^，离心301^11。弃掉液相，沉淀用75%乙醇洗2次，短暂干燥(RNA不宜完全干燥，2-3分钟即可)后溶于适量DEPC-H2O中，-70°C保存备用；
小分子RNA提取纯化结果如图2所示，图2的电泳条带中,M为2000bp的maker,条带I为来自水稻叶片中的小分子RNA，条带2为来自家鸡血液中的小分子RNA，条带3为来自小鼠肝脏的小分子RNA，从图2可以看出，在5S位置有明显的条带即富集的小分子RNA，该富集的小分子RNA为20-150bp左右的小分子RNA集合；
5.相关探针设计:
设计原理:从网站http://microrna.sanger.ac.uk查询需检测的小RNA的序列，设计成DNA形式，根据此设计反向互补的寡核苷酸，并在5’端随机增加2个寡核苷酸后，用生物素或地高辛标记，标记工作由TAKARA公司完成；
具体到本实施例，
(I)成熟小RNA的序列
0sa-miR156:UGA CAG AAG AGA GUG AGC AC
Let-7-a:UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U
(2)相应探针(*)的序列
B1-miR156*: (B1tin)-A CGT GCT CAC TCT CTT CTG TCA
Dig-miD156*: (Digoxin)-A CGT GCT CAC TCT CTT CTG TCA
B1-Let-7*: (B1tin)-ACA ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA
Dig-let7*: (Digoxin)-ACA ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA
(3)相应探针(*)根据成熟小RNA的序列设计反向互补的寡核苷酸，并在5’端随机增加2个寡核苷酸后，用生物素或地高辛标记，标记工作由TAKARA公司完成；
6.液相杂交:
200μ?无RNA酶的EP管中，加入3ug待检测小RNA，0.1pmol生物素或地高辛标记探针，
1.6ul 1X 杂交缓冲液(300mmol/L 磷酸钠溶液，3mol/L NaCl, 10mmoI/L EDTA,PH8.0),补足DEPC处理水使总体积为16 μ L ;充分混匀后，整个反应体系于95°C变性0.5 min以上(设 0.5 min、5 minUO min 三组)，迅速放入水浴锅 42°C _65°C (设 42、55°C、65°C 三组)杂交0.5 min以上(设0.5 min、30 min,60 min三组)，杂交结束之后加入2 μ I核酸外切酶I缓冲液及IU核酸外切酶I，充分混匀，37°C保温30min至lh。同时制备含IXTBE的10%-15%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，将酶切完毕的核酸杂交液全部上样，在90-11V下跑胶I小时；均能杂交成功。变性时间为0.5 min、杂交温度为42°C、杂交时间60min的实验组的结果如图3所示。
[0027]图3中，条带I为50fmol的探针阴性对照，条带2为50fmol的阳性对照，条带3为探针酶切的阴性对照，条带4、5、6分别为Iug水稻叶片、家鸡血液、小鼠肝脏的小RNA与互补探针的杂交结果，均在20bp双链位置有明显的显色带，表明杂交成功；
7.转膜及抗体结合
切下含酶切条带的凝胶，根据胶的大小裁剪6张同样大小的滤纸片及I张膜放入
0.5 X TBE中，按照从下到上3层滤纸，PAGE凝胶，膜，3层滤纸的顺序制成“三明治”型并赶走气泡，放入转膜仪中。在4°C下20V电泳I小时。核酸面朝上将膜放置在浸有转膜缓冲液的湿润的滤纸上，UV紫外交联仪下交联5-9分钟，或15-20mJ/ cm2交联后取出膜，弃掉滤纸，用洗膜缓冲液润洗膜5分钟。取出膜放入一个干净杂交管，核酸面朝上，加入1ml的I X封闭液。20°C-37°C下孵育I min以上(设I min、30 min、60 min三个实验组),弃封闭液。在1ml封闭液中加入2ul抗体，混匀后加入杂交管中，与膜一起在20°C-37°C下孵育5 min以上(设5 min、30 min、60 min三个实验组),弃掉稀释液,用洗膜缓冲液润洗膜3次，每次10分钟；
8.信号检测
O地高辛检测方法:将膜放入检测缓冲液(PH9.5)中浸泡3-5分钟后，取出膜放在一张保鲜膜上(核酸面朝上)；加入0.5ml的⑶P star，使整个膜上都浸于⑶P star中然后迅速盖上一张保鲜膜，保证保鲜膜与转印膜之间覆盖⑶P star而无气泡。室温下孵育5分钟后，用ChemiDoc XRS曝光10分钟；2)取辣根过氧化物酶检测试剂盒中的两种液体在避光条件下1:1体积比例混合。加入0.5ml的混合液，核酸面朝上，使整个膜都浸于检测混合液中，室温下避光孵育5分钟后,用ChemiDoc成像,曝光时间10分钟。
[0028]实施例2 检测灵敏度试验
本实施例以实施例1的方法为准，液相杂交时，采用不同浓度的水稻叶片中的Osa-miR156进行液相杂交固相检测,进行检测灵敏度试验,结果如图4所示，图4中条带1-15 的 Osa-miR156 浓度分别为 1.10 fmol; 2.5 fmol; 3.2.5 fmol; 4.1 fmol; 5.0.5 fmol; 6.0.25 fmol; 7.0.1 fmol; 8.0.05 fmol; 9.0.025 fmol; 10.0.01fmol; 11.0.005 fmol; 12.0.0025 fmol; 13.1 amol; 14.0.5 amol; 15.0.25amol ；
从图4可以看出，本方法最低可以检测0.005fmol的miRNA(5aM=35fg =0.035pg)，即可以清楚辨识出条带11，本方法相对以往的小RNA检测方法灵敏度提高了 10倍。
[0029]实施例3
小分子RNA定量检测试验
本实施例以水稻中的miR156为例进行定量；用一系列浓度梯度(0.8-31.2fmol)的miR156的DNA形式miD156与0.1 pmol的生物素标记探针miD156*进行杂交，显色后用Chemi Doc XRS检测系统进行相对定量分析，以杂交所用miD156的浓度为X轴，显色浓度为Y轴建立坐标曲线,结果两者呈良好的线性关系y = 34.671x + 0.231，线性回归方程中R=
0.9902。条带7为Iug水稻miRNA与0.lpmol miD156*探针杂交，结果在回归方程上，
其结果如图5所示，图5中，条带1-7的miR156浓度分别为1: 0.8fmol; 2: 1.9fmol;3: 3.9fmol; 4: 7.8fmol; 5: 15.6fmol; 6: 31.2fmol.7: lug。
【权利要求】
1.一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取、纯化待检测小分子RNA； (2)探针设计:根据待检测小分子RNA的碱基序列设计探针，所述探针用生物素或地高辛进行标记； (3)液相杂交:将所述待检测小分子RNA与所述探针在缓冲液中进行杂交，并消化掉未杂交的单链序列，然后进行凝胶电泳； (4)转膜:将电泳后的凝胶上的杂交产物转移到固相支持物上； (5)抗体孵育:将步骤(4)所得到的含有杂交产物的固相支持物与特异性抗体进行孵育杂交； (6)信号检测:检测步骤(5)所得的固相支持物上的信号。
2.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，还包括线性回归方程制作步骤:采用一系列浓度梯度的已知miRNA分别进行所述步骤(3)- (6)的操作，然后以已知miRNA的浓度为X轴，显色浓度为Y轴建立曲线坐标。
3.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，所述固相支持物为尼龙膜、纤维素膜和PVDF膜中的任何一种，优选尼龙膜。
4.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤(2)中，探针设计时，根据待检测小分子RNA的碱基序列，设计成DNA形式，根据此设计反向互补的寡核苷酸，并在5’端随机增加2个核苷酸后，再用生物素或地高辛标记。
5.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤(3)中所述凝胶为含IXTBE的10%-15%的聚丙烯酰胺凝胶；步骤(3)中，杂交反应体系于95°C变性0.5 min以上，然后在42-65°C杂交0.5 min以上。
6.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤(3)中，用核酸外切酶消化了未杂交上的多余单链；杂交缓冲液中，磷酸根浓度为0-0.5 M, Na+浓度为 0-1.5 M, EDTA 浓度为 0-0.5 M，pH 为 6.0-9.5。
7.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤(4)中，转膜时，根据凝胶的大小裁剪6张同样大小的滤纸，及I张固相支持物，按照从下到上依次为3层滤纸、凝胶、固相支持物、3层滤纸的顺序对齐摆放，然后将上述的滤纸、凝胶、固相支持物的“三明治”结构夹在两层湿润的固相支持物中间。
8.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤(5)中，先将含有杂交产物的固相支持物加入封闭液后在20-37°C下孵育I min以上，弃封闭液，然后加入稀释的抗体，在20-37°C下孵育5 min以上。
9.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤(3)中，杂交反应体系于95°C变性5 min，然后在42°C杂交Ih ;步骤(5)中，先将含有杂交产物的固相支持物加入封闭液后在37°C下孵育5 min，弃封闭液，然后加入稀释的抗体，在37°C下孵育30 min。
10.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤(6)中，采用CDP-Star检测方法或者X压片方法进行信号检测。
【文档编号】C12Q1/68GK104232772SQ201410471164
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】王胜华, 毛强, 詹诚 申请人:四川大学