一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌及其构建方法
【专利摘要】本发明提供一种操纵子 bacABC 拷贝数倍增和敲除 recA 基因的地衣芽孢杆菌DW2△ recA / bacABCs ，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6月12日。该菌株的基因组同时具有操纵子 bacABC 拷贝数倍增和敲除 recA 基因双重特性，并且，该菌株操纵子 bacABC 拷贝数倍增和敲除 recA 基因的地衣芽孢杆菌应用于杆菌肽生产中，可使杆菌肽产量提高11.5%。
CCTCC NO：M2011344
2011.10.12
CCTCC NO：M2014251
2014.06.12
【专利说明】—种操纵子1330八80拷贝数倍增和敲除「60八基因的地衣芽孢杆菌及其构建方法
【技术领域】
[0001〕 本发明涉及一种操纵子镜贝数倍增和敲除基因的地衣芽孢杆菌工程菌株。
【背景技术】
[0002]杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽拥有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。
[0003]目前，杆菌肽主要生产菌株为地衣芽孢杆菌1101261118)和枯草芽孢杆菌{83(3111118，其通过微生物发酵法生产。
[0004]杆菌肽是通过硫模板机理缩合氨基酸而成的，而操纵子…^为编码杆菌肽合成过程中三个关键酶的基因。理论上来说，操纵子&^编码的肽合成酶的增多将有利于杆菌肽的合成，根据中心法则，即0嫩的信息通过转录和翻译最终表现在蛋白质上，增加操纵子在菌体的拷贝数，从而提高的表达。但是，由于操纵子基因序列过长，约42吐，故无法构建含有如此大基因片段的质粒表达载体，也就无法以构建游离型或整合型质粒表达载体的方式来实现操纵子&拷贝数的倍增，因此，操纵子&^…^的拷贝数增加变得极为困难。另外，基因为编码细菌0嫩重组蛋白的基因，染色体上存在的同源序列在细菌0嫩重组蛋白的作用下会进行交换重组，对菌株保持拷贝数的稳定性不利。
【发明内容】
[0005]本发明旨在提供一种能够高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌及其构建方法，此地衣芽孢杆菌的基因组同时具有操纵子如拷贝数倍增和敲除基因的双重特性。
一种操纵子八80拷贝数倍增和敲除一基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽抱杆菌1)^0/1808 (简称为彻。1111)8 1101161111~01~11118 012 [/ 6^0/1808),该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号⑶了⑶勵:12014251，保藏日期为2014年6月12日。此菌株的基因组同时具有操纵子如拷贝数倍增和敲除基因双重特性，生产杆菌肽的能力强。
[0006]一种操纵子如拷贝数倍增和敲除基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤:
(1)质粒12(2) -01-！经过限制性0嫩内切酶I取8應!I /双酶切得到线性的丁2
(2)-01^1质粒，并回收线性12 (2)-01^1质粒；
(2)以地衣芽孢杆菌012的基因组0嫩为模板，分别扩增出淀粉酶终止子、启动子和如上、下游同源臂基因片段，同时，以载体？册300为模板扩增出四环素抗性基因片段，并回收淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和&^…^上、下游同源臂5个基因片段； (3)将这5个基因片段融合，得到融合0嫩片段，具体操作为:以上游同源臂和淀粉酶终止子为模板，通过8064(? (即重叠延伸？00得到第一融合片段，同时，以1^八80下游同源臂和启动子为模板，通过8064(?得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四环素抗性基因片段为模板，通过806-9(?得到融合0嫩片段，融合0嫩片段的正确排列顺序为如乂说'上游同源臂一淀粉酶终止子一四环素抗性基因一启动子一如乂说'下游同源臂；
(4)采用限制性0嫩内切酶I和及丽71对融合0嫩片段进行双酶切，得到酶切后的融合片段；
(5)将酶切后的融合片段与步骤(1)得到的线性！'2(2)-04质粒连接，得到整合质粒！'2 (2)-04-如466?，将整合质粒！'2 (2)-01-1-如466?通过电转化转入地衣芽孢杆菌012中，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经过451和卡那霉素抗性双重筛选，筛选到整合菌株，经卩⑶验证，得到具有正确排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正确排列序列为:启动子一如乂沒广开放阅读框(简称:
1)30/1800^)-1)30/180终止子一如乂沒广上游同源臂一淀粉酶终止子一四环素抗性基因一启动子一“。胤下游同源臂；
(6)采用四环素浓度梯度升高的培养基对整合菌株进行如的诱导倍增，得到^30拷贝数扩增的整合菌株；
(7)质粒12(2)-04经过限制性0嫩内切酶5^ I和5^ I双酶切得到线性的丁2(2)-01^1质粒，并回收线性12 (2)-01^1质粒；
(8)以地衣芽孢杆菌012的基因组0嫩为模板，？⑶扩增出作4同源臂，作4同源臂经过限制性0嫩内切酶5^ I和5^ I双酶切，并将酶切后的作4同源臂与步骤(7)得到的线性！'2 (2)-01^1质粒连接，得到敲除质粒12 (2)-01^1-/^4:
(9)将质粒12(2)-04-作4通过电转化转入步骤(6)得到的如乂说'拷贝数扩增的整合菌株中，经卡那霉素筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经451和卡那霉素抗性双重筛选，验证得到作4基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢杆菌
012 ^ 1-00^ /1)30^808 0
[0007]本发明的有益技术效果为:
(1)本发明的整合质粒并不含有操纵子如〃的开放阅读框，即并不能仅仅通过将整合质粒转入菌株内实现操纵子如的倍增，但是，本发明的整合质粒中含有启动子基因片段，本发明通过将此含有启动子基因片段的整合质粒转入菌株内，以启动子基因片段为同源区域，利用菌株本身的同源重组交换功能，成功得到了&阅读框倍增(即操纵子如'拷贝数倍增)的地衣芽孢杆菌菌株；
(2)本发明的融合0嫩片段中还含有四环素抗性基因片段，此四环素抗性基因片段同启动子一起整合进入菌株的基因组内，随着1^八80开放阅读框的倍增而倍增，这为1^八80拷贝数扩增的整合菌株的筛选提供了有利的条件；
(3)本发明的采用质粒12(2)-04作为载体，由于质粒12 (2)-04含有一个温敏型复制子，在371时质粒可正常复制，451质粒无法进行复制，故，它也为如拷贝数扩增的整合菌株以及地衣芽孢杆菌012 1X1-60^/^0^808的筛选提供了有利的条件；
(4)在对淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和如上、下游同源臂5个基因片段进行整合时，本 申请人:将这5个基因片段同时进行806？0？时，反复多次均得不到所需排列顺序的融合0嫩片段，为了克服此问题，本 申请人:经过无数次试验，最终确定采用分段整合(即上游同源臂与淀粉酶终止子相连，下游同源臂与启动子相连，得到的两个片段再与四环素基因片段相连)的方式，最终成功得到了所需排列顺序的融合0嫩片段；
(5)在菌株基因组中的如4沒⑶即后仅插入如'上游同源臂一四环素基因——启动子一如下游同源臂基因片段时，由于所获得的如拷贝数扩增的整合菌株基因组中如乂及刀即与下一个如乂及:0即相距过于接近，会破坏1^八80终止子区，从而对菌株的操纵子如4说'造成结构上的影响，为了克服此问题，本 申请人:在构建整合？⑶片段时，加入了淀粉酶终止子基因片段；
(6)与现有技术中的地衣芽孢杆菌012相比，本发明的菌株使菌体杆菌肽效价提高了11.5%。
[0008]进一步的，为了提高上述步骤(3)中融合0嫩片段的成功率，上述步骤(3)的中融合0嫩片段对应的806？0？体系的反应条件均为:
15111111 ；
2)第1阶段融合:
变性:951 3086。，退火:501 3086。，延伸:721 6086。，循环8次；再延伸:725111111 ；
3)第2阶段融合:
变性:951 3086。，退火:551 3086。，延伸:721 90 860 循环30次；再延伸:721 5111111 ；
4)终止:10151111110
[0009]本发明的融合0嫩片段对应的806？0？体系分2个阶段进行融合，且，第1、2阶段融合对应的退火温度分别为50、551，避免了淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和如上、下游同源臂5个基因片段在整合时，由于各个基因片段长短不一、所需退火温度不同，造成融合0嫩片段成功率低的问题。
[0010]本发明的操纵子1^八80拷贝数倍增和敲除“基因的地衣芽孢杆菌的应用，其应用于杆菌肽生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为质粒12 (2)-0^1的结构示意图，其中，图1中的1^11为卡那霉素抗性基因，^ I取8應!11分别为限制性0嫩内切酶I取細III的酶切位点；
图2为整合质粒12 (2)的结构示意图，其中，图2中的[为如'上游同源臂，八1117七6:0111的1:01'为淀粉酶终止子，161:抗性基因为四环素抗性基因片段，1380^80 ？1~011101:61'为启动子，1351(^801？为如'下游同源臂，1(5111为卡那霉素抗性基因；
图3为！'敲除质粒12 (2) -0^1-1-60/1的结构示意图,其中，图3中的为！'
同源臂，1(811为卡那霉素抗性基因，5口6 I和5^ I分别为限制性0嫩内切酶分6 I和5^I的酶切位点；
图4为酬—?:3的实时荧光定量测定结果图； 图5为现有技术中的地衣芽孢杆菌012与本发明的地衣芽孢杆菌012的杆菌肽效价对比图。
【具体实施方式】
[0012]一种操纵子1^八80拷贝数倍增和敲除作4基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽抱杆菌 012 八/'￠4/ 1)30/1808 (简称为:^3(^7705 1101161111~01~11118 012 ^ 1-60/1/—想:8 \该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号勵:12014251，保藏日期为2014年6月12日。此菌株的基因组同时具有操纵子如拷贝数倍增和敲除基因双重特性，生产杆菌肽的能力强。
[0013]一种操纵子1^八80拷贝数倍增和敲除“基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤:
(1)质粒12 (2)-01-1 (其结构示意图，如图1所示)经过限制性0嫩内切酶I和 /双酶切得到线性的12 (2)-04质粒，并回收线性12 (2)-04质粒。
[0014](2)以地衣芽孢杆菌012的基因组0嫩为模板，分别扩增出淀粉酶终止子、启动子和如上、下游同源臂基因片段，同时，以载体？册300为模板扩增出四环素抗性基因片段，并回收淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和^^…^上、下游同源臂5个基因片段；
其中，如上游同源臂的扩增引物为:
上游引物(口?-？ ): 06066^X00^6^1X6^00660^6，
下游引物⑶?-806-10:
01010160101101^1011^66^1600611116110 ；
淀粉酶终止子的扩增引物为:
上游引物(八！117-806-？):
6八織編哪?:八丁IX！'丁處八！'舰“ ?:“八6，
下游引物(八1117-806-10:
10^10600110110166^10^000606^1^00610 ；
四环素抗性基因片段的扩增引物为:
上游引物(了6七-806-？):
6^0661^106066616^100^6^6^6606^1116^,
下游引物(了61^-806-10:
启动子的扩增引物为:
上游引物(1^510-806-17):
6^1001111111^1^0^660^00166^01^16^6^,
下游引物(1^510-806-10:
0^^660^00016^^61101^10^1100011106 ；
如下游同源臂的扩增引物为:
上游引物(00顆-806-5):
06^666^16^1^6^011110^666160011116,
下游引物(00顆-1？): 01^6101^0010^60^16601116^1。
[0015]所述的的扩增体系均为:
811 打 61~: 5111 ；^1？: 2.5111: 0.591；引物 1: 1口1；弓丨物 2:
1“；0嫩:仏。水:14^匕引物1和引物2为分别对应为待扩增基因片段的上、下游引物。
[0016]所述的的扩增条件均为:
15111111
2)^^:9513086。，退火:55。0 3086。，延伸:72。0 60 860 循环30次
3)再延伸:7215111111
4)终止:10151111110
[0017](3)将这5个基因片段融合，得到融合0嫩片段，具体操作为:以上游同源臂和淀粉酶终止子为模板，通过8064(? (即重叠延伸？00得到第一融合片段，同时，以如下游同源臂和启动子为模板，通过8064(?得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四环素抗性基因片段为模板，通过806-？0？得到融合0嫩片段，融合0嫩片段的正确排列顺序为:如^…^上游同源臂一淀粉酶终止子一四环素抗性基因一启动子一如4及^下游同源臂；
其中，第一融合片段的扩增引物为:
诎-？: 06066^X00^6^1X6^00660^6，
八III又一806—尺:
10^10600110110166^10^000606^1^00610 ；
第二融合片段的扩增引物为:
？1380~806~？:
00顆-1？: 01^6101^0010^60^16601116^1 ；
融合0嫩片段的扩增引物为:
诎-？: 06066^X00^6^1X6^00660^6，
00顆-1？: 01^6101^0010^60^16601116^1。
[0018]所述的第一、二融合片段对应的806？^？的扩增条件均为:
15111111 ；
2)^^:9513086。，退火:50。0 3086。，延伸:72。0 60860 循环8次；
3)再延伸:7215111111 ；
4)终止:10151111110
[0019]所述的融合0嫩片段对应的806？0？的扩增条件为:
15111111 ；
2)第1阶段融合:
变性:951 3086。，退火:501 3086。，延伸:721 6086。，循环8次；再延伸:725111111 ；
3)第2阶段融合: 变性:951 3086。，退火:551 3086。，延伸:721 90 860 循环30次；再延伸:721 5111111 ；
4)终止:101 51111110
[0020](4)采用限制性0嫩内切酶I和及丽71对融合0嫩片段进行双酶切，得到酶切后的融合片段；
其中，X如I取8遞III双酶切体系为:
加 1:3^11
3311111 I:3 9 1
10X1: 6 卩 I
0嫩片段或质粒:0嫩片段40 0 I或者质粒20 0 I
水:补水至总体积60 0 I ；
I取細III双酶切条件为:371，8小时尬3 I和及丽71均为限制性0嫩内切酶，10X1 1x1打61~为配套的限制性内切酶缓冲液。尬3 I和及丽71以及10X1 1x1打61'均购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0021](5)将酶切后的融合片段与步骤(1)得到的线性12 (2)-04质粒连接，得到整合质粒12 (2) -01-1-^^6? (其结构示意图，如图2所示)，将整合质粒12 (2)-01-1-^808通过电转化转入地衣芽孢杆菌012中，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经过451和卡那霉素抗性双重筛选，筛选到整合菌株，经验证，得到具有正确排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正确排列序列为:启动子一如4说' 开放阅读框(简称一如4说'终止子一如4说'上游同源臂一淀粉酶终止子一四环素抗性基因一启动子一&^下游同源臂；此步骤中所涉及到的酶切后融合片段与线性！'2 (2)-04质粒的连接、整合质粒！'2 (2)-04-如466?转入地衣芽孢杆菌012、卡那霉素筛选的【具体实施方式】均为本领域的公知常识，在此不做赘述。
[0022]45和卡那霉素抗性双重筛的具体操作为:
1)将实施例2所得菌株012(12 (2)混合接种于501液体⑶培养基中，451振荡培养12卜，再转接与51111液体18培养基中，451振荡培养12卜；取上述菌液进行稀释，然后涂布与固体⑶平板上，371培养16匕使其长出单菌落；
2)将上述单菌落用无菌牙签挑起，分别点种到卡纳霉素抗性平板和⑶平板上的对应位置，371培养1611 ；
3)挑取在18平板上生长，而在卡纳霉素抗性平板上不生长的菌落，然后以引物:
验-汉:06^116110^1066^606,进行？邙验证。
[0023]反应条件为:
①预变性:95。。10111111；
②变性:95130 86。，退火:551 50 86。，延伸:721 4 111111,
30个循环；
③再延伸:72。〇10111111 ；
能扩增出4.5^左右条带的菌落即为大片段整合成功的菌株，即具有正确排列序列的整合菌株，命名为地衣芽孢杆菌谓
[0024](6)采用四环素浓度梯度升高的培养基对整合菌株进行1^八80的诱导倍增，得到如'拷贝数扩增的整合菌株。例如，如'开放阅读框的拷贝数增加1次，所对应的整合菌株的染色体排序为:启动子一6%仙⑶册一如乂见终止子一如乂沒广上游同源臂一淀粉酶终止子一四环素抗性基因一启动子一仙⑶取一仙0终止子一如乂沒广上游同源臂一淀粉酶终止子一四环素抗性基因一启动子一下游同源臂；
具体步骤为:将上述整合菌株单菌落接至5此18 (含有201^/此四环素)培养基中，371,180 1-/111111振荡培养12 11后，取100 111菌液转接至5齓[8(含有301111四环素)培养基中继续培养，重复上述步骤，每次转接时增加四环素的浓度10直至四环素浓度为80时结束诱导倍增操作，并以诱导后的菌株基因组为模板，使用实时荧光定量？(? (简称驴00确定其拷贝数(如图4所示),如拷贝数增加的菌株命名为谓2細。就3,从图4可知，实时荧光定量测定的— 就拷贝数相对定量值(即)为5，而现有技术中的地衣芽孢杆菌012仅为1，即，相对于地衣芽孢杆菌012来说，此菌株徽的基因组中如4说'开放阅读框的拷贝数增加了 4次。
[0025]其中，驴⑶的扩增引物为:
8八0町-？: 00X60X^6066^6^0、
8 八 01^-1？: 1^000601X60X^000、
I 尺-町-？: 160^1^00116000^1001、
I尺-尺I'-尺:101100116010^1660610 ；
驴⑶的反应体系为:
引物？+尺0.5 9 1、
模板0嫩1 1^ 1?
水3.5卩I ；
驴⑶反应条件:
15111111，
2)^^:951 20 86。，退火:58。0 15 86。，延伸:72。0 30 86。，
40个循环；
驴⑶反应中使用的I叫1111x^111-6来自英潍捷基(上海)贸易有限公司的3181？ 821201嫩312 1?试剂盒，反应的进行与结果的检测分析使用的是八81 96孔实时荧光定量？⑶仪。
[0026](7)质粒丁2 (2) -01*1经过限制性0應内切酶5口6 I和5狀I双酶切得到线性的12 (2)-04质粒，并回收线性！'2 (2)-04质粒；其酶切体系和酶切条件均与步骤(4)相同，X如I取8應！II也是限制性0嫩内切酶，X如I取8應！II均购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0027](8)以地衣芽孢杆菌012的基因组0應为模板，扩增出八^同源臂，八^同源臂经过限制性0嫩内切酶分6 I和5^ I双酶切，并将酶切后的八同源臂与步骤(7)得到的线性12 (2)-0^1质粒连接，得到敲除质粒12 (2)-01-1-/-^ (其结构示意图，如图3所示)；
其中，作4同源臂的扩增引物为: 上游引物(尺6。八-？ ): 66^0X^6X0X600^X^0660X600^X01 下游引物(06(^-10:006^60X0X6X006000X60X601 ；
酶切后的同源臂与步骤(7)得到的线性！'2 (2)-01^1质粒的具体连接步骤均为本领域的公知常识，在此不做赘述。
[0028](9)将质粒12 (2) -01-1- /'通过电转化转入步骤(6)得到的如4说'拷贝数扩增的整合菌株中，经卡那霉素筛选，得到具有卡那霉素抗性的转化子，转化子再经451和卡那霉素抗性双重筛选，验证得到基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢杆菌012八/'地衣芽抱杆菌012八/'的染色体排序为:/'部分基因一作4同源臂一 12 (2) —1-00/1同源臂一剩余的作4部分基因(其中，12(2)指！'2
(2)-01-1- 除/'同源臂外的其余部分基因),从而致使/'基因插入失活。
[0029]其中，质粒12 (2)-0^1-/^4转入步骤(6)得到的如'拷贝数扩增的整合菌株中的【具体实施方式】为本领域的公知常识，筛选具有卡那霉素抗性的转化子，抽提质粒，利用下述引物:
12-1:^1616^1^01066061^,
丁2-1？:60^60^60^11^060,进行？邙扩增验证。
[0030]？邙反应条件:
1)预变性:95。。，5111111 ；
2)^^:95130 86。，退火:55。0 50 86。，延伸:72。0 45 86。，
30个循环；
3)再延伸:72。。，10―。
[0031]选取能扩增出75恥左右条带的菌株，命名为地衣芽孢杆菌(12
(2))[简称 ^3乂7?5 1101161111~01~11118 ^2/1)30/1808 (12 (2)-011-/^4)%
[0032]按照步骤(5)中451和卡那霉素抗性双重筛的具体操作的步骤
1)4^3)中的方法进行培养，挑取在⑶平板上生长，而在卡纳霉素抗性平板上不生长的菌落，然后以引物:
1-60/1 验-？:10160661606^606,
1-60/1 验-1？:006^60X0X6X006000X60X601,进行？邙验证。
[0033]？邙反应条件:
1 10111111 ；
2)^^:95130 86。，退火:55。0 50 86。，延伸:72。0 45 86。，
30个循环；
3)再延伸:72。〇10 111111 ；
能扩增出770恥左右条带的菌落即为基因成功敲除的菌株，命名为地衣芽孢杆菌而2 八/'{830111118 110116111 ^01~11118 012 ^ 1-00^/1)30^808 ) 0
[0034]当然，本发明的构建方法中步骤(3)的融合0嫩片段所对应的806？0？也可采用单段融合和单一退火温度的方式来进行，但是，得到正确排列序列的融合0嫩片段的时间较长，成功率较低。
[0035]本发明所涉及到的0嫩回收均采用上海赛百盛基因技术有限公司生产的？⑶产物纯化及胶回收试剂盒(树脂型)进行回收。
[0036]所述的地衣芽孢杆菌012(简称:也?^77^5 110)16111 ￡01-11118 012),该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号勵:12011344，保藏日期为2011年10月12日。
[0037]本发明的操纵子拷贝数倍增和敲除“基因的地衣芽孢杆菌的应用，其应用于杆菌肽生产。
[0038]衣芽孢杆菌012 ^60^^808在杆菌肽发酵中的应用步骤包括:八菌种活化，8摇瓶发酵。
[0039]所述步骤八菌种活化的菌种活化培养基配方为(8/1):酵母粉0.5%，蛋白胨1%，^01 1%，邱 7.0-7.4。
[0040]所述步骤八菌种活化的培养条件为从甘油管以体积百分比1%接种于装有5“液体18培养基的？八瓶中，180?300卬III，37。。，10?1处。
[0041]所述步骤8摇瓶发酵的发酵培养基配方为(8/1):豆柏100、玉米淀粉45、0^036.0、(^?) 2804 1.0。
[0042]所述步骤8发酵培养基的培养条件为250此三角瓶发酵培养基的装液量为20III[，将经步骤八菌种活化后的菌液以体积百分比2%接种后180培养48匕。采用高效液相色谱法测定发酵液杆菌肽效价(如图5所示),从图5可看出，地衣芽孢杆菌012相对应的杆菌肽效价为935[，本发明的地衣芽孢杆菌012 ^ ^60^^808对应的杆菌肽效价为1013口，即，相对于现有技术的地衣芽孢杆菌012来说，本发明的地衣芽孢杆菌012 1^1-60^3^808经发酵后的杆菌肽效价提高了 11.5%。
【权利要求】
1.一种操纵子如拷贝数倍增和敲除red基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2 ArecA/如MSCs，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2014251，保藏日期为2014年6月12日。
2.—种权利要求1所述的一种操纵子如拷贝数倍增和敲除red基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤: (1)质粒T2(2)-ori经过限制性DNA内切酶油a I和J双酶切得到线性的T2(2)-ori质粒，并回收线性T2 (2)-ori质粒； (2)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增出淀粉酶终止子、启动子和如上、下游同源臂基因片段，同时，以载体pHY300为模板扩增出四环素抗性基因片段，并回收淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和如上、下游同源臂5个基因片段； (3)将这5个基因片段融合，得到融合DNA片段，具体操作为:以如上游同源臂和淀粉酶终止子为模板，通过soe-PCR (即重叠延伸PCR)得到第一融合片段，同时，以bacABC下游同源臂和启动子为模板，通过soe-PCR得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四环素抗性基因片段为模板，通过soe-PCR得到融合DNA片段，融合DNA片段的正确排列顺序为如Ml上游同源臂一淀粉酶终止子一四环素抗性基因一启动子一如Ml下游同源臂； (4)采用限制性DNA内切酶油aI取BernH I对融合DNA片段进行双酶切，得到酶切后的融合片段； (5)将酶切后的融合片段与步骤(1)得到的线性T2(2)-ori质粒连接，得到整合质粒T2 (2)-or1-如，将整合质粒T2 (2)-or1-如通过电转化转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经过45°C和卡那霉素抗性双重筛选，筛选到整合菌株，经PCR验证，得到具有正确排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正确排列序列为:启动子一如MAC开放阅读框一如MAC终止子一如上游同源臂一淀粉酶终止子一四环素抗性基因一启动子一如下游同源臂； (6)采用四环素浓度梯度升高的培养基对整合菌株进行如的诱导倍增，得到bacABC拷贝数扩增的整合菌株； (7)质粒T2(2)-ori经过限制性DNA内切酶I和fee I双酶切得到线性的T2(2)-ori质粒，并回收线性T2 (2)-ori质粒； (8)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出red同源臂，red同源臂经过限制性DNA内切酶分e I和fee I双酶切，并将酶切后的red同源臂与步骤(7)得到的线性T2 (2)-ori质粒连接，得到red敲除质粒T2 (2) ~ori~recA ； (9)将质粒T2(2) -or1- red通过电转化转入步骤(6)得到的如d说'拷贝数扩增的整合菌株中，经卡那霉素筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经45°C和卡那霉素抗性双重筛选，PCR验证得到red基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢杆菌DW2 Δ recA /bacABCs 0
3.根据权利要求2所述的一种操纵子如拷贝数倍增和敲除red基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，其特征在于:步骤(3)的中融合DNA片段对应的soePCR体系的反应条件均为: 1)预变性:95°C5min ； 2)第I阶段融合: 变性:95°C 30sec，退火:50°C 30sec，延伸:72 °C 60sec，循环 8 次；再延伸:72 °C5min ； 3)第2阶段融合: 变性:95°C 30sec，退火:55°C 30sec，延伸:72°C 90 sec 循环30次；再延伸:72°C 5min ； 4)终止:10°C5min。
4.根据权利要求1所述的一种操纵子如拷贝数倍增和敲除red基因的地衣芽孢杆菌菌株，其特征在于:其应用于杆菌肽生产中。
【文档编号】C12N1/21GK104293723SQ201410480828
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】陈守文, 彭炳, 王冬, 李阳, 祁高富, 孔素芬, 陈惠超, 陈晓斌 申请人:绿康生化股份有限公司