塔尖四面体dna纳米结构探针及端粒酶电化学检测的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针(STTS)及其制备方法和在电化学检测端粒酶活性中的应用。本发明所述的STTS由单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C、单链探针D和单链探针SC-DNA组成。本发明还公开了所述STTS电化学检测端粒酶活性的方法及其在检测细胞中端粒酶活性的应用。采用STTS电化学检测端粒酶活性的方法，检测的信号信噪比高于普通TSP检测2倍以上，灵敏度高，特异性强，应用范围广。
【专利说明】塔尖四面体DNA纳米结构探针及端粒酶电化学检测
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针及其制备方法和在电化 学检测端粒酶活性中的应用。
【背景技术】
[0002] 端粒是一段位于真核细胞内染色体末端的DNA重复片断，它可维持染色体的稳定 性和完整性。端粒由端粒DNA和端粒相关蛋白组成，是位于真核细胞染色体末端的特殊结 构。端粒酶是由RNA亚基（human telomerase RNA，hTR)和具有逆转录酶活性的端粒酶催 化亚基（human telomerase reverse transcriptase，hTERT)及端粒酶相关蛋白（telomere associated protein,TEP)三部分组成的蛋白质复合物。端粒酶是一种逆转录酶,它以自身 的RNA为模板特异性地合成染色体3'末端端粒DNA重复序列，以延长端粒长度，填补复制 过程中新合成链5'端留下的缺口，弥补了 DNA聚合酶不能从头合成线性DNA-5'端留下的 缺隙，从而使DNA的末端完整复制。端粒酶的功能王要在于维持端粒的长度和稳定性。除 此之外，端粒酶在防止染色体相互融合、重组及一些连接酶、外切酶和其它DNA损伤因子方 面起到重要作用。
[0003] 端粒酶在细胞衰老过程中的作用主要有两个方面：一方面，由于大多数正常的人 体细胞中都没有端粒酶活性，因此，端粒的长度将随着细胞的分裂逐渐缩短，使得细胞最终 走向衰老；另一方面，当端粒酶被激活，可以阻止端粒进一步缩短，增加细胞的传代次数。端 粒酶的表达会间接影响细胞的衰老，直接影响细胞走向衰老的是端粒长度的缩短。研究发 现，85%?95%的肿瘤细胞中都可以检测到端粒酶活性，如乳腺癌，结肠癌，淋巴癌，肺癌， 卵巢癌，急性白血病等等，都可以检测到端粒酶活性。于是，人们就将端粒酶作为一种判断 肿瘤细胞的标识物。
[0004] 端粒重复扩增法（TRAP)是目前测定端粒酶活性主要方法，该方法是由Kim等于 1994年建立的。TRAP的反应原理是在同一反应体系中，分别由端粒酶和Taq DNA聚合酶 介导两步反应：第一步为引物片段的延伸反应：TS引物的3'末端在端粒酶作用下，延伸数 目不等的端粒重复序列TTAGGG ;第二步为端粒重复序列的PCR扩增：以TS和CX为一对引 物，通过PCR扩增端粒酶合成的端粒DNA，放大信号，使得检测灵敏度大大提高。TRAP方法 使得所需标本大大减少至微少，敏感性提高IO 3倍以上，可检出10个以下的细胞，适合于 大量检测。该方法的建立使得成批、稳定、快速分析组织的端粒酶活性成为可能，极大地 促进了端粒和端粒酶的研究。由于TRAP方法存在一些缺点，为了降低和避免该方法的不 足，人们对其进行了改进：1)加内对照的TRAP法；2)端粒酶重复序列扩增-闪烁亲近法 (TRAP-SPA) ;3) TRAP-银染法；4)荧光素标记的端粒酶重复序列扩增法；5) TRAP-ELISA法； 6)杂交保护法（Hybridization protection assay, ΗΡΑ) ;7)转录介导的扩增/杂交保护 法（Transcription-mediated amplification and hybridization protection assay,TM/ HPA) ;8)实时定量荧光PCR法等。
[0005] 尽管TRAP方法已应用于端粒酶活性检测，但其耗时长和抗细胞杂质干扰力差 以及试剂仪器昂贵等缺点仍困扰研究人员。目前，检测端粒酶活性还有一些非PCR方 法，例如比色法、荧光法、化学发光法、表面等离子体共振法、石英晶体微量天平法和电化 学法等。其中，电化学传感器被认为是最有希望实现床边检测（P〇int-〇f-care tests, POCTs)的器件，目前已经有一些廉价而且小体积的电化学检测器存在（如基于电化学 原理的家用血糖仪）（Nat. Protoc.，2007. 2,2888-2895 ;Nature Chemistry，2011. 3， 697-703)。目前已报道的电化学传感器检测端粒酶方法是基于G-rich tetraplex DNA binder (Anal.Chem. ,2005. 77(22):7304-7309. ), bio-barcode(Biosens. Bioelectron., 2010,25(11):2543-2547) , alkaline phosphatase label(Biosens. Bioelectron., 2004,20(5):1011-1021)和 guanine oxidation signals(Anal.Chem.,2007， 79 (22) : 8807-8811.)等方法。但是电化学DNA传感器的灵敏度常常由于异相电极表面的传 质过程减慢和表面拥挤效应的影响使探针分子与目标DNA或RNA分子之间很难接触而受限 制，需要进行电活性标记或操作步骤比较复杂，并且灵敏度都不高。因此，在通常的端粒酶 检测实验中很难控制TS primer的方向和密度，端粒酶的活性也常因为表面拥挤效应而降 低。
[0006] DNA 三维纳米结构 DNA tetrahedral-structured probe (TSP)，其具有与金电极 相连的三个巯基基底顶点和一个悬垂的捕获探针顶点。研究发现，应用TSP结构的电化学 传感器在检测可卡因（Anal. Chem.，2011，83 (19) :7418-7423.)和 microRNA (Anal. Chem.， 2014,86(5) :2285-2288.)时能较好的解决表面拥挤效应等问题。
【发明内容】
[0007] 本发明解决的技术问题是克服现有端粒酶检测试验中灵敏度低、端粒酶活性因表 面拥挤效应而降低的缺陷，提供一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针及其制备方法，大 幅提高端粒酶检测的信噪比和灵敏度，并具有更广的细胞数检测范围。
[0008] 本发明提供一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针，包括DNA四面体基座、所 述DNA四面体基座的顶点的DNA双链"塔尖"和端粒酶引物序列；其中，所述双链塔尖四 面体DNA纳米结构探针由单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C、单链探针D和单链探 针SC-DNA组成；所述DNA四面体基座由所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和 单链探针D组成；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D都含有三 个结构域，且每个所述结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补；所述单链探针 STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D分别围绕一圈形成所述DNA四面体基座的一 个面，并在所述DNA四面体基座的顶点处有两个非互补的起弯折作用的碱基；所述单链探 针STTS-A的3'端还依次含有结构域A和结构域B ;所述结构域A为端粒酶引物序列；所述 结构域B与所述单链探针SC-DNA互补形成所述的DNA双链"塔尖"。
[0009] 较佳地，所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的每个所述 结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补。
[0010] 较佳地，所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的核苷酸序 列如序列表中 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 所示。
[0011] 较佳地，所述端粒酶引物序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 8所示。
[0012] 较佳地，所述链探针SC-DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 7所示。
[0013] 本发明提供一种利用所述双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测端粒酶活性的 检测方法，所述的方法包括以下的步骤：
[0014] (1)、通过DNA纳米自组装技术的一步法合成方法制得DNA四面体基座；所述的一 步法合成方法是将所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D配制成探针 溶液，在93?97°C加热8?12min后，冷却至2?5°C持续30min以上而得所述DNA四面 体基座；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D都含有三个结构域，且 每个所述结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补；所述单链探针STTS-A、单链 探针B、单链探针C和单链探针D分别围绕一圈形成所述DNA四面体基座的一个面，并在所 述DNA四面体基座的顶点处有两个非互补的起弯折作用的碱基；所述单链探针STTS-A的 3'端还依次含有结构域A和结构域B ;所述结构域A为端粒酶引物序列；所述结构域B与所 述单链探针SC-DNA互补形成所述的DNA双链"塔尖"；
[0015] (2)、在电化学装置的工作电极的表面添加步骤（1)所得的DNA四面体基座，使所 述DNA四面体基座的三个顶点自组装连接到所述的工作电极的表面，另一个顶点延伸出端 粒酶引物序列，得到表面组装DNA四面体基座的工作电极；
[0016] (3)、将所述单链探针SC-DNA添加在步骤⑵所得的工作电极上，90?96°C加热 8?12min，迅速降温到2?5°C，持续30min以上后，即获得表面修饰有所述双链塔尖四面 体DNA纳米结构探针的工作电极；
[0017] (4)、将待检测端粒酶样本溶液与端粒酶延伸反应溶液混合，添加到步骤（3)所得 的工作电极的表面，进行端粒酶延伸反应，获得延伸产物；所述的端粒酶延伸反应溶液包含 带基团A修饰的dATP ;
[0018] (5)、加入基团B修饰的氧化还原酶，所述基团B能够与步骤（4)所述的基团A特 异性结合，从而使所述的氧化还原酶连接于步骤（4)所述的延伸产物上；
[0019] (6)、加入步骤（5)所述氧化还原酶催化的反应所需的底物，经所述氧化还原酶催 化，产生电化学氧化还原信号，进行电化学检测分析。
[0020] 本发明步骤（1)为：通过DNA纳米自组装技术的一步法合成方法制得DNA四面体 基座；所述的一步法合成方法是将所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探 针D配制成探针溶液，在93?97°C加热8?12min后，冷却至2?5°C持续30min以上而 得所述DNA四面体基座；
[0021] 其中，DNA四面体基座的一步法合成方法为本领域常规的方法，较佳地，所述一步 法合成通过以下步骤实现：取所述1 μ M单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探 针D的溶液各1 μ L以及500mM的三（2-羧乙基）膦（TCEP) IL和45 μ L TM缓冲溶液B混 合均匀，然后95°C加热lOmin，迅速降温到4°C，4°C持续30min以上，即得终浓度为IM的所 述DNA四面体基座；所述TM缓冲溶液B包括20mM Tris，50mM MgCl2，调节至pH8. 0。所述 步骤（1)中单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D用本领域常规的缓冲液 配制；较佳地，所述步骤（1)中单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D用 含有0. IM?0. 2M NaCl的缓冲液配制；更佳地，使用TE缓冲溶液（IOmM Tris，ImM EDTA， pH8. 0)配制。所述步骤（1)中单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的摩 尔浓度比为本领域常规的摩尔浓度比，较佳地，所述步骤（1)中单链探针STTS-A、单链探针 B、单链探针C和单链探针D的摩尔浓度比为1: 1: 1:1 ;更佳地，所述单链探针STTS-A、单链 探针B、单链探针C和单链探针D的浓度都为1M。所述步骤（1)中一步法合成的加热和降 温的条件为本领域常规的条件，较佳地，所述步骤（1)中一步法合成使用控温仪控制95°C 加热lOmin，迅速降温到4°C，持续30min以上；更佳地，所述的一步法合成TSP探针使用PCR 仪。
[0022] 本发明步骤（2)为：在电化学装置的工作电极的表面添加步骤（1)所得的DNA四 面体基座，使所述DNA四面体基座的三个顶点自组装连接到所述的工作电极的表面，另一 个顶点延伸出端粒酶引物序列，得到表面组装DNA四面体基座的工作电极；
[0023] 其中：步骤（2)中所述的电化学装置为本领域常规的电化学装置，较佳地，电化学 装置是金传感器芯片（SC1000-16X，GENE fluidics)的金电极。步骤（2)中所述的电化学 装置与所述的DNA四面体结构探针的连接的方法和条件为本领域常规，较佳地，步骤（2)中 所述的DNA四面体结构探针的三个顶点连接到所述电化学装置的工作电极表面，可以通过 共价自组装连接；更佳地，使用所述DNA四面体探针的三个顶点的巯基和金通过金硫键连 接。较佳地，步骤（2)中，将3 μ L的1 μ M含所述DNA四面体基座的溶液滴加到金电极表 面15 °C?35 °C条件下反应过夜。
[0024] 本发明步骤（4)为：将待检测端粒酶样本溶液与端粒酶延伸反应溶液混合，添加 至IJ步骤⑶所得的工作电极的表面，进行端粒酶延伸反应，获得延伸产物；所述的端粒酶延 伸反应溶液包含带基团A修饰的dATP ;
[0025] 其中，步骤（4)中所述待检测端粒酶样本溶液的端粒酶来源于本领域常规的细 胞，较佳地，来自于干细胞和/或癌细胞。所述待测端粒酶样本溶液的配制方法为本领域 常规的配制方法，较佳地，为如下的步骤：收集并计数1.0X IO1?1.0X IO6个待测细胞， 用胰蛋白酶消化4?6min，使其从培养基基底上脱落，再将待测细胞转移至离心管中，用 PBS(10mM PB，0.3M NaCl，ρΗ7·4)洗涤，1200 ?1800rpm，4°C离心 2 ?4min，小心弃去上层 清液，然后加入 CHAPS 裂解液（0· 5% CHAPS，IOmM Tris-HCl，ρΗ7· 5, ImM MgCl2, ImM EGTA， 5mM β -巯基乙醇，0. ImM PMSF，10%丙三醇），在冰浴上孵育25?35min，其间用移液枪反复 抽取，然后离心，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置于液氮中冷却，储存于_80°C冰 箱中备用，每次实验根据实验要求，计数不同数量的细胞进行端粒酶提取获得相应浓度值 的端粒酶提取液；更佳地，首先，计数并收集I. 〇 X IO6个待测细胞，用胰蛋白酶消化5min， 使其从基底上脱落，再将待测细胞转移至I. 5mL的离心管中，用PBS (IOmM PBS，0. 3M NaCl， pH7. 4)洗涤三次，用1500rpm，4°C离心3min，小心弃去上层清液，然后加入200μ LCHAPS裂 解液（0· 5% CHAPS，IOmM Tris-HCl，ρΗ7· 5, ImM MgCl2, ImM EGTA，5mMP -巯基乙醇，0· ImM 卩10^10%丙三醇），在冰浴上孵育3〇1^11，其间用移液枪反复抽取三次，然后用12000印111， 4°C离心20min，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置于液氮中冷却，储存于-80°C冰 箱中备用。步骤（4)中所述端粒酶延伸反应溶液为本领域常规的端粒酶延伸反应溶液；较 佳地,所述端粒酶延伸反应溶液包括20mM Tris-HCl，pH8. 3，1.5mM MgCl2，lmM EGTA，63mM KC1,0. 05% Tween20,0. 2mM biotin-dATP, 0. 2mM dGTP,0. 2mM dTTP〇
[0026] 步骤（4)中所述端粒酶延伸反应的延伸时间为本领域常规的时间，较佳地，为2? 3小时；更佳地，为3小时。对于应用STTS电化学检测端粒酶活性，端粒酶延伸反应3小时 是实验摸索得到的最佳的端粒酶延伸反应时间：一般来说，如端粒酶延伸反应时间太短则 不能反应充分，如太长则浪费检测时间降低工作效率，因为反应后期扩增信号饱和，不再增 长。步骤（4)中所述端粒酶延伸反应的温度为本领域常规的温度，较佳地，为28°C?35°C; 更佳地，为30°C。步骤（4)中所述端粒酶延伸反应后为本领域常规的反应后处理，较佳地， 电极用〇. OlM PBS冲洗，更佳地，电极冲洗后用惰性气体吹干；最佳地，所述惰性气体为氮 气。步骤（4)中将所述的基团A为本领域常规的可以特异性结合的基团，较佳地，步骤（4) 中所述的基团A为地高辛或生物素。步骤（4)待检测端粒酶样本溶液的端粒酶的来源为本 领域常规，较佳地，是从正常细胞、干细胞和/或癌细胞中提取而得。
[0027] 本发明步骤（5)为：加入基团B修饰的氧化还原酶，所述基团B能够与步骤（4)所 述的基团A特异性结合，从而使所述的氧化还原酶连接于步骤（4)所述的延伸产物上；
[0028] 其中：步骤（5)中所述的基团B为本领域常规的可以特异性结合的基团，较佳地， 步骤（5)中所述的基团B为抗地高辛分子或抗生物素分子。步骤（5)中所述的氧化还原酶 为本领域常规的氧化还原酶，较佳地，步骤（5)中所述氧化还原反应酶选自辣根过氧化物 酶、葡萄糖氧化酶的一种或多种，但不限于此；更佳地，是抗生物素蛋白（avidin)修饰的辣 根过氧化物酶（avidin-HRP)。
[0029] 本发明步骤（6)为：加入步骤（5)所述基团B-氧化还原酶催化的反应所需的底 物，经所述基团B-氧化还原酶催化，进行电化学检测分析；
[0030] 其中：步骤￠)中所述加入反应所需的底物为本领域常规的底物，较佳地，为3， 3'，5, 5'-四甲基联苯胺（TMB)、2, 2-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（ABTS)、变色酸 2R(CT2R)或双氧水的任一种，但不限于此。步骤（6)中所述基团B-氧化还原酶为本领域常 规的氧化还原酶，较佳地，是抗生物素蛋白修饰的辣根过氧化物酶。步骤（6)中所述的电化 学检测分析为本领域常规的电化学检测分析方法，较佳的是使用TMB作为底物进行检测。
[0031] 采用所述的方法进行电化学检测后，根据测得的电流的值的大小，可以根据所述 待测端粒酶阳性细胞的电流曲线图，拟合出曲线相应的阳性细胞数目与电流大小值之间的 数学公式（公式电流I-细胞数目N)，一般而言，待测样品中端粒酶阳性细胞数目N越大， 所含有的端粒酶的活性越大，相应的，测得的电流的值越大。因此对于电化学生物传感器而 言，只要确定了电信号与细胞数之间的关系，就可以通过电信号来确定出待测样本中端粒 酶活性的大小（Anal. Chem. 2005. 77(22) :7304-7309 ;Biosens. Bioelectron. 2010. 25(11) :2543-2547 ；Biosens. Bioelectron.2004.20 (5):1011-1021.)〇
[0032] 较佳地，在所述步骤（1)?（6)的任意一步完成后，可以用洗液洗去反应体系中的 游离物，所述的洗液为〇. IM?0. 2M NaCl的低盐浓度的洗液，更佳地，所述的洗液为0. OlM PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HP04,2mM ΚΗ2Ρ04，ρΗ7·4);较佳的，所述洗液的洗涤方 式是直接持续冲洗10?20s。
[0033] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0034] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0035] 本发明的积极进步效果在于：1.双链塔尖四面体DNA纳米结构探针（STTS)，无需 其他辅助分子（如巯基己醇等）维持DNA探针在界面上的形态、取向。抗蛋白质吸附表面， 既可以抵抗非特异性吸附，又非常适合用于酶放大检测体系，提高了生物传感器的性能。 2.采用STTS电化学检测端粒酶活性的方法，检测的信号信噪比高于普通TSP检测2倍以 上。3.采用STTS方法，灵敏度高，计算得到的最低检出限低于10个Hela细胞的端粒酶活 性。4.采用STTS电化学检测端粒酶活性的方法，检测动态范围广泛，可以横跨4个数量级 (10?10000)可以满足不同要求的端粒酶活性检测。5.采用STTS电化学检测端粒酶活 性的方法，检测实用性强，应用范围广，可以检测多种癌细胞和干细胞等端粒酶活性高的细 胞，也可以检测正常的端粒酶活性低的细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针的构建及其电化学检测端粒酶活性的流 程图。
[0037] 图2为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针、没有四面体结构的单链三维DNA纳米 结构探针和普通四面体结构的三维DNA纳米结构探针检测端粒酶活性电流信号对比图。
[0038] 图3为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测Hela细胞的端粒酶延伸反应中不 同延伸时间的电流信号图。
[0039] 图4为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测不同数量的Hela细胞的端粒酶活 性的时间-电流（i_t)曲线图和检测数目的工作曲线。
[0040] 图5为双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测癌细胞、干细胞和正常细胞端粒酶 活性的电流信号图。
【具体实施方式】
[0041] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0042] 实施例中所述的室温指常规的操作间的温度，一般为15?30°C。
[0043] 实施例1
[0044] 1双链塔尖四面体DNA纳米结构探针（STTS)、没有四面体结构的单链DNA探针 (ssP)和普通四面体结构的三维DNA纳米结构探针（TSP)的构建。
[0045] 实验材料：
[0046] STTS :STTS-A(93bp，分子量 28012. 0, ssDNA)、TSP-B (55bp，分子量 17018. 0, 5' 端 修饰巯基ssDNA)、TSP-C (55bp，分子量16898. 0, 5'端修饰巯基ssDNA)和TSP-D (55bp，分子 量 16877.0, 5' 端修饰疏基 ssDNA)和互补链 Spire-Complementary DNA (SC_DNA，20bp，分子 量 6176. 0, ssDNA)，核苷酸序列分别如序列表中 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、 SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 所示。
[0047] ssP :即ss_primer(28bp，分子量8449. 0,5'端修饰巯基ssDNA)，核苷酸序列如序 列表中SEQ ID No. 2所示。
[0048] TSP :TSP-A(83bp，分子量 25074. 0, ssDNA)、TSP-B (55bp，分子量 17018. 0, 5' 端修 饰巯基ssDNA)、TSP-C (55bp，分子量16898. 0, 5'端修饰巯基ssDNA)和TSP-D (55bp，分子量 16877. 0, 5'端修饰巯基ssDNA)，核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 所示。
[0049] 如序列表中SEQ ID No. 1?7所示的单链DNA均由life technology生物有限公 司合成。
[0050] 实验步骤：
[0051] 取金电极芯片（SC1000-16X，GENE fluidics)在异丙醇中浸泡lmin，然后用超纯 水超声IOs,然后用N2吹干，备用。
[0052] -个金电极芯片上有16个金电极，在三个完全相同的电极上分别进行下述STTS、 ssP和TSP的构建。
[0053] STTS :取等量的四条单链 DNA :STTS-A、TSP-B、TSP-C 和 TSP-D，用 TM buffer (20mM Tris，50mM MgCl2，pH8.0)稀释，形成终浓度均为 ΙμΜ 的 STTS-A、TSP-B、TSP-C 和 TSP-D溶 液。取终浓度均为1 μ M的STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D溶液各50 μ L，95°C反应IOmin 后，立即降温到4°C，持续30min以上，即得ΙμΜ的STTS溶液。将3yL STTS溶液加在金电 极表面，室温孵育过夜，洗液（所述的洗液为0. OlM PBS ;0. OlM PBS包括137mM NaCl、2. 7mM KClUOmM Na2HPO4和2禮KH2PO4调节至ρΗ7· 4;洗液的洗涤方式是直接持续冲洗10?20 秒）冲洗掉未结合的DNA，再加1 μ M SC-DNA37°C孵育1小时，将STTS固定到电极表面。
[0054] ssP :取 ssP，用 TM buffer (20mM Tris，50mM MgCl2, ρΗ8· 0)稀释，形成终浓度均为 1 μ M的ssP溶液。将1 μ M ssP溶液加在金电极表面，室温孵育过夜，将ssP固定到电极表 面，洗液冲洗掉未结合的DNA，加2mM6-巯基己醇（MCH)室温封闭1小时，对金电极空白位点 进行占位封闭。
[0055] TSP :取等量的 TSP-A、TSP-B、TSP-C 和 TSP-D 四条单链 DNA，用 TM buffer (20mM Tris，50mM MgCl2, pH8. 0)稀释，使其终浓度均为ΙμΜ，体积50yL。上述溶液95°C反应 IOmin后，立即降温到4°C，持续30min以上，即得TSP溶液。取3μ L TSP溶液滴加在金电 极表面，室温孵育过夜，洗液冲洗掉未结合的DNA，将TSP固定到电极表面。
[0056] 2电化学检测端粒酶活性
[0057] 2. 1端粒酶延伸反应
[0058] 端粒酶提取液方法如下：首先，收集计数I. OX IO6个Hela细胞，用胰蛋白酶消化 5min，使其从基底上脱落，再将Hela细胞转移至I. 5mL的离心管中，用PBSdOmM PBS，0. 3Μ 似(：1，？!17.4)洗涤三次，用1500印111，41：离心31^11，小心弃去上层清液，然后加入2001^ CHAPS裂解液（0· 5% CHAPS，IOmM Tris-HCl，pH7. 5, ImM MgCl2, ImM EGTA，5mMP -巯基乙醇， 0. ImM PMSF，10%丙三醇），在冰浴上孵育30min，为了使端粒酶充分裂解，其间用移液枪反 复抽取三次，然后用12000rpm，4?离心20min，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置 于液氮中冷却，储存于_80°C冰箱中备用，端粒酶提取液的浓度为5000个细胞/ μ L。
[0059] 将端粒酶提取液与端粒酶延伸反应溶液（20mM Tris-HCl，ρΗ8· 3,1. 5mM MgCl2, ImM EGTA，63mMKCl，0·05%吐温20,0·2mMbiotin-dATP，0·2mMdGTP，0·2mMdTTP)混合，4μL 端粒酶提取液加入6 μ L延伸反应液中。混合均匀之后滴加在步骤1所得的修饰STTS、ssP 和TSP的电极上，30°C延伸反应2小时。
[0060] 反应后用 0· OlM PBS (137mM NaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ7· 4)冲 洗电极并用N2吹干，滴加3 μ L0. 5U/mL的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（Avidin-HRP)，室 温反应45min。制备好的电极最后用0. OlM PBS冲洗，备用于电化学测试。
[0061] 2. 2电化学检测
[0062] 实验材料：
[0063] avidin-HRP，购自Roche公司，参考产品说明书，使用前用IOOmM PBS稀释成0. 5U/ 1111^3￥丨(1;[11-!11^。3,3'，5,5'-四甲基联苯胺水溶液（11?)购于他08611公司，已配有双氧水 的K-blue高活性底物购自Neogen。
[0064] 所有的化学试剂都是分析纯没有经过进一步的纯化直接使用。所有的溶液都用 RNase-free 水配制。RNase-free 水用 0.1% DEPC 处理 MilliQ 水（18ΜΩ .cm,Millipore) 得到。
[0065] 实验步骤：
[0066] 将步骤2. 1所得的备用于电化学测试的电极浸没在50 μ L TMB(已含有双氧水） 底物中，进行电化学检测。电化学检测采用16通道的恒电势器PM3000(Genefluidi CS， Duarte，CA)和金电极芯片，工作电极、参比电极和对电极均为金电极。循环伏安法起始电 压为-300mV，最高电压为+450mV，最低电压为-300mV，扫速为100mV/s。时间电流曲线法测 量的电位为 _200mV，检测时间为60s，此时氧化还原反应电流信号已经趋于稳定。
[0067] STTS的构建过程和电化学检测端粒酶活性的过程可以参见图1。
[0068] 实验结果：
[0069] 图2显示了双链塔尖四面体DNA纳米结构探针（STTS)、没有四面体结构的单链 DNA探针（ssP)和普通四面体结构的三维DNA纳米结构探针（TSP)检测端粒酶活性的电流 信号对比图。从图2可以看出，当使用ssP时，能够观察到只用单链ssP检测5000个Hela 细胞的端粒酶活性信噪比很低，这说明了尽管具有TS primer序列（因为ssP的单链中含有 TS primer)，但单链DNA的探针与金电极表面距离太近，并且表面密度可控性差，不易与端 粒酶的结合并进行延伸反应；用具有单层四面体结构的TSP检测5000Hela细胞的端粒酶活 性信噪比变大，说明四面体结构有助于端粒酶的结合和延伸反应；用STTS检测时，仅3000 个Hela细胞信噪比就大约为TSP检测5000个Hela细胞信噪比的两倍多：STTS检测3000 个Hela细胞的信噪比为15. 89,而TSP检测5000个Hela细胞的信噪比仅为7. 37。说明刚 性的塔尖结构增加了 TS primer与金电极之间的距离（估算增加距离为6. 8nm)，有助于端 粒酶的结合和延伸反应，且由于四面体的厚度增加可以降低表面效应而又不牺牲电化学反 应活性，对开发高灵敏度端粒酶活性检测传感器十分有利。
[0070] 加入含有端粒酶活性的细胞提取液时，端粒酶会同TS primer结合并延伸，由于我 们用生物素修饰的dATP代替了正常的dATP，所以延伸产物中掺入了生物素修饰的dATP，它 可以与avidin-HRP特异性的结合，使得avidin-HRP连接到电极表面。TMB就像电子穿梭 机一样进出HRP酶的氧化还原活性中心，同时被H 2O2在电极表面大量催化还原，使得催化电 流迅速增加形成一个明显增大的电催化峰。稳态时间电流法可以更加直接的表征HRP酶催 化的电化学过程。当初始电位保持在_200mV(相对于Au参比电极）时，可以观察到电流随 时间变化曲线关系很快电流就会达到平衡状态，在60s左右已经达到稳态电流。对应典型 的HRP酶电催化过程的出现，还原峰电流明显增加，形成了一对非对称的氧化还原峰。这一 现象说明了端粒酶与双链塔尖四面体DNA纳米结构探针结合并进行端粒酶延伸反应的产 物已经结合到电极表面。
[0071] 实施例2
[0072] 1双链塔尖四面体DNA纳米结构探针（STTS)的构建
[0073] 实验材料：
[0074] STTS-A (93bp，分子量 28012. 0, ssDNA)、TSP-B (55bp，分子量 17018.0, 5' 端修饰 巯基 ssDNA)、TSP-C(55bp，分子量 16898. 0,5' 端修饰巯基 ssDNA)和 TSP-D(55bp，分子量 16877.0,5' 端修饰疏基 ssDNA)和互补链 Spire-Complementary DNA (SC_DNA，20bp，分子量 6176·0，ssDNA)，核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNo·l、SEQIDNo·4、SEQIDNo·5、SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 所示。
[0075] 如序列表中SEQ ID No. 1、4?7所示的单链DNA均由life technology生物有限 公司合成。
[0076] 实验步骤：
[0077] 取金电极芯片（SC1000-16X，GENE fluidics)在异丙醇中浸泡lmin，然后用超纯 水超声10s，然后用N2吹干，备用。一个金电极芯片上有16个金电极，在任一电极上进行所 述STTS的构建。
[0078] 取等量的四条单链DNA :STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D，用 TM buffer(20mM Tris， 50mM MgCl2，pH8. 0)稀释，形成终浓度均为 1 μ M 的 STTS-A、TSP-B、TSP-C 和 TSP-D 溶液。取 终浓度均为1 μ M的STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D溶液各50 μ L，97°C反应8min后，立即降 温到2°C，持续30min以上，即得1 μ M的STTS溶液。将3 μ L STTS溶液加在金电极表面，室 温（15°C )孵育过夜，洗液（所述的洗液为0· OlM PBS ;0· OlM PBS包括137mM NaCl、2. 7mM KClUOmM Na2HPO4和2禮KH2PO4调节至ρΗ7· 4;洗液的洗涤方式是直接持续冲洗10?20 秒）冲洗掉未结合的DNA，再加1 μ M SC-DNA37°C孵育1小时，将STTS固定到电极表面。
[0079] 2电化学检测端粒酶活性
[0080] 2. 1端粒酶延伸反应
[0081] 端粒酶提取液方法如下：首先，收集计数I. OX IO6个Hela细胞，用胰蛋白酶消化 4min，使其从基底上脱落，再将Hela细胞转移至I. 5mL的离心管中，用PBSdOmM PBS，0. 3M 似(：1，？!17.4)洗涤三次，用1200印111，41：离心41^11，小心弃去上层清液，然后加入2001^ CHAPS裂解液（0· 5% CHAPS，IOmM Tris-HCl，pH7. 5, ImM MgCl2, ImM EGTA，5mMP -巯基乙醇， 0. ImM PMSF，10%丙三醇），在冰浴上孵育30min，为了使端粒酶充分裂解，其间用移液枪反 复抽取三次，然后用12000rpm，4?离心20min，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置 于液氮中冷却，储存于_80°C冰箱中备用，端粒酶提取液的浓度为5000个细胞/ μ L。
[0082] 将端粒酶提取液与端粒酶延伸反应溶液（20mM Tris-HCl，pH8. 3,1. 5mM MgCl2, ImM EGTA，63mMKCl，0·05%吐温20,0·2mMbiotin-dATP，0·2mMdGTP，0·2mMdTTP)混合，4μL 端粒酶提取液加入6 μ L延伸反应液中。混合均匀之后滴加在步骤1所得的修饰STTS的电 极上，35°C延伸反应2小时。
[0083] 反应后用 0· OlM PBS (137mM NaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ7· 4)冲 洗电极并用N2吹干，滴加3 μ L0. 5U/mL的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（Avidin-HRP)，室 温反应45min。制备好的电极最后用0. OlM PBS冲洗，备用于电化学测试。
[0084] 2. 2电化学检测
[0085] 实验材料：
[0086] avidin-HRP，购自Roche公司，参考产品说明书，使用前用IOOmM PBS稀释成0. 5U/ 1111^3￥丨(1;[11-!11^。3,3'，5,5'-四甲基联苯胺水溶液（11?)购于他08611公司，已配有双氧水 的K-blue高活性底物购自Neogen。
[0087] 所有的化学试剂都是分析纯没有经过进一步的纯化直接使用。所有的溶液都用 RNase-free水配制。RNase-free水用0·l(%DEPC处理MilliQ水（18MΩ·cm，Millipore) 得到。
[0088] 实验步骤：
[0089] 将步骤2. 1所得的备用于电化学测试的电极浸没在50 μ L TMB(已含有双氧水） 底物中，进行电化学检测。电化学检测采用16通道的恒电势器PM3000(Genefluidi CS， Duarte，CA)和金电极芯片，工作电极、参比电极和对电极均为金电极。循环伏安法起始电 压为-300mV，最高电压为+450mV，最低电压为-300mV，扫速为100mV/s。时间电流曲线法测 量的电位为 _200mV，检测时间为60s，此时氧化还原反应电流信号已经趋于稳定。
[0090] 实验结果：
[0091] 将步骤2. 1所得的备用于电化学测试的电极，浸没在50μ L已含有双氧水的TMB 底物中电化学检测端粒酶活性，观察到明显增加的还原峰电流。
[0092] 实施例3
[0093] 1双链塔尖四面体DNA纳米结构探针（STTS)的构建
[0094] 实验材料：
[0095] STTS-A (93bp，分子量 28012. 0, ssDNA)、TSP-B (55bp，分子量 17018.0, 5' 端修饰 巯基 ssDNA)、TSP-C(55bp，分子量 16898. 0,5' 端修饰巯基 ssDNA)和 TSP-D(55bp，分子量 16877.0,5' 端修饰疏基 ssDNA)和互补链 Spire-Complementary DNA (SC_DNA，20bp，分子量 6176·0，ssDNA)，核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNo·l、SEQIDNo·4、SEQIDNo·5、SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7 所示。
[0096] 如序列表中SEQ ID No. 1、4?7所示的单链DNA均由life technology生物有限 公司合成。
[0097] 实验步骤：
[0098] 取金电极芯片（SC1000-16X，GENE fluidics)在异丙醇中浸泡lmin，然后用超纯 水超声10s，然后用N2吹干，备用。一个金电极芯片上有16个金电极，在任一电极上进行所 述STTS的构建。
[0099] 取等量的四条单链DNA :STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D，用 TM buffer(20mM Tris， 50mM MgCl2, ρΗ8· 0)稀释，形成终浓度均为 1 μ M 的 STTS-A、TSP-B、TSP-C 和 TSP-D 溶液。 取终浓度均为1 μ M的STTS-A、TSP-B、TSP-C和TSP-D溶液各50 μ L，93°C反应12min后，立 即降温到5°C，持续30min以上，即得ΙμΜ的STTS溶液。将3yL STTS溶液加在金电极表 面，室温（35°C )孵育过夜，洗液（所述的洗液为0· OlM PBS ;0· OlM PBS包括137mM NaCl、 2.7mM KCl、10mM似2即04和2禮KH2PO4调节至ρΗ7·4;洗液的洗涤方式是直接持续冲洗10? 20秒）冲洗掉未结合的DNA，再加1 μ M SC-DNA37°C孵育1小时，将STTS固定到电极表面。
[0100] 2电化学检测端粒酶活性
[0101] 2. 1端粒酶延伸反应
[0102] 端粒酶提取液方法如下：首先，收集计数I. OX IO6个Hela细胞，用胰蛋白酶消化 6min，使其从基底上脱落，再将Hela细胞转移至I. 5mL的离心管中，用PBSdOmM PBS，0. 3M 似(：1，？!17.4)洗涤三次，用1800印111，41：离心21^11，小心弃去上层清液，然后加入2001^ CHAPS裂解液（0· 5% CHAPS，IOmM Tris-HCl，pH7. 5, ImM MgCl2, ImM EGTA，5mMP -巯基乙醇， 0. ImM PMSF，10%丙三醇），在冰浴上孵育30min，为了使端粒酶充分裂解，其间用移液枪反 复抽取三次，然后用12000rpm，4?离心20min，最后取出上层清液转移至离心管中，迅速置 于液氮中冷却，储存于_80°C冰箱中备用，端粒酶提取液的浓度为5000个细胞/ μ L。
[0103] 将端粒酶提取液与端粒酶延伸反应溶液（20mM Tris-HCl，ρΗ8. 3,1. 5mM MgCl2, ImM EGTA，63mMKCl，0·05%吐温20,0·2mMbiotin-dATP，0·2mMdGTP，0·2mMdTTP)混合，4μL 端粒酶提取液加入6 μ L延伸反应液中。混合均匀之后滴加在步骤1所得的修饰STTS的电 极上，28°C延伸反应3小时。
[0104] 反应后用 0· OlM PBS (137mM NaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ7· 4)冲 洗电极并用N2吹干，滴加3 μ L0. 5U/mL的亲和素修饰的辣根过氧化物酶（Avidin-HRP)，室 温反应45min。制备好的电极最后用0. OlM PBS冲洗，备用于电化学测试。
[0105] 2. 2电化学检测
[0106] 实验材料：
[0107] avidin-HRP，购自Roche公司，参考产品说明书，使用前用IOOmM PBS稀释成0. 5U/ 1111^3￥丨(1;[11-!11^。3,3'，5,5'-四甲基联苯胺水溶液（11?)购于他08611公司，已配有双氧水 的K-blue高活性底物购自Neogen。
[0108] 所有的化学试剂都是分析纯没有经过进一步的纯化直接使用。所有的溶液都用 RNase-free 水配制。RNase-free 水用 0.1% DEPC 处理 MilliQ 水（18ΜΩ .cm,Millipore) 得到。
[0109] 实验步骤：
[0110] 将步骤2. 1所得的备用于电化学测试的电极浸没在50 μ L TMB(已含有双氧水） 底物中，进行电化学检测。电化学检测采用16通道的恒电势器PM3000(Genefluidi CS， Duarte，CA)和金电极芯片，工作电极、参比电极和对电极均为金电极。循环伏安法起始电 压为-300mV，最高电压为+450mV，最低电压为-300mV，扫速为100mV/s。时间电流曲线法测 量的电位为 _200mV，检测时间为60s，此时氧化还原反应电流信号已经趋于稳定。
[0111] 实验结果：
[0112] 将步骤2. 1所得的备用于电化学测试的电极，浸没在50μ L已含有双氧水的TMB 底物中电化学检测端粒酶活性，观察到明显增加的还原峰电流。
[0113] 实施例4STTS检测Hela细胞端粒酶不同延伸时间的电流信号
[0114] STTS的构建以及使用STTS的电化学检测端粒酶活性的方法与实施例1中的实验 材料以及实验步骤相同。
[0115] 6000个Hela细胞（Hela细胞购自ATCC细胞库）的端粒酶延伸时间分别为Omin、 15min、30min、lhour、2hour、3hour、4hour〇
[0116] 图3为STTS在不同端粒酶延伸时间的电流信号图。结果如图3所示，电化学信 号随着延伸时间的增加指数递增，在3hour后信号增长达到平台期，因此，选取3hour作为 STTS检测Hela细胞端粒酶活性的最佳延伸时间。
[0117] 实施例5 STTS检测不同数量Hela细胞端粒酶活性与电流的关系
[0118] STTS的构建以及使用STTS的电化学检测端粒酶活性的方法与实施例1中的实验 材料以及实验步骤相同。
[0119] 图4A显示检测50000个Hela细胞有端粒酶活性和端粒酶失活的时间-电流（i-t) 曲线图。
[0120] 从图中可以看出，端粒酶有活性时，电流信号（?1600nA)明显大于端粒酶失活 的信号（?86nA)。图4B显示不同Hela细胞数目的时间-电流（i-t)曲线图。从图中可 以看出，随着细胞数从少到多依次递增（〇, 45,90,188, 375, 750,1500, 3000,6000,10000， 20000)，电流信号也单向递增。图4C显示0-50000个Hela细胞端粒酶活性检测的工作曲 线，其中插入的柱形图显示空白、45个和188个Hela细胞的电流信号图。根据图4C中的曲 线拟合公式如下：
【权利要求】
1. 一种双链塔尖四面体DNA纳米结构探针，包括DNA四面体基座、所述DNA四面体基 座的顶点的DNA双链"塔尖"和端粒酶引物序列；其中，所述双链塔尖四面体DNA纳米结构 探针由单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C、单链探针D和单链探针SC-DNA组成；所 述DNA四面体基座由所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D组成；所 述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D都含有三个结构域，且每个所述 结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单 链探针C和单链探针D分别围绕一圈形成所述DNA四面体基座的一个面，并在所述DNA四 面体基座的顶点处有两个非互补的起弯折作用的碱基；所述单链探针STTS-A的3'端还依 次含有结构域A和结构域B ;所述结构域A为端粒酶引物序列；所述结构域B与所述单链探 针SC-DNA互补形成所述的DNA双链"塔尖"。
2. 如权利要求1所述的双链塔尖四面体DNA纳米结构探针，其特征在于，所述单链探针 STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No. 1， SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6所示；所述端粒酶引物序列的核苷酸序列如序列 表中SEQ ID No. 8所示；所述链探针SC-DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 7所示。
3. -种利用所述双链塔尖四面体DNA纳米结构探针检测端粒酶活性的检测方法，所述 的方法包括以下的步骤： (1) 、通过DNA纳米自组装技术的一步法合成方法制得DNA四面体基座；所述的一步法 合成方法是将所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D配制成探针溶 液，在93?97°C加热8?12min后，冷却至2?5°C持续30min以上而得所述DNA四面体 基座；所述单链探针STTS-A、单链探针B、单链探针C和单链探针D都含有三个结构域，且每 个所述结构域分别与所述其他三条单链探针的结构域互补；所述单链探针STTS-A、单链探 针B、单链探针C和单链探针D分别围绕一圈形成所述DNA四面体基座的一个面，并在所述 DNA四面体基座的顶点处有两个非互补的起弯折作用的碱基；所述单链探针STTS-A的3'端 还依次含有结构域A和结构域B ;所述结构域A为端粒酶引物序列；所述结构域B与所述单 链探针SC-DNA互补形成所述的DNA双链"塔尖"； (2) 、在电化学装置的工作电极的表面添加步骤（1)所得的DNA四面体基座，使所述DNA 四面体基座的三个顶点自组装连接到所述的工作电极的表面，另一个顶点延伸出端粒酶引 物序列，得到表面组装DNA四面体基座的工作电极； (3) 、将所述单链探针SC-DNA添加在步骤⑵所得的工作电极上，90?96°C加热8? 12min，迅速降温到2?5°C，持续30min以上后，即获得表面修饰有所述双链塔尖四面体 DNA纳米结构探针的工作电极； (4) 、将待检测端粒酶样本溶液与端粒酶延伸反应溶液混合，添加到步骤（3)所得的工 作电极的表面，进行端粒酶延伸反应，获得延伸产物；所述的端粒酶延伸反应溶液包含带基 团A修饰的dATP ; (5) 、加入基团B修饰的氧化还原酶，所述基团B能够与步骤（4)所述的基团A特异性 结合，从而使所述的氧化还原酶连接于步骤（4)所述的延伸产物上； (6) 、加入步骤（5)所述氧化还原酶催化的反应所需的底物，经所述氧化还原酶催化， 产生电化学氧化还原信号，进行电化学检测分析。
4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)中所述单链探针STTS-A、单链 探针B、单链探针C和单链探针D用TE缓冲溶液配制；或步骤（1)中所述单链探针STTS-A、 单链探针B、单链探针C和单链探针D的摩尔浓度比为1:1:1:1 ;或步骤（1)中所述一步法合 成控制95°C加热lOmin，迅速降温到4°C，持续30 min以上；较佳地，所述单链探针STTS-A、 单链探针B、单链探针C和单链探针D的浓度都为1 μ Μ ;较佳地，步骤（1)中所述一步法合 成为：取所述1 μ Μ单链探针STTS-A、单链探针Β、单链探针C和单链探针D的溶液各1 μ L 以及500mM的TCEP1L和45 μ L ΤΜ缓冲溶液混合均勻，然后95°C加热lOmin，迅速降温到 4°C，持续30min以上得到终浓度为1M的所述DNA四面体基座。
5. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤（2)所述的工作电极为金电极；或 步骤（2)所述的连接是将1 μ Μ含所述DNA四面体基座的溶液滴加到金电极表面15°C? 35 °C条件下反应过夜。
6. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤（4)中所述端粒酶延伸反应溶液 包括20mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，lmM EGTA，63mM 1((：1，0.05%了￥661120,0.21111基团 A-dATP，0. 2mM dGTP，0. 2mM dTTP;或步骤（4)中所述端粒酶延伸反应的延伸时间为2?3 小时，较佳地，为3小时；或步骤（4)中所述端粒酶延伸反应的温度为28°C?35°C，较佳地， 为30°C ;或步骤（4)中所述端粒酶延伸反应后，电极用0. 01M PBS冲洗；较佳的，电极冲洗 后用惰性气体吹干；更佳地，所述惰性气体为氮气；较佳地，所述步骤（4)中所述端粒酶延 伸反应的温度为30°C ;步骤（4)中所述的基团A为地高辛或生物素。
7. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤（5)中所述的基团B为抗地高辛分 子或抗生物素分子；或步骤（5)中所述氧化还原反应酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶 的一种或两种；较佳地，是抗生物素蛋白修饰的辣根过氧化物酶。
8. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤（6)中所述加入反应所需的底物选 自3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺、2, 2-连氮-双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸、变色酸2R或双氧 水的任一种。
9. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤⑴到步骤（6)的任一步骤 完成后，用洗液洗去反应体系中的游离物；或所述的洗液为〇. 1M?0. 2M NaCl ;较佳地，所 述的洗液为 〇· 01M PBS，所述 0· 01M PBS 包括 137mM NaCl、2. 7mM KCl、10mM Na2HP04 和 2mM KH2P04调节至pH7. 4 ;或所述洗液的洗涤方式是直接持续冲洗10?20秒。
10. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（4)待检测端粒酶样本溶液 的端粒酶是从正常细胞、干细胞和/或癌细胞中提取而得。
【文档编号】C12Q1/26GK104263725SQ201410482890
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】刘刚, 李妍, 闻艳丽, 梁文, 许丽, 王乐乐 申请人:上海市计量测试技术研究院