表达具有人λ可变区和小鼠恒定区的轻链的小鼠的制作方法
【专利摘要】提供了表达人λ可变(hVλ)序列的遗传修饰的小鼠，包括从内源小鼠λ轻链基因座表达hVλ序列的小鼠，从内源小鼠κ轻链基因座表达hVλ序列的小鼠，以及从其中hVλ序列连接至小鼠恒定序列的转基因或附加体表达hVλ序列的小鼠。提供了其为用于产生抗原结合蛋白的体细胞突变的人λ可变序列的来源的小鼠。提供了用于产生包含人λ可变序列的抗原结合蛋白包括人抗体的组合物和方法。
【专利说明】表达具有人A可变区和小鼠恒定区的轻链的小鼠
[0001] 本申请是申请号为 201180038415. 2(PCT/US2011/041366)，申请日为 2011 年 6 月 22日的中国发明专利申请"表达具有人A可变区和小鼠恒定区的轻链的小鼠"的分案申 请。
[0002] 领域
[0003] 包含与小鼠或人轻链恒定区（X或kappa(K))有效连接的小鼠或人X可变 (VX)轻链序列的遗传修饰的小鼠。表达包含含有来源于人A可变（hvA)基因区段的可 变结构域、人AJ(hJA)基因区段和小鼠轻链恒定（CJ结构域的免疫球蛋白轻链的表位结 合蛋白的遗传修饰的小鼠。遗传修饰的小鼠，其在内源小鼠轻链基因座上包含未重排的免 疫球蛋白lambdaU)轻链可变核酸序列。能够重排并且从内源轻链基因座表达嵌合人入/ 小鼠Q轻链的小鼠，所述内源轻链基因座包括，利用一个或多个hVA基因区段以及一个或 多个hJA基因区段对所有内源小鼠轻链可变区基因区段的替换。包含hVA结构域和小鼠 Q结构域的体细胞突变的抗体。
[0004] 背景
[0005] 表达为完全人或者部分人及部分小鼠的抗体的小鼠在本领域是已知的。例如，已 报导了，从包含人轻链和重链免疫球蛋白可变区基因的转基因表达完全人抗体的转基因小 鼠。包括利用人HCVR和LCVR基因区段对内源小鼠重链可变区（HCVR)基因区段和k轻链 可变区（LCVR)基因区段的替换并且产生具有嵌合人/小鼠k链的嵌合抗体的遗传修饰的 小鼠也是已知的。
[0006] 抗体轻链由两个分离的基因座：kappa(k)和lambda(A)之一编码。小鼠抗体轻 链主要为k型。人中的k对：V轻链使用的比率为约60:40,然而在小鼠中，该比率为约 95:5。小鼠中k轻链的偏爱性使用据报导在能够表达完全或部分人抗体的遗传修饰的小 鼠中被保留。因此，表达完全或部分人抗体的小鼠显示在A可变使用上受到限制。
[0007] 本领域需要产生用于制备表位结合蛋白的A可变区（无论是小鼠的还是人的）。 本领域需要表达完全或部分人抗体的小鼠，其中所述小鼠显示增加的A可变（VA)使用。
[0008] 本领域需要表达完全或部分人抗体的小鼠，其中所述小鼠显示增加的A可变 (V入）使用。
[0009] 概述
[0010] 提供了遗传修饰的小鼠、胚胎、细胞、组织以及用于修饰小鼠的核酸构建体，和用 于产生和使用它们的方法及组合物。提供了在kappa(K)轻链的背景下产生lambda(入） 可变区（人或非人）的小鼠和细胞。还提供了在k或A轻链的背景下，例如从内源小鼠 轻链基因座，产生人A可变区的小鼠和细胞。还提供了，用于产生包含A可变区的抗体的 方法。还提供了，用于选择与关联（cognate)X可变区一起表达的重链的方法。
[0011] 提供了包括体细胞突变的可变区的嵌合和人抗原结合蛋白（例如，抗体）以及编 码其的核酸，包括具有包含融合至小鼠轻链恒定结构域的、来源于人和人基因区段 的可变结构域的轻链的抗体。
[0012] 在一个方面，提供了在包含小鼠恒定区的轻链上表达人A可变区序列的小鼠。在 一个方面，提供了在包含K恒定区的轻链上表达人A可变区序列的小鼠。在一个方面，提 供了从内源小鼠轻链基因座表达包含人A可变区序列的轻链的小鼠。在一个方面，提供了 包含重排的轻链基因的小鼠，所述轻链基因包含连接至小鼠恒定区序列的人A可变序列； 在一个实施方案中，小鼠恒定区序列为A恒定序列；在一个实施方案中，小鼠恒定区序列 为K恒定序列。
[0013] 在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含未重排的人A轻链可变 基因区段（hVA)和人入连接基因区段（hjx)。在一个实施方案中，未重排的hv入和hj入 在小鼠轻链基因座上。在一个实施方案中，未重排的hVX和未重排的hJX在转基因上并 且有效地连接至人或小鼠恒定区序列。在一个实施方案中，未重排的hVX和未重排的hj入 在附加体（印isome)上。在一个实施方案中，小鼠能够产生免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包 含从未重排的hVA序列和hjA序列以及小鼠轻链恒定区（Q)核酸序列衍生的轻链。还提 供了用于产生和使用遗传修饰的小鼠的方法和组合物。提供了抗体，所述抗体包含（a)融 合至小鼠重链恒定区的人重链可变结构域（hVH)，和（b)融合至小鼠Q结构域的人VA;包 括其中，例如在本发明的小鼠的抗体或免疫细胞的选择过程中，对一个或多个可变结构域 进行体细胞突变。在一个实施方案中，未重排的hVA和未重排的hjA与人或小鼠k恒定 区（Ck)有效地连接。在一个实施方案中，未重排的hVX和未重排的hJX与人或小鼠入 恒定区（CA)有效地连接。
[0014] 在一个方面，提供了在其种系中在内源小鼠轻链基因座上包含人A轻链可变区 序列的小鼠，其中人A可变区序列在包含小鼠免疫球蛋白恒定区基因序列的轻链中表达。
[0015] 在一个实施方案中，内源小鼠轻链基因座为X基因座。在一个实施方案中，内源 小鼠轻链基因座为k基因座.
[0016] 在一个实施方案中，小鼠在内源小鼠轻链基因座上不存在内源轻链可变序列。
[0017] 在一个实施方案中，所有或基本上所有的内源小鼠轻链可变区基因区段被一个或 多个人A可变区基因区段替换。
[0018]在一个实施方案中，人A轻链可变区序列包含人序列。在一个实施方案中， 人序列选自1、0 2、03、07及其组合。
[0019] 在一个实施方案中，人A轻链可变区序列包含人轻链基因座的A簇的片段。在具 体的实施方案中，人入轻链基因座的A簇的片段从hVA3-27延伸至hVA3-1。
[0020] 在一个实施方案中，人A轻链可变区序列包含人轻链基因座的B簇的片段。在具 体的实施方案中，人入轻链基因座的B簇的片段从hVA5-52延伸至hVA1-40。
[0021] 在一个实施方案中，人A轻链可变区序列包含A簇的基因组片段和B簇的基因组 片段。在一个实施方案中，人A轻链可变区序列包含A簇的至少一个基因区段和B簇的至 少一个基因区段。
[0022] 在一个实施方案中，超过10%的小鼠轻链天然库（naiVerepertoire)来源于选 自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少两个1^入基因区段。在一个实施方案中，超过20% 的小鼠轻链天然库来源于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少三个hV入基因区段。在 一个实施方案中，超过30%的小鼠轻链天然库来源于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的 至少四个hVX基因区段。
[0023] 在一个方面，提供了表达免疫球蛋白轻链的小鼠，所述免疫球蛋白轻链包含与小 鼠恒定区融合的人A可变序列，其中所述小鼠显示约1:1的K使用对A使用的比率。
[0024] 在一个实施方案中，从内源小鼠轻链基因座表达免疫球蛋白轻链。
[0025] 在一个方面，提供了包含与小鼠k轻链恒定区序列连续的A轻链可变区序列 (V入）和至少一个J序列（J)的小鼠。
[0026] 在一个实施方案中，小鼠缺乏功能性小鼠Vk和/或小鼠Jk基因区段。
[0027] 在一个实施方案中，VX为人VX(hVX)，并且J为人JX(hjX)。在一个实施方 案中，hVA和hjA为未重排的基因区段。
[0028] 在一个实施方案中，小鼠包含多个未重排的hVA基因区段和至少一个hj入基因 区段。在具体的实施方案中，多个未重排的hVA基因区段为至少12个基因区段、至少28 个基因区段或至少40个基因区段。
[0029] 在一个实施方案中，至少一个hJX基因区段选自1、JX2、JX3、JX7及其组 合。
[0030] 在一个实施方案中，内源小鼠A轻链基因座被完整或部分缺失。
[0031] 在一个实施方案中，小鼠K轻链恒定区序列在内源小鼠K轻链基因座上。
[0032] 在一个实施方案中，约10%至约45%的小鼠B细胞表达抗体，所述抗体包括包含 人入轻链可变（VA)结构域和小鼠k轻链恒定（Ck)结构域的轻链。
[0033] 在一个实施方案中，人X可变结构域来源于重排的hVX/hJX序列，所述hV入/ hj入序列选自 3-1/1、3-1/7、4-3/1、4-3/7、2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、2-14/1、 3-19/1、2-23/1、3-25/1、1-40/1、1-40/2、1-40/3、卜40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、1-44/7、 5-45/1、5-45/2、5-45/7、7-46/1、7-46/2、7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7 和 1-51/1。
[0034] 在一个实施方案中，小鼠还包括来自人k轻链基因座的人Vk-Jk基因间区域， 其中人Vk-Jk基因间区域与序列和J序列连续。在具体的实施方案中，人Vk-Jk 基因间区域置于序列与J序列之间。
[0035] 在一个方面，提供了小鼠，所述小鼠（a)在内源小鼠轻链基因座上包含至少12至 至少40个未重排的人A轻链可变区基因区段和至少一个人JA基因区段；(b)包含位于 至少12至至少40个轻链可变区基因区段与至少一个人序列之间的人Vk-Jk基因间 序列；其中所述小鼠表达包含含有人结构域和小鼠Ck结构域的轻链的抗体。
[0036] 在一个方面，提供了表达包含含有A可变序列和K恒定序列的轻链的抗体的小 鼠。
[0037] 在一个实施方案中，小鼠显示了约1:1的k使用对入使用的比率。
[0038] 在一个实施方案中，获自小鼠骨髓的未成熟B细胞群体显示约1:1的K使用对入 使用的比率。
[0039] 在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含与包含小鼠Q基因的小 鼠轻链基因座有效连接的未重排的免疫球蛋白和基因区段。
[0040] 在一个实施方案中，VA和/或基因区段为人基因区段。在一个实施方案中， V入和/或基因区段为小鼠基因区段，并且Q为小鼠CK。
[0041] 在一个实施方案中，内源小鼠轻链基因座为k轻链基因座。在一个实施方案中， 内源小鼠轻链基因座为X轻链基因座。
[0042] 在一个实施方案中，未重排的VX和基因区段在内源小鼠轻链基因座上。
[0043]在一个实施方案中，未重排的免疫球蛋白VA和基因区段在转基因上。
[0044] 在一个实施方案中，小鼠还在内源小鼠重链免疫球蛋白基因座上包括，一个或多 个人V、D和/或J基因区段对一个或多个重链V、D和/或J基因区段的替换。
[0045]在一个实施方案中，小鼠在包含小鼠Ck基因的内源小鼠k轻链基因座上包含未 重排的免疫球蛋白和基因区段。
[0046]在一个实施方案中，小鼠在包含小鼠C入基因的内源小鼠入轻链基因座上包含未 重排的人免疫球蛋白A轻链可变基因区段（VA)和A连接基因区段（J入）。
[0047] 在一个实施方案中，轻链可变基因基因座（"'基因座"）包含至少一个人 V入（hVA)基因区段。在一个实施方案中，'基因座包含至少一个人JA(hJA)基因区段。 在另一个实施方案中，'基因座包含多至4个hjA基因区段。在一个实施方案中，'基因 座包含含有人A和人k基因组序列的连续序列。
[0048] 在一个实施方案中，k轻链可变基因基因座（"K基因座"）包含至少一个人 V入（hvA)基因区段。在一个实施方案中，K基因座包含至少一个人JA(hjA)基因区段。 在一个实施方案中，K基因座包含多至4个hj入基因区段。在一个实施方案中，K基因座 包含至少一个hV入和至少一个hJA，并且不存在或基本上不存在功能性Vk区基因区段以 及不存在或基本上不存在功能性JK区基因区段。在一个实施方案中，小鼠不包含功能性 VK区基因区段。在一个实施方案中，小鼠不包含功能性JK区基因区段。
[0049] 在一个实施方案中，入轻链可变基因基因座（"入基因座"）包含至少一个hV入 基因区段。在一个实施方案中，入基因座包含至少一个人JA(hJA)基因区段。在另一个 实施方案中，A基因座包含多至4个hJA基因区段。
[0050] 在一个实施方案中，'基因座包含多个hVA。在一个实施方案中，选择多个hV入， 以导致反映人中观察到的V入使用的约10 %、约20 %、约30 %、约40 %、约50 %、约60 %、 约70%、约80%或约90%或更多的A轻链可变区库的表达。在一个实施方案中，八基因 座包含基因区段hVM-40、1-44、2-8、2-14、3-21及其组合。
[0051] 在一个实施方案中，hVX包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在具体的实 施方案中，'基因座包括横跨VA3-12至VA3-1的人A轻链基因座的连续序列。在一个 实施方案中，\基因座包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个hVX。在具体的实施方 案中，hV入包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在具体的实施方案中，八基因座包 含横跨VA3-12至VA3-1的人入基因座的连续序列。在一个实施方案中，'基因座在内 源k基因座上。在具体的实施方案中，'基因座在内源k基因座上并且内源A轻链基因 座被部分或完全缺失。在一个实施方案中，'基因座在内源A基因座上。在具体的实施方 案中，'基因座在内源A基因座上并且内源k基因座被部分或完全缺失。
[0052] 在一个实施方案中，'基因座包括13至28个或更多的hVX。在具体的实施方案 中，hV入包括 2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25和3-27。在具体的实施方案中， k基因座包含横跨3-27至VA3-1的人A基因座的连续序列。在一个实施方案中，' 基因座在内源k基因座上。在具体的实施方案中，'基因座在内源k基因座上并且内源 入轻链基因座被部分或完全缺失。在另一个实施方案中，'基因座在内源A基因座上。在 具体的实施方案中，'基因座在内源A基因座上并且内源k基因座被部分或完全缺失。
[0053] 在一个实施方案中，'基因座包含29至40个hVX。在具体的实施方案中，k基因 座包含横跨VA3-29至VA3-1的人入基因座的连续序列，横跨VA5-52至VA1-40的人入 基因座的连续序列。在具体的实施方案中，遗传修饰的小鼠中的hV入1-40与hV入3-29之间 的所有或基本上所有序列基本上由下述组成：天然发现的（例如，在人群中）在hVA1-40 基因区段下游（3'非翻译部分的下游）的约959bp的人A序列、限制性酶位点（例如， Pl-Scel)、紧接着天然发现的hVA3-29基因区段的上游的约3,431bp的人入序列。在一 个实施方案中，\基因座在内源小鼠k基因座上。在具体的实施方案中，'基因座在内源 小鼠k基因座上并且内源小鼠A轻链基因座被部分或完全缺失。在另一个实施方案中， \基因座在内源小鼠A基因座上。在具体的实施方案中，'基因座在内源小鼠A基因座 上并且内源小鼠k基因座被部分或完全缺失。
[0054]在一个实施方案中，'基因座包含至少一个hJX。在一个实施方案中，'基因座 包含多个hj入。在一个实施方案中，'基因座包含至少2、3、4、5、6或7个hJA。在具体 的实施方案中，'基因座包含4个hJA。在具体的实施方案中，4个hj入为hJAl、hJ入2、 hj入3和hJA7。在一个实施方案中，\基因座为k基因座。在具体的实施方案中，'基 因座在内源k基因座上并且内源A轻链基因座被部分或完全缺失。在一个实施方案中， \基因座包含一个hjA。在具体的实施方案中，一个hjA为hjXI。在一个实施方案中， '基因座在内源k基因座上。在具体的实施方案中，'基因座在内源k基因座上并且内 源入轻链基因座被部分或完全缺失。在另一个实施方案中，'基因座在内源A基因座上。 在具体的实施方案中，'基因座在内源A基因座上并且内源K基因座被部分或完全缺失。
[0055]在一个实施方案中，八基因座包含至少一个hVX、至少一个hJX和小鼠Ck基因。 在一个实施方案中，'基因座包含至少一个hVA、至少一个hJA和小鼠CA基因。在具体 的实施方案中，小鼠CA基因为CA2。在具体的实施方案中，小鼠CA基因与小鼠CA2具 有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %或至少99 %的同 一性。
[0056]在一个实施方案中，小鼠在内源小鼠k基因座上包括，利用一个或多个hVX基因 区段对内源小鼠Vk基因区段的替换，其中hVA基因区段有效地连接至内源小鼠Ck区基 因，以便小鼠重排人基因区段并且表达包含人结构域和小鼠Ck的反向嵌合免疫 球蛋白轻链。在一个实施方案中，90-100%的未重排的小鼠Vk基因区段被至少一个未重 排的hVA基因区段替换。在具体的实施方案中，所有或基本上所有内源小鼠Vk基因区段 被至少一个未重排的hVA基因区段替换。在一个实施方案中，利用至少12、至少28或至 少40个未重排的hVA基因区段进行替换。在一个实施方案中，利用至少7个功能性未重 排的hVA基因区段、至少16个功能性未重排的hVA基因区段或至少27个功能性未重排 的hVA基因区段进行替换。在一个实施方案中，小鼠包括利用至少一个未重排的hj入基 因区段对所有小鼠Jk基因区段的替换。在一个实施方案中，至少一个未重排的hJA基 因区段选自J入1、J入2、J入3、J入4、J入5、J入6、J入7及其组合。在具体的实施方案中，一 个或多个hVX基因区段选自 3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、2-14、3-16、2-18、3-19、 3-21、3-22、2-23、3-25、3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、卜47、5-48、9-49、1-50、卜51、 5-52hVA基因区段及其组合。在具体的实施方案中，至少一个未重排的hjA基因区段选自 J入1、JX2、JX3、JX7及其组合。
[0057]在一个实施方案中，小鼠在内源小鼠入基因座上包括，利用一个或多个人V入基 因区段对内源小鼠VA基因区段的替换，其中hVA基因区段有效地连接至小鼠CA区基 因，以便小鼠重排hvA基因区段并且表达包含hvA结构域和小鼠cA的反向嵌合免疫球 蛋白轻链。在具体的实施方案中，小鼠CA基因为CA2。在具体的实施方案中，小鼠CA基因 与小鼠C入2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %的同一 性。在一个实施方案中，90-100%的未重排的小鼠VA基因区段被至少一个未重排的hV入 基因区段替换。在具体的实施方案中，所有或基本上所有内源小鼠VA基因区段被至少一 个未重排的hVA基因区段替换。在一个实施方案中，利用至少12、至少28或至少40个未 重排的hVA基因区段进行替换。在一个实施方案中，利用至少7个功能性未重排的hV入基 因区段、至少16个功能性未重排的hVA基因区段或至少27个功能性未重排的hVA基因区 段进行替换。在一个实施方案中，小鼠包括利用至少一个未重排的hJA基因区段对所有小 鼠基因区段的替换。在一个实施方案中，至少一个未重排的hJA基因区段选自J入1、 】入2、1入3、11入4、11入5、 11入6、11入7及其组合。在具体的实施方案中，一个或多个1^入基 因区段选自 3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、 3-25、3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、5-48、9-49、1-50、1-51、5-52hV入基因区段 及其组合。在具体的实施方案中，至少一个未重排的hJA基因区段选自JA1、JA2、JA3、 J入7及其组合。
[0058] 在一个方面，提供了包含位于内源小鼠k轻链基因座上的人VK-JK基因间区域 序列的遗传修饰的小鼠。
[0059] 在一个实施方案中，人Vk-Jk基因间区域序列在小鼠的内源k轻链基因座上， 所述基因座包含hVA和hJA基因区段，并且人Vk-Jk基因间区域序列位于hVA与hj入 基因区段之间。在具体的实施方案中，hVA和hjA基因区段能够在小鼠中重组以形成功 能性人A轻链可变结构域。
[0060] 在一个实施方案中，提供了包含多个hVA和一个或多个hJA的小鼠，并且人 Vk-JK基因间区域序列在转录方向上被置于邻近的或最3'端的hVA序列的下游和第一 个hJA序列的上游或5'端。
[0061] 在一个实施方案中，人Vk-Jk基因间区域为这样的区域，其位于人Vk4-1基因 区段的下游或3'端约130bp，人Vk4-1基因区段的3'非翻译区下游约130bp，并且横跨至 人JkI基因区段的上游或5'端约600bp。在具体的实施方案中，人Vk-Jk基因间区域 在大小上为约22. 8kb。在一个实施方案中，Vk-Jk基因间区域与从人Vk4-1基因区段的 3'非翻译区的末端延伸至人JkI基因区段的上游约600bp的人Vk-JK基因间区域具有 约90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多或约95%或更多的同一 性。在一个实施方案中，Vk-Jk基因间区域包含SEQIDN0:100。在具体的实施方案中， 乂!^十基因间区域包含3￡0爾0:100的功能性片段 。在具体的实施方案中^十基 因间区域为SEQIDN0:100。
[0062] 在一个方面，提供了包含所述的人Vk-JK基因间区域序列的小鼠、小鼠细胞（例 如，小鼠胚胎干细胞）、小鼠胚胎和小鼠组织，其中基因间区域序列是异位的。在具体的实施 方案中，异位序列置于人源化内源小鼠免疫球蛋白基因座上。
[0063] 在一个方面，提供了包含所述的人Vk-JK基因间区域序列的分离的核酸构建 体。在一个实施方案中，核酸构建体包含将人Vk-JK基因间区域序列靶向小鼠轻链基因 座的靶向臂。在具体的实施方案中，小鼠轻链基因座为K基因座。在具体的实施方案中， 靶向臂将人VK-JK基因间区域靶向修饰的内源小鼠K基因座，其中靶向是至hVA序列 与hjA序列之间的位置。
[0064]在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中小鼠包含不超过2个的轻链等位基因， 其中轻链等位基因（a)在包含小鼠基因的内源小鼠轻链基因座上包含未重排的免疫球 蛋白人和基因区段；以及，（b)在包含小鼠Q基因的内源小鼠轻链基因座上包含 未重排的免疫球蛋白 '和叉基因区段。
[0065] 在一个实施方案中，内源小鼠轻链基因座为k基因座。在另一个实施方案中，内 源小鼠轻链基因座为A基因座。
[0066] 在一个实施方案中，不超过2个的轻链等位基因选自k等位基因和A等位基因、 2个K等位基因和2个A等位基因。在具体的实施方案中，2个轻链等位基因之一为包含 C入2基因的入等位基因。
[0067]在一个实施方案中，小鼠包含一个功能性免疫球蛋白轻链基因座和一个非功能性 轻链基因座，其中所述功能性轻链基因座在包含小鼠CK基因的内源小鼠K轻链基因座上 包含未重排的免疫球蛋白人和基因区段。
[0068] 在一个实施方案中，小鼠包含一个功能性免疫球蛋白轻链基因座和一个非功能性 轻链基因座，其中所述功能性轻链基因座在包含小鼠CA基因的内源小鼠A轻链基因座上 包含未重排的免疫球蛋白人和基因区段。在一个实施方案中，CA基因为c入2。 在具体的实施方案中，小鼠C入基因与小鼠C入2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少 90%、至少95 %或至少98%的同一性。
[0069]在一个实施方案中，小鼠还包含至少一个免疫球蛋白重链等位基因。在一个实施 方案中，至少一个免疫球蛋白重链等位基因在表达人/小鼠重链的包含人重链基因的内源 小鼠重链基因座上包含人VH基因区段、人DH基因区段和人JH基因区段。在具体的实施方 案中，小鼠包含2个免疫球蛋白重链等位基因，并且小鼠表达人/小鼠重链。
[0070] 在一个实施方案中，小鼠包含第一轻链等位基因，所述第一轻链等位基因在包含 内源Ck基因的内源小鼠K基因座上包含未重排的hVK和未重排的hjK;和第二轻链等 位基因，所述第二轻链等位基因在包含内源CK基因的内源小鼠K基因座上包含未重排的 hV入和未重排的hjA。在具体的实施方案中，第一和第二轻链等位基因为遗传修饰的小鼠 的仅有的功能性轻链等位基因。在具体的实施方案中，小鼠包含非功能性A基因座。在一 个实施方案中，遗传修饰的小鼠不表达包含A恒定区的轻链。
[0071] 在一个实施方案中，小鼠包含第一轻链等位基因，所述第一轻链等位基因在包含 内源CK基因的内源小鼠k基因座上包含未重排的hVK和未重排的hjK;和第二轻链等 位基因，所述第二轻链等位基因在包含内源CA基因的内源小鼠A基因座上包含未重排的 hV入和未重排的hjA。在具体的实施方案中，第一和第二轻链等位基因是遗传修饰的小鼠 的仅有的功能性轻链等位基因。在一个实施方案中，内源CA基因为CA2。在具体的实施 方案中，小鼠CA基因与小鼠CA2具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少 95 %或至少98%的同一性。
[0072] 在一个实施方案中，小鼠包含6个免疫球蛋白等位基因，其中第一等位基因在包 含小鼠Ck基因的内源小鼠K轻链基因座包含未重排的免疫球蛋白和基因区段， 第二等位基因在包含小鼠Ck基因的内源小鼠K轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白VK和JK基因区段，第三等位基因在包含小鼠cA基因的内源小鼠A轻链基因座上包含 未重排的免疫球蛋白和基因区段，第四和第五等位基因各自独立地在包含小鼠重 链基因的内源小鼠重链基因座上包含未重排的％和DH以及义基因区段，并且第六等位基 因（a)在包含小鼠CA基因的内源小鼠A轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白VA和 J入基因区段，（b)包含无功能的A基因座，或（c)完全或部分缺失A基因座。
[0073] 在一个实施方案中，第一等位基因包含未重排的hV入和hJA。在一个实施方案 中，第二等位基因包含未重排的hVK和hjK。在一个实施方案中，第三等位基因包含未重 排的hVX和hJX。在一个实施方案中，第四和第五等位基因各自独立地包含未重排的hVH 和hDH以及hJH。在一个实施方案中，第六等位基因包含被完全或部分缺失的内源小鼠A基 因座。
[0074] 在一个实施方案中，小鼠包含6个免疫球蛋白等位基因，其中第一等位基因在包 含小鼠CA基因的内源小鼠A轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白和基因区 段，第二等位基因在包含小鼠CA基因的内源小鼠A轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋 白和基因区段，第三等位基因在包含小鼠Ck基因的内源小鼠K轻链基因座上包 含未重排的免疫球蛋白Vk和JK基因区段，第四和第五等位基因各自独立地在包含小鼠 重链基因的内源小鼠重链基因座上包含未重排的Vj^PDh以及义基因区段，并且第六等位基 因（a)在包含小鼠Ck基因的内源小鼠K轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vk和 JK基因区段，（b)包含无功能的k基因座，或（c)缺失K基因座的一个或多个元件。
[0075] 在一个实施方案中，第一等位基因包含未重排的hV入和hj入基因区段。在一个 实施方案中，第二等位基因包含未重排的hVA和hjA基因区段。在一个实施方案中，第三 等位基因包含未重排的hVK和hjK基因区段。在一个实施方案中，第四和第五等位基因 各自独立地包含未重排的hVH和hDH以及hJH基因区段。在一个实施方案中，第六等位基因 包含在功能上被沉默的内源小鼠k基因座。
[0076] 在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠包括包含重排的抗体基因的B细胞，所述抗 体基因包含有效地连接至小鼠Q结构域的重排的hVA结构域。在一个实施方案中，小鼠 匕结构域选自小鼠Ck和小鼠CA结构域。在具体的实施方案中，小鼠CA结构域来源于 C入2基因。在具体的实施方案中，小鼠CA结构域来源于与小鼠CA2具有至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA结构域。
[0077] 在一个方面，提供了在为Ck的Q上表达VA区的遗传修饰的小鼠。在一个方面， 提供了在选自人Ck、人CX或小鼠Ck的Q上表达hVX区的遗传修饰的小鼠。在一个方 面，提供了在小鼠Ck上表达hV入区的遗传修饰的小鼠。
[0078] 在一个实施方案中，约10-50%的小鼠脾细胞为B细胞（即，⑶19-阳性），或其约 9-28%表达包含融合至小鼠Ck结构域的hVA结构域的免疫球蛋白轻链。
[0079]在具体的实施方案中，约23-34%的小鼠脾细胞为B细胞（即，⑶19-阳性），或其 约9-11%表达包含融合至小鼠Ck结构域的hVA结构域的免疫球蛋白轻链。
[0080] 在具体的实施方案中，约19-31 %的小鼠脾细胞为B细胞（即，⑶19-阳性），或其 约9-17%表达包含融合至小鼠Ck结构域的hVA结构域的免疫球蛋白轻链。
[0081] 在具体的实施方案中，约21-38%的小鼠脾细胞为B细胞（S卩，⑶19-阳性），或其 约24-27%表达包含融合至小鼠Ck结构域的hVA结构域的免疫球蛋白轻链。
[0082] 在具体的实施方案中，约10-14%的小鼠脾细胞为B细胞（即，⑶19-阳性），或其 约9-13%表达包含融合至小鼠Ck结构域的hVA结构域的免疫球蛋白轻链。
[0083] 在具体的实施方案中，约31-48%的小鼠脾细胞为B细胞（即，⑶19-阳性），或其 约15-21%表达包含融合至小鼠Ck结构域的hV入结构域的免疫球蛋白轻链。在具体的实 施方案中，约30-38%的小鼠脾细胞为B细胞（即，⑶19-阳性），或其约33-48%表达包含 融合至小鼠Ck结构域的hVA结构域的免疫球蛋白轻链。
[0084] 在一个实施方案中，约52-70%的小鼠骨髓为B细胞（即，⑶19-阳性），或其约 31-47% 的未成熟B细胞（即，0)19-阳性/B220-中间阳性（intermediatepositive)/ IgM-阳性）表达包含融合至小鼠Ck结构域的hVA结构域的免疫球蛋白轻链。
[0085] 在一个实施方案中，约60%的小鼠骨髓为B细胞（S卩，⑶19-阳性），或其约38. 3% 的未成熟B细胞（即，CD19-阳性/B220中间阳性/IgM-阳性）表达包含融合至小鼠Ck结 构域的hVA结构域的免疫球蛋白轻链。
[0086] 在一个实施方案中，小鼠表达包含轻链的抗体，所述轻链包含来源于人V和人J基 因区段的可变结构域，以及来源于小鼠恒定区基因的恒定结构域。在一个实施方案中，小鼠 恒定区基因为CK基因。在另一个实施方案中，小鼠恒定区基因为cA基因。在具体的实 施方案中，CX区为CX2。在具体的实施方案中，小鼠CX基因来源于与小鼠CX2具有至 少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA基因。在 具体的实施方案中，抗体还包括包含来源于人V、人D和人J基因区段的可变结构域以及来 源于小鼠重链恒定区基因的重链恒定结构域的重链。在一个实施方案中，小鼠重链恒定区 基因包含重链恒定结构域的铰链-CH2-CH3序列。在另一个实施方案中，小鼠重链恒定区基 因包含重链恒定结构域的-铰链-CH2-CH3序列。在另一个实施方案中，小鼠重链恒定区 基因包含重链恒定结构域的(^-〇1 2-〇13-〇14序列。在另一个实施方案中，小鼠重链恒定区 基因包含重链恒定结构域的CH2-CH3-CH4序列。
[0087] 在一个实施方案中，小鼠表达包含含有重排的人VX-JX序列和小鼠Ck序列的 轻链的抗体。在一个实施方案中，重排的人VA-J入序列来源于选自3-1、4-3、2-8、3-9、 3-10、2-14、3-19、2-23、3-25、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、9-49 和 1-51 基因区段的 hV入基因区段的重排。在一个实施方案中，重排的人VA-JX序列来源于选自JM、J入2、 J入3和JA7基因区段的hJX基因区段的重排。
[0088] 在一个实施方案中，小鼠表达包含含有重排的免疫球蛋白入轻链可变区的轻 链的抗体，所述重排的免疫球蛋白A轻链可变区包含选自3-1/1、3-1/7、4-3/1、4-3/7、 2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、2-14/1、3-19/1、2-23/1、3-25/1、1-40/1、1-40/2、 1-40/3、1-40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、1-44/7、5-45/1、5-45/2、5-45/7、7-46/1、7-46/2、 7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7和1-51/1的人VA/J入序列。在具体的实施方案中，B细 胞表达抗体，所述抗体包含与小鼠重链恒定结构域融合的人免疫球蛋白重链可变结构域， 以及与小鼠k轻链恒定结构域融合的人免疫球蛋白A轻链可变结构域。
[0089] 在一个方面，提供了表达抗体的小鼠，所述抗体包含，（a)含有来源于未重排的人 重链可变区基因区段的重链可变结构域的重链，其中重链可变结构域融合至小鼠重链恒定 (CH)区；和（b)含有来源于未重排的hVA和hjA的轻链可变结构域的轻链，其中轻链可变 结构域融合至小鼠Q区。
[0090] 在一个实施方案中，小鼠包含，（i)重链基因座，其包括用所有或基本上所有功能 性人V、D和J基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠V、D和J基因区段的替换，小 鼠心基因，（ii)第一k轻链基因座，其包括用所有、基本上所有或多个功能性hVA和hj入 基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠Vk和JK基因区段的替换，以及小鼠Ck 基因，（iii)第二k轻链基因座，其包括用所有、基本上所有或多个功能性hVK和hjK基 因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠Vk和JK基因区段的替换，以及小鼠Ck基 因。在一个实施方案中，小鼠不表达包含CX区的抗体。在一个实施方案中，小鼠包括c入 基因和/或VA和/或基因区段的缺失。在一个实施方案中，小鼠包括非功能性入轻 链基因座。在具体的实施方案中，A轻链基因座被全部或部分缺失。
[0091] 在一个实施方案中，小鼠包含（i)重链基因座，其包括用所有或基本上所有功能 性人V、D和J基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠V、D和J基因区段的替换、小 鼠心基因，（ii)第一A轻链基因座，其包括用所有、基本上所有或多个功能性hVA和hj入 基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠VA和基因区段的替换，以及小鼠C入 基因，（iii)第二A轻链基因座，其包括用所有、基本上所有或多个功能性hVA和hj入基 因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠和基因区段的替换，以及小鼠CA基 因。在具体的实施方案中，小鼠CA基因为CA2。在具体的实施方案中，小鼠CA基因来源 于与小鼠C入2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %的同 一性的CX基因。
[0092] 在一个实施方案中，小鼠包括Ck基因和/或Vk和/或Jk基因区段的缺失。在 一个实施方案中，小鼠包括非功能性k轻链基因座。
[0093] 在一个方面，提供了表达抗体的遗传修饰的小鼠，其中超过10%、超过15%、超过 20%、超过25%、超过30%、超过35%、超过40%、超过60%、超过70%、超过80%或超过 90%的由小鼠产生的总IgG抗体包含入-来源的可变结构域，并且其中小鼠表达包含与小 鼠Ck区融合的k来源的可变结构域的抗体。在具体实施方案中，约15-40%、20-40%、 25-40%、30-40%或35-40%的由小鼠产生的总抗体包含入来源的可变结构域。
[0094] 在一个实施方案中，入来源的可变结构域来源于hV入和hJA。在一个实施方案 中，A来源的可变结构域存在于包含小鼠Ck区的轻链中。在具体的实施方案中，A来源 的可变区存在于包含小鼠CA区的轻链中。在另一个具体的实施方案中，CA区为CA2区。 在一个实施方案中，k来源的可变结构域来源于hVK和hjK，并且在具体的实施方案中存 在于包含小鼠Ck区的轻链中。
[0095]在一个方面，提供了包含上游同源臂和下游同源臂的分离的DNA构建体，其中上 游和下游同源臂将所述构建体靶向小鼠K基因座，并且构建体包含功能性未重排的hV入 区段和功能性未重排的hjA区段，以及选择或标记序列。
[0096] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含用于靶 向小鼠VA2上游的小鼠入序列的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择盒， 以及用于靶向小鼠JA2的3'端的小鼠A序列的靶向臂。在一个实施方案中，选择盒为 Frt'edHyg-TK盒。在一个实施方案中，3'靶向臂包含小鼠(^2、1入4、(：入4和小鼠增强子 2. 4。
[0097] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：用于 靶向VA1的5'端的小鼠入基因座的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择 盒以及用于靶向小鼠CA1的3'端的小鼠A序列的3'靶向臂。在一个实施方案中，选择 盒为loxed新霉素盒。在一个实施方案中，3'靶向臂包含小鼠A3'增强子和小鼠A3'增 强子3.1。
[0098] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含用于 革巴向V入2的5'端的小鼠入基因座的靶向臂、5'和3'侦懷连接有重组酶识别位点的选择 盒以及用于靶向小鼠J入2的3'端与小鼠CA2的5'端的小鼠入序列的3'靶向臂。在 一个实施方案中，选择盒为Frt'ed潮霉素-TK盒。在一个实施方案中，3'靶向臂包含小鼠 C入2-JX4-CX4基因区段和小鼠X增强子2. 4。
[0099] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含用于靶 向2的5'端的小鼠A基因座的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择盒、 包含从hVA3-12下游至hjA1的末端的人A轻链基因座的连续区域的人基因组片段，以 及用于靶向小鼠JA2的3'端的小鼠A序列的3'靶向臂。在一个实施方案中，选择盒为 ?1^'6(1新霉素盒。在一个实施方案中，3'靶向臂包含小鼠(：入2- 11入4-(：入4基因区段和小 鼠X增强子2. 4。
[0100] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其包含从hVX3-12下游至hjA1的末端 的人A轻链基因座的连续区域。
[0101] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含用于靶 向2的5'端的小鼠A基因座的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择盒， 以及包含从hV A 3-27下游至hV A 2-8的末端的人A轻链基因座的连续区域的人基因组片 段。在一个实施方案中，选择盒为Frt'ed潮霉素盒。在一个实施方案中，人基因组片段包 含3'靶向臂。在具体的实施方案中，3'靶向臂包含约53kb的从hVA 3-12下游至hVA 2-8 的末端的人A轻链基因座。
[0102] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其包含从hV入3-27下游至hV入3-12的末 端的人A轻链基因座的连续区域。
[0103] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：用于 靶向VA 2的5'端的小鼠入基因座的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择 盒、包含从hV A 5-52下游至hV A 1-40的末端的人A轻链基因座的连续区域的第一人基因 组片段、限制性酶位点以及包含从hV A 3-29下游至hV A 82K的末端的人A轻链基因座的 连续区域的第二人基因组片段。在一个实施方案中，选择盒为Frt'ed新霉素盒。在一个实 施方案中，限制性酶位点为归巢内切核酸酶的位点。在具体的实施方案中，归巢内切核酸酶 为Pl-Scel。在一个实施方案中，第二人基因组片段为3'靶向臂。在具体的实施方案中，3' 靶向臂包含约27kb的从hV入3-29下游至hV入82K的末端的人入轻链基因座。
[0104] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其包含从hVA5-52下游至hVA1-40的末 端的人A轻链基因座的连续区域。
[0105] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：用于 靶向内源Vk基因区段的5'端的小鼠k基因座的靶向臂、两个并置的重组酶识别位点、并 置的重组酶识别位点的3'端的选择盒以及用于靶向k轻链可变基因区段的5'端的小鼠 K序列的3'靶向臂。在一个实施方案中，并置的重组酶识别位点彼此以相反的方向放置。 在具体的实施方案中，重组酶识别位点是不同的。在另一个具体的实施方案中，重组酶识别 位点为loxP位点和10X511位点。在一个实施方案中，选择盒为新霉素盒。
[0106]在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：用 于靶向小鼠Jk基因区段的5'端的小鼠k基因座的靶向臂、选择盒、选择盒3'端的重 组酶识别位点以及用于靶向小鼠Jk基因区段的3'端与小鼠k内含增强子（intronic enhancer)的5'端的小鼠k序列的3'靶向臂。在一个实施方案中，选择盒为潮霉素-TK 盒。在一个实施方案中，重组酶识别位点在转录上处于与选择盒相同的方向。在具体的实 施方案中，重组酶识别位点为loxP位点。
[0107] 在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：包含 内源小鼠Vk基因区段的5'端的序列的第一小鼠基因组片段、第一重组酶识别位点、第二 重组酶识别位点以及包含内源小鼠Jk基因区段的3'端与小鼠k内含增强子的5'端之 间的序列的第二小鼠基因组片段。
[0108] 在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中遗传修饰包括使用上述或本文中描述 的一个或多个DNA构建体进行的修饰。
[0109]在一个方面，提供了分离的DNA构建体用于制备本文中描述的小鼠的用途。在一 个方面，提供了本文中描述的分离的DNA构建体用于产生抗原结合蛋白的方法的用途。 [0110]在一个方面，提供了非人干细胞，其包括包含上述和本文中描述的DNA构建体的 靶向载体。在一个方面，提供了非人干细胞，其中非人干细胞来源于本文中描述的小鼠。
[0111] 在一个实施方案中，非人干细胞为胚胎干（ES)细胞。在具体的实施方案中，ES细 胞为小鼠ES细胞。
[0112] 在一个方面，提供了本文中描述的非人干细胞用于产生本文中描述的小鼠的用 途。在一个方面，提供了本文中描述的非人干细胞用于产生抗原结合蛋白的用途。
[0113] 在一个方面，提供了小鼠胚胎，其中小鼠胚胎包含本文中提供的遗传修饰。在一个 实施方案中，提供了包含供体ES细胞的宿主小鼠胚胎，其中供体ES细胞包含本文中描述的 遗传修饰。在一个实施方案中，小鼠胚胎为前桑椹胚期（pre-morulastage)胚胎。在具体 的实施方案中，前桑椹胚期胚胎为4细胞期胚胎或8细胞期胚胎。在另一个具体实施方案 中，小鼠胚胎为胚泡。
[0114] 在一个方面，提供了本文中描述的小鼠胚胎用于产生本文中描述的小鼠的用途。 在一个方面，提供了本文中描述的小鼠胚胎用于产生抗原结合蛋白的用途。
[0115] 在一个方面，提供了非人细胞，其中非人细胞包含来源于本文中描述的遗传修饰 的小鼠的重排的免疫球蛋白轻链基因序列。在一个实施方案中，细胞为B细胞。在一个实 施方案中，细胞为杂交瘤。在一个实施方案中，所述细胞编码体细胞突变的免疫球蛋白轻链 可变结构域和/或免疫球蛋白重链可变结构域。
[0116] 在一个方面，提供了非人细胞，其中非人细胞包含来源于本文中描述的遗传修饰 的小鼠的重排的免疫球蛋白轻链基因序列。在一个实施方案中，细胞为B细胞。在一个实 施方案中，细胞为杂交瘤。在一个实施方案中，所述细胞编码体细胞突变的免疫球蛋白轻链 可变结构域和/或免疫球蛋白重链可变结构域。
[0117] 在一个方面，提供了本文中描述的非人细胞用于产生本文中描述的小鼠的用途。 在一个方面，提供了本文中描述的非人细胞用于产生抗原结合蛋白的用途。
[0118] 在一个方面，提供了表达免疫球蛋白轻链的小鼠B细胞，所述免疫球蛋白轻链包 含（a)来源于hVA基因区段和hJA基因区段的可变区；和（b)小鼠Q基因。在一个实施 方案中，小鼠Q基因选自Ck和CA基因。在具体的实施方案中，CA基因为CA2。在具 体的实施方案中，小鼠C入基因来源于与小鼠C入2具有至少60%、至少70%、至少80%、至 少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA基因。在一个实施方案中，小鼠B细胞还表 达关联重链，所述重链包含（c)来源于hVH，hDH，和（d)hJH区段的可变区。在一个实施方案 中，B细胞不包含重排的A基因。在另一个实施方案中，B细胞不包含重排的k基因。
[0119]在一个方面，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生抗体的方法，包括：(a)将遗传 修饰的小鼠暴露于抗原，其中小鼠具有在内源轻链基因座上包含至少一个hVA和至少一 个hJA的基因组，其中内源轻链基因座包含小鼠Q基因；(b)允许遗传修饰的小鼠产生对 抗原的免疫应答；和（c)从（b)的小鼠分离特异性识别抗原的抗体，或从（b)的小鼠分离包 含特异性识别抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，其中抗体包含来源于hVA、hjA和小鼠Q 基因的轻链。在具体的实施方案中，小鼠Q基因为小鼠Ck基因。
[0120] 在一个实施方案中，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生抗体的方法，包括：(a) 将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中小鼠具有在内源k基因座上包含至少一个hVA和在 K基因座上包含至少一个hjA的基因组，其中K基因座包含小鼠CK基因；(b)允许遗传 修饰的小鼠产生对抗原的免疫应答；和（C)从（b)的小鼠分离特异性识别抗原的抗体，或 从（b)的小鼠分离包含特异性识别抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，其中抗体包含来源于 hVX、hJX和小鼠CK基因的轻链。
[0121] 在一个实施方案中，K轻链恒定基因选自人CK基因和小鼠CK基因。
[0122] 在一个实施方案中，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生抗体的方法，包括：(a) 将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中小鼠具有在A轻链基因座上包含至少一个hV入和 在X轻链基因座上包含至少一个JA的基因组，其中A轻链基因座包含小鼠cA基因； (b)允许遗传修饰的小鼠产生对抗原的免疫应答；和（c)从（b)的小鼠分离特异性识别抗 原的抗体，或从（b)的小鼠分离包含特异性识别抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，或在B的 小鼠中鉴定编码结合抗原的重链和/或轻链可变结构域的核酸序列，其中抗体包含来源于 hV入、hJX和小鼠CA基因的轻链。
[0123]在一个实施方案中，A轻链恒定基因选自人CA基因和小鼠CA基因。在一个实 施方案中，A轻链恒定基因为人CA基因。在具体的实施方案中，人CA基因选自c入1、 C入2、CA3和CA7。在一个实施方案中，X轻链恒定基因为小鼠CA基因。在具体的实 施方案中，小鼠CX基因选自CX1、CX2和CX3。在具体的实施方案中，小鼠CX基因为 C入2。在另一个具体的实施方案中，小鼠CX基因来源于与小鼠CA2具有至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA基因。
[0124] 在一个方面，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生重排的抗体基因的方法，包括： (a)将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中所述遗传修饰在内源轻链基因座上包含hVA和 hj入，其中内源轻链基因座包含小鼠Q基因或其功能性片段；和，（b)在所述小鼠中鉴定重 排的免疫球蛋白基因，其中所述重排的免疫球蛋白基因包含A轻链可变区基因区段和Q 基因或其功能性片段。
[0125] 在一个实施方案中，该方法还包括从小鼠克隆编码重链和/或轻链可变区的核酸 序列，其中重链和/或轻链可变区来自包含人VA和小鼠Q的抗体。
[0126] 在一个实施方案中，小鼠Q基因或其功能性片段选自人Q基因和小鼠Q基因，或 其功能性片段。
[0127] 在一个实施方案中，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生重排的抗体基因的方 法，包括：(a)将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中所述遗传修饰包括在k轻链基因座上包 含hVA和hjA，其中K轻链基因座包含小鼠CK基因或其功能性片段；和（b)在所述小 鼠中鉴定重排的免疫球蛋白基因，其中重排的免疫球蛋白基因包含A轻链可变区基因区 段和CK基因或其功能性片段。
[0128] 在一个实施方案中，K轻链恒定基因或其功能性片段选自人CK基因和小鼠CK 基因或其功能性片段。
[0129] 在一个实施方案中，该方法还包括从小鼠克隆编码重链和/或轻链可变区的核酸 序列，其中重链和/或轻链可变区来自包含人和小鼠Ck的抗体。
[0130] 在一个实施方案中，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生重排的抗体基因的方 法，包括：(a)将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中所述遗传修饰在小鼠A轻链基因座上包 含hVA和hjA，其中A轻链基因座包含小鼠CA基因或其功能性片段；和，（b)在所述小 鼠中鉴定重排的免疫球蛋白基因，其中重排的免疫球蛋白基因包含A轻链可变区基因区 段和CA基因或其功能性片段。
[0131] 在一个实施方案中，入轻链恒定基因或其功能性片段选自人CA基因和小鼠C入 基因或其功能性片段。在具体的实施方案中，A轻链恒定基因为小鼠CA基因或其功能性 片段。
[0132] 在一个实施方案中，该方法还包括从小鼠克隆编码重链和/或轻链可变区的核酸 序列，其中重链和/或轻链可变区来自包含人和小鼠CA的抗体。
[0133] 在一个方面，提供了用于产生抗体的方法，包括：将本文中描述的小鼠暴露于抗 原，让小鼠产生包括产生特异性结合抗原的抗体的免疫应答，鉴定小鼠中的编码重链的重 排的核酸序列和小鼠中的编码抗体的关联轻链可变结构域序列的重排的核酸序列，其中所 述抗体特异性结合抗原，和利用融合至人恒定结构域的重链和轻链可变结构域的核酸序列 来产生期望的抗体，其中期望的抗体包括包含融合至Q结构域的VA结构域的轻链。在一 个实施方案中，VA结构域为人的并且Q结构域为人或小鼠CA结构域。在一个实施方案 中，VA结构域为小鼠的并且Q结构域为人或小鼠CK结构域。
[0134] 在一个实施方案中，提供了用于产生抗体的方法，包括：将本文中描述的小鼠暴露 于抗原，让小鼠产生包括产生特异性结合抗原的抗体的免疫应答，鉴定小鼠中的编码重链 的重排的核酸序列和小鼠中的编码抗体的关联轻链可变结构域序列的重排的核酸序列，其 中所述抗体特异性结合抗原，和利用融合至人恒定结构域的核酸序列的重链和轻链可变结 构域的核酸序列来产生期望的抗体，其中期望的抗体包括包含融合至Ck结构域的VA结 构域的轻链。
[0135] 在一个实施方案中，提供了用于产生抗体的方法，包括：将本文中描述的小鼠暴露 于抗原，让小鼠产生包括产生特异性结合抗原的抗体的免疫应答，鉴定小鼠中的编码重链 可变结构域的重排的核酸序列和编码抗体的关联轻链可变结构域序列的重排的核酸序列， 其中所述抗体特异性结合抗原，和利用融合至编码人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域 的核酸序列的所述核酸序列来产生来源于人序列的抗体，其中特异性结合抗原的抗体包括 包含融合至小鼠CA结构域的人vA结构域的轻链。
[0136] 在一个实施方案中，小鼠CX区选自CX1、CX2和CX3。在具体的实施方案中， 小鼠C入区为C入2。
[0137] 在一个方面，提供了用于产生重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，包括（a) 将本文中描述的小鼠暴露于抗原；(b)让小鼠产生免疫应答；（c)鉴定小鼠中的包含编码与 小鼠Q结构域融合的重排的人VX结构域序列的核酸序列的细胞，其中细胞还编码包含人 VH结构域和小鼠CH结构域的关联重链，并且其中细胞表达结合抗原的抗体；（d)从细胞克隆 编码人VA结构域的核酸序列和编码关联人VH结构域的核酸序列；和，（e)使用编码人V入 结构域的克隆的核酸序列和编码关联人VH结构域的克隆的核酸序列来产生完全人的抗体。
[0138] 在一个实施方案中，提供了用于产生重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，包 括（a)将本文中描述的小鼠暴露于抗原；(b)使小鼠产生免疫应答；（c)鉴定小鼠中的包含 核酸序列的细胞，所述核酸序列编码在相同核酸分子上与编码小鼠Ck结构域的核酸序列 连续的重排的人VA结构域序列，其中细胞还编码包含人VH结构域和小鼠CH结构域的关 联重链，并且其中细胞表达结合抗原的抗体；（d)从细胞克隆隆编码人VA结构域的核酸序 列和编码关联人％结构域的核酸序列；和（e)使用编码人VA结构域的克隆的核酸序列和 编码关联人VH结构域的克隆的核酸序列来产生完全人的抗体。
[0139] 在一个实施方案中，提供了用于产生重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，包 括（a)将本文中描述的小鼠暴露于抗原；(b)让小鼠产生针对抗原的免疫应答；（c)鉴定小 鼠中的包含编码与小鼠CA结构域融合的重排的人结构域序列的DNA的细胞，其中所 述细胞还编码包含人VH结构域和小鼠CH结构域的关联重链，并且其中细胞表达结合抗原的 抗体；（d)从细胞克隆编码重排的人VA结构域的核酸序列和编码关联人VH结构域的核酸 序列；和，（e)使用编码人VA结构域的克隆的核酸序列和编码关联人％结构域的克隆的 核酸序列了产生完全人的抗体。在一个实施方案中，小鼠CA结构域为小鼠CA2。在具体 的实施方案中，小鼠C入结构域来源于与小鼠C入2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至 少90%、至少95%或至少98%的同一性的CA基因。
[0140] 在一个方面，提供了表达融合至内源轻链恒定区（CJ的人A来源的轻链的遗传 修饰的小鼠，其中小鼠在用抗原免疫后，产生包含融合至小鼠Q结构域的人VA结构域的 抗体。在一个实施方案中，小鼠Q结构域选自CK结构域和CX结构域。在一个实施方案 中，小鼠Q结构域为Ck结构域。在一个实施方案中，小鼠Q结构域为CA结构域。在具 体的实施方案中，CA结构域为CX2。在具体的实施方案中，小鼠CA结构域来源于与小 鼠C入2具有至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %的同一性的 C入基因。
[0141] 在一个方面，提供了包含本文中描述的修饰的内源k或A轻链基因座的遗传修 饰的小鼠，其表达与多个免疫球蛋白重链相关的多个免疫球蛋白A轻链。在一个实施方案 中，重链包括人序列。在多个实施方案中，人序列选自可变序列、CH1、铰链、CH2、CH3及其组 合。在一个实施方案中，多个免疫球蛋白A轻链包括人序列。在多个实施方案中，人序列 选自可变序列、恒定序列及其组合。在一个实施方案中，小鼠包括失能的内源免疫球蛋白基 因座，并且从转基因或染色体外附加体表达重链和/或A轻链。在一个实施方案中，小鼠 在内源小鼠基因座上包括，利用一个或多个人免疫球蛋白序列对一些或所有内源小鼠重链 基因区段（S卩，V、D、J)和/或一些或所有内源小鼠重链恒定序列（例如，CH1、铰链、Ch2、Ch3 或其组合）和/或一些或所有内源小鼠轻链序列（例如，V、J、恒定区或其组合）的替换。
[0142] 在一个方面，提供了适用于产生具有人A来源的轻链的抗体的小鼠，其中在小鼠 中产生的所有或基本上所有抗体经表达具有人A来源的轻链。在一个实施方案中，从内源 轻链基因座表达人A来源的轻链。在一个实施方案中，内源轻链基因座为K轻链基因座。 在具体的实施方案中，K轻链基因座为小鼠K轻链基因座。
[0143] 在一个方面，提供了用于产生人抗体的A来源的轻链的方法，包括从本文中描述 的小鼠获得轻链序列和重链序列，以及使用轻链序列和重链序列来产生人抗体。
[0144] 在一个方面，提供了用于产生抗原结合蛋白的方法，包括将本文中描述的小鼠暴 露于抗原；让小鼠产生免疫应答；和从小鼠获得结合抗原的抗原结合蛋白，或从小鼠获得 用于产生结合抗原的抗原结合蛋白的序列。
[0145] 在一个方面，提供了来源于本文中描述的小鼠的细胞。在一个实施方案中，细胞选 自胚胎干细胞、多能细胞、诱导的多能细胞、B细胞和杂交瘤。
[0146] 在一个方面，提供了包含本文中描述的遗传修饰的细胞。在一个实施方案中，细胞 为小鼠细胞。在一个实施方案中，细胞选自杂交瘤和四源杂交瘤（quadroma)。在一个实施 方案中，细胞表达包含与小鼠恒定序列融合的人A可变序列的免疫球蛋白轻链。在具体的 实施方案中，小鼠恒定序列为小鼠k恒定序列。
[0147] 在一个方面，提供了来源于本文中描述的小鼠的组织。
[0148] 在一个方面，提供了本文中描述的小鼠或细胞的用于产生抗原结合蛋白的用途。 在一个实施方案中，抗原结合蛋白为人蛋白质。在一个实施方案中，人蛋白质为人抗体。
[0149] 在一个方面，提供了由本文中描述的小鼠、细胞、组织或方法产生的抗原结合蛋 白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白为人蛋白质。在一个实施方案中，人蛋白质为人抗体。
[0150] 除非另外明确地指出或从上下文中很明显的看出，否则可将本文中描述的任何实 施方案和方面彼此结合使用。通过参考随后的描述，其它实施方案对于本领域技术人员将 变得很显然。
[0151] 附图概述
[0152] 图1显示了包括VX基因区段的簇（A、B和C)以及JX和CX区对（J-C对）的 人A轻链基因座的不按比例的详细说明。
[0153] 图2显示了用于使内源小鼠A轻链基因座失活的靶向策略的不按比例的总体说 明。
[0154] 图3显示了用于使内源小鼠k轻链基因座失活的靶向策略的不按比例的总体说 明。
[0155] 图4A显示用于靶向内源小鼠入轻链基因座的具有人入轻链序列（包括12个 hVX基因区段和hjA1基因区段）的初始靶向载体（12/1-A靶向载体）的不按比例的总 体说明。
[0156] 图4B显示4个用于靶向内源小鼠k轻链基因座的具有人A轻链序列的初始靶 向载体的不按比例的总体说明，所述载体分别包括12个hVA基因区段以及hjA1基因区 段（12/1-k靶向载体）、12个hVA基因区段以及hJXl、2、3和7基因区段（12/4-k靶向 载体）、12个hVA基因区段、人VK-JK基因组序列以及hJAl基因区段（12(k)1-k靶 向载体）和12个hVX基因区段、人Vk-Jk基因组序列以及hJX1、2、3和7个基因区段 (12(k)4_k革巴向载体）。
[0157] 图5A显示了用于将40个hV入基因区段和单个hj入基因区段逐步插入小鼠入 轻链基因座内的靶向策略的不按比例的总体说明。
[0158] 图5B显示了用于将40个hV入基因区段和单个hj入基因区段逐步插入小鼠k 基因座内的靶向策略的不按比例的总体说明。
[0159] 图6显示了用于产生独特人入-k杂交靶向载体的靶向和分子工程步骤的不按比 例的总体说明，所述杂交靶向载体用于构建包含人k基因间序列、多个hJA基因区段或这 两者的杂交轻链基因座。
[0160] 图7A显示包含有效地连接至内源CA2基因的40个hV入基因区段和单个hj入 基因区段的修饰的小鼠A轻链基因座的基因座结构的不按比例的总体说明。
[0161] 图7B显示4个独立的修饰的小鼠k轻链基因座的基因座结构的不按比例的总体 说明，所述基因座包含有效地连接至内源Ck基因的40个hVA基因区段和1或4个hj入 基因区段，并且具有或不具有连续的人Vk-JK基因组序列。
[0162] 图8A显示来自野生型小鼠（WT)、对于包括人Vk-Jk基因组序列的12个hVX和 4个hJX基因区段是纯合的小鼠（12hVA-VKJK-4hJA)以及对于40个hVX和1个hj入 基因区段是纯合的小鼠（40hVX-lhJX)的针对⑶19+门控的IgA+和IgK+脾细胞的等值 线图。
[0163] 图8B显示从野生型（WT)、对于包括人Vk-Jk基因组序列的12个hV入和4个 hj入基因区段是纯合的小鼠（12hVA_VKJK-4hJA)以及对于40个hVX和1个hj入基 因区段是纯合的小鼠（40hVX-lhJX)收获的脾中的⑶19+B细胞的总数。
[0164] 图9A，在上图框中，显示了来自野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-Jk基因组序 列的40个hVX和4个JX基因区段是纯合的小鼠（40hV入-VkJk-4hJ入）的针对单线态 (singlet)门控和针对B和T细胞（分别地CD19+和CD3+)染色的脾细胞的等值线图。下图 框显示了来自野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-JK基因组序列的40个hV入和4个J入 基因区段是纯合的小鼠（40hV入-VkJk-4hJ入）的针对⑶19+门控和针对Ig入+和Igk+的 表达染色的脾细胞的等值线图。
[0165] 图9B显示从野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-Jk基因组序列的40个hV入和 4个基因区段是纯合的小鼠（40hVA-VKJK-4hJA)收获的脾中的CD19+、CD19+IgK+ 和CD19+IgX+B细胞的总数。
[0166] 图9C显示来自野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-Jk基因组序列的40个 hV入和4个基因区段是纯合的小鼠（40hVX-VKJK-4hJA)的针对CD19+门控和针 对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的脾细胞的等值线图。在各个等值线图 上标明了成熟（对于WT，72;对于40hVA-VicJic-4hJA，51)和过渡（对于WT，13;对于 40hV入-VkJk-4hJ入，22)B细胞。
[0167] 图9D显示从野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-Jk基因组序列的40个hV入和 4个基因区段是纯合的小鼠（40hVX-VKjK-4hJX)收获的脾中的⑶19+B细胞、过渡 B细胞（CDW+IgMhilgD1。）和成熟B细胞（CDig+IgMhgDhi)的总数。
[0168] 图10A，在上图框中，显示了来自野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-Jk基因组 序列的40个hVX和4个JX基因区段是纯合的小鼠（40hV入-VkJk-4hJ入）的针对B 和T细胞（分别地，CD19+和CD3+)染色的骨髓的等值线图。下图框显示了来自野生型小鼠 (WT)和对于包括人Vk-Jk基因组序列的40个hVX和4个基因区段是纯合的小鼠 (40hV入-VkJk-4hJ入）的针对CD19+门控和针对ckit+和CD43+染色的骨髓的等值线图。 祖B细胞（ProBcell)和前B细胞标示于下图框的等值线图上。
[0169] 图10B显示从野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-Jk基因组序列的40个hV入 和4个JA基因区段是纯合的小鼠（40hVA-VkJk-4hJA)的股骨收获的骨髓中的祖B细 胞（CD19+CD43+ckit+)和前B细胞（CD19+CD43-cki〇 的数目。
[0170] 图10C显示来自野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-Jk基因组序列的40个hV入 和4个基因区段是纯合的小鼠（40hVA-VKjK-4hJA)的针对单线态门控的、针对免 疫球蛋白M(IgM)和B220染色的骨髓的等值线图。未成熟的、成熟的和祖/前B细胞标示 于各个等值线图上。
[0171] 图10D显示从野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-Jk基因组序列的40个hV入 和4个基因区段是纯合的小鼠（40hVA-VKJK-4hJA)的股骨分离的骨髓中的未成熟 (B220intIgM+)和成熟（B220hiIgM+)B细胞的总数。
[0172] 图10E显示从野生型小鼠（WT)和对于包括人Vk-Jk基因组序列的40个hV入 和4个基因区段是纯合的小鼠（40hVA-VKjK-4hJA)的股骨分离的、针对未成熟 (B220intIgM+)和成熟（B220hiIgM+)B细胞门控的、针对IgX和IgK表达染色的骨髓的等值 线图。
[0173] 图11显示从在内源小鼠k轻链基因座上具有人A轻链基因序列的小鼠的脾 细胞RNA扩增的18个独立的RT-PCR克隆的V入-J入-Ck连接的核苷酸序列比对。A6 = SEQIDNO:57 ；B6 =SEQIDNO:58 ；F6 =SEQIDNO:59 ；B7 =SEQIDNO:60 ；E7 =SEQ IDNO:61 ；F7 =SEQIDNO:62 ；C8 =SEQIDNO:63 ；E12 =SEQIDNO:64 ；l-4 =SEQID NO:65 ； 1-20 =SEQIDNO:66 ；3B43 =SEQIDNO:67 ；5-8 =SEQIDNO:68 ；5-19 =SEQID N0:69 ；1010 =SEQIDN0:70 ；11A1 =SEQIDN0:71 ；7A8 =SEQIDN0:72 ；3A3 =SEQID N0:73;2-7 =SEQIDN0:74。小写碱基表示因重组过程中的突变和/或N添加而产生的非 种系碱基。由hjA1和小鼠Ck的核苷酸序列编码的构架4区域（FWR4)内的共有氨基酸 示于序列比对的底部。
[0174] 图12显示从在内源小鼠k轻链基因座上具有包括连续的人Vk-JK基因组序列 的人入轻链基因序列的小鼠的脾细胞RNA扩增的12个独立的RT-PCR克隆的VA-JA-Ck 连接的核苷酸序列比对。5-2 =SEQIDNO:87;2-5 =SEQIDNO:88; 1-3 =SEQIDNO:89; 4B-1 =SEQIDN0:90 ；3B-5 =SEQIDNO:91 ；7A-1 =SEQIDNO:92 ；5-l=SEQIDN0:93 ； 4A-1 =SEQIDN0:94 ；11A-1 =SEQIDNO:95 ；5-7 =SEQIDNO:96 ；5-4 =SEQIDN0:97 ； 2-3 =SEQIDN0:98。小写碱基表示因重组过程中的突变和/或N添加而产生的非种系碱 基。由各个人JA和小鼠Ck的核苷酸序列编码的构架4区域（FWR4)内的共有氨基酸示 于序列比对的底部。
[0175] 图13显示从在内源小鼠A轻链基因座上具有人A轻链基因序列的小鼠的脾细 胞RNA扩增的3个独立RT-PCR克隆的V入-J入-C入连接的核苷酸序列比对。2D1 =SEQID N0:101 ;2D9 =SEQIDN0:102 ;3E15 =SEQIDN0:103。小写碱基表示因重组过程中的突 变和/或N添加而产生的非种系碱基。由hjA1和小鼠CA2的核苷酸序列编码的构架4 区域（FWR4)内的共有氨基酸示于序列比对的底部。
[0176] 发明详述
[0177] 虽然详细地论述了不同实施方案的具体特征，但具体方面、实施方案和实施例的 描述不限制权利要求的主题；权利要求描述了本发明的范围。本文中使用的所有术语和短 语包括本领域中通常赋予它们的含义。
[0178] 术语"连续的"是指，在相同核酸分子上的存在，例如，如果两个核酸序列存在于相 同核酸分子上但被另一个核酸序列中断，则它们是"连续的"。例如，重排的V(D)J序列与恒 定区基因序列是"连续的"，虽然V(D)J序列的最后一个密码子之后并未紧接恒定区序列的 第一个密码子。在另一个实例中，如果两个V基因区段序列存在于相同的基因组片段上，则 它们是"连续的"，尽管它们可被不编码V区域的密码子的序列隔开，例如它们可被调控序 列例如启动子或其它非编码序列隔开。在一个实施方案中，连续序列包括包含如在野生型 基因组中发现的排列的基因组序列的基因组片段。
[0179] 短语"来源于"，当在"来源于"引述的基因或基因区段的可变区方面使用时，包括 使序列追溯至特定未重排的基因区段的能力，所述未重排的基因区段经重排以形成表达可 变结构域的基因（在适用的情况下，解释剪接差异和体细胞突变）。
[0180] 短语"功能性"，当在可变区基因区段或连接基因区段方面使用时，是指在表达的 抗体库中的使用；例如，在人基因区段中3-1、4-3、2-8等是功能性的，而VA基因区段 3-2、3-4、2-5等是非功能性的。
[0181] "重链基因座"包括染色体例如小鼠染色体上的位置，其中在野生型小鼠中发现重 链可变区（VH)、重链多样性区（DH)、重链连接区（JH)和重链恒定区（CH)DNA序列。
[0182] "k基因座"包括染色体例如小鼠染色体上的位置，其中在野生型小鼠中发现K 可变区（Vk)、K连接区（JK)和K恒定区（Ck)DNA序列。
[0183] "入基因座"包括染色体例如小鼠染色体上的位置，其中在野生型小鼠中发现入 可变区（vx)、X连接区（JX)和X恒定区（CX)DNA序列。
[0184] 术语"未重排的"包括免疫球蛋白基因座的这样的状态，其中V基因区段和J基因 区段（对于重链，还有D基因区段）分开地存在，但能够被连接以形成包含V(D)J库的单个 V、0)、J的重排的V〇)J基因。
[0185] 表达人入可变结构域的小鼠
[0186] 先前已报导了表达完全人或部分人且部分小鼠的抗体的小鼠。 VELOCIMMUNE?基因工程小鼠包括，利用人v(D)j基因区段对内源小鼠基因座 上的未重排的v(D)j基因区段的替换。VELOOMMUNE?小鼠表达具有人可变结 构域和小鼠恒定结构域的嵌合抗体（参见，例如，美国专利7,605, 237)。大部分其它报导 涉及，在具有失能的内源免疫球蛋白基因座的小鼠中从完全人转基因表达完全人抗体的小 鼠。
[0187] 抗体轻链由两个分开的基因座：kappa(k)和lambdaO)之一编码。小鼠抗体轻 链主要为k型。产生小鼠抗体的小鼠和产生完全人或嵌合人-小鼠抗体的修饰的小鼠在 轻链使用上显示偏爱性。人也显示轻链偏爱性，但不像小鼠这样明显；小鼠的K轻链对入轻链的比率为约95:5,然而在人中，该比率为约60:40。小鼠中的更明显的偏爱性据认为不 会严重地影响抗体多样性，因为在小鼠中，A可变基因座并不是如此多样的。在人中情况 则不同。人A轻链基因座是丰富多样的。
[0188] 人A轻链基因座延伸超过1，OOOkb并且包含超过80个编码可变（V)或连接（J) 区段的基因（图1)。在人A轻链基因座内，超过一半的所有观察到的VA结构域由基因区 段1-40、1-44、2-8、2-14和3-21编码。总体上，约30个左右的人V入基因区段据认为是功能 性的。存在7个JA基因区段，其中仅4个被认为是通常具有功能的基因区段--J入1、 J入2、J入3和J入7。
[0189] 人中的A轻链基因座在结构上与小鼠和人中的K基因座相似，因为人A轻链基 因座具有几个能够重组以形成功能性轻链蛋白质的可变区基因区段。人A轻链基因座包 含约70个V基因区段和7个JA-CX基因区段对。此类JA-CX基因区段对中仅有4个 显示是功能性的。在一些等位基因中，第五JA-CA基因区段对据报导为假基因（CA6)。 70V入基因区段显示包含38个功能性基因区段。70个VA序列排列在3个簇中，其全都包 含不同V基因家族组的不同成员（A、B和C簇；图1)。这是用于在非人动物中产生具有人 V区域的抗体的相对未利用的多样性的潜在丰富资源。
[0190] 形成鲜明对比地，小鼠入轻链基因座仅包含2个或3个（取决于品系）小鼠V入 区基因区段（图2)。至少因为该原因，小鼠中的严重的k偏爱性据认为对总的抗体多样性 不是特别有害。
[0191] 根据小鼠入轻链基因座的已公布的图谱，该基因座基本上由在约200kb的跨度 内的两个基因区段簇组成（图2)。这两个簇包含两组能够独立地重排的V、J和C基因： V入2-J入2-C入2-J入4-C入4和V入1-J入3-C入3-J入1-C入1 〇虽然已发现V入2与所有J入 基因区段重组，但VA1显示只与CA1重组。CA4据认为是具有缺陷性剪接位点的假基因。
[0192] 小鼠k轻链基因座明显不同。来自小鼠K基因座的参与导致功能性轻链蛋白的 重组事件的基因区段的结构和数目要复杂得多（图3)。因此，小鼠A轻链未对一般小鼠中 的抗体群体的多样性作出巨大贡献。
[0193] 在小鼠中利用人入轻链基因座的丰富多样性，特别地，将很可能产生用于轻链V 结构域的更完全的人库的来源。先前利用该多样性的尝试使用包含大量随机整合入小鼠基 因组的人入轻链基因座的人转基因（参见，例如，US6, 998, 514和US7, 435, 871)。包含此 类随机整合的转基因的小鼠据报导表达完全人A轻链，然而，在一些情况下，一个或两个 内源轻链基因座保持完整。该情形是不想要的，因为人A轻链序列与小鼠轻链（K或入） 在小鼠的表达的抗体库中相对抗。
[0194] 相比之下，本发明人描述了遗传修饰的小鼠，其能够从小鼠轻链基因座直接表达 一个或多个A轻链核酸序列，包括通过内源小鼠轻链基因座上的替换。能够从内源基因座 表达人A轻链序列的遗传修饰的小鼠可被进一步培育成包含人重链基因座，从而可用于 表达包含完全人的V区（重链和轻链）的抗体的小鼠。在多种实施方案中，V区与小鼠恒 定区一起表达。在多种实施方案中，内源小鼠免疫球蛋白基因区段不存在并且V区与人恒 定区一起表达。此类抗体被证明在许多应用（诊断以及治疗）中是有用的。
[0195] 对于在小鼠中表达来源于人VA和基因区段的结合蛋白的各种实施方案，可 实现许多有利方面。可通过将人A序列置于内源轻链基因座例如小鼠K或A基因座上 来实现有利方面。从此类小鼠产生的抗体可具有包含融合至小鼠Q区（特别地小鼠CK或 C入区）的人VA结构域的轻链。小鼠还将表达人VA结构域，所述人VA结构域适于与人 Q区（特别地Ck和/或CA区）一起用于鉴定和克隆。因为此类小鼠中的B细胞发育在 其它方面是正常的，所以能够在CA或Ck区的背景中产生相容的结构域（包括体细 胞突变的VA结构域）。
[0196]描述了在免疫球蛋白k或A轻链基因座上包含未重排的VA基因区段的遗传修 饰的小鼠。描述了表达包含具有融合至CK和/或CA区的人结构域的轻链的抗体的 小鼠。
[0197]免疫球蛋白k轻链基因座的不表达转录物（SterileTranscript)
[0198] 在小鼠中表达人免疫球蛋白A序列的主题的变化反映在能够进行此类表达的遗 传修饰的小鼠的不同实施方案上。因此，在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠包含来自人基 因座的某些非编码序列。在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠在内源K轻链基因座上包含 人和基因区段，并且还包含人K轻链基因组片段。在具体的实施方案中，人K轻 链基因组片段为在人VK基因区段与人JK基因区段之间天然发现的非编码序列。
[0199] 人和小鼠k轻链基因座包含编码不表达转录物的序列，所述转录物不存在起始 密码子或开放阅读框架，并且被当作是调控K轻链基因座的转录的元件。此类不表达转录 物产生自位于最接近的VK基因区段的下游或3'端与处于K轻链恒定区基因（CK)的上 游的K轻链内含增强子（EKi)的上游或5'端之间的基因间序列。不表达转录物产生自 基因间序列的重排（以形成融合至CK的VKjKl区段）。
[0200] 处于Ck基因的上游的K轻链基因座的替换可除去编码不表达转录物的基因间 区域。因此，在多种实施方案中，利用人A轻链基因区段对小鼠CK基因上游的小鼠K轻 链序列的替换将导致人源化小鼠K轻链基因座，所述基因座包含人VA和基因区段但 不包含编码不表达转录物的K轻链基因间区域。
[0201] 如本文中所描述的，利用人A轻链基因区段对内源小鼠K轻链基因座的人源化 (其中人源化除去基因间区域）导致，与A轻链使用的显著增加偶联的K轻链基因座的使 用的显著下降。因此，虽然不存在基因间区域的人源化小鼠是有用的（因为其可产生具有 人轻链可变结构域（例如，人A或K结构域）的抗体），但是来自基因座的使用减少。
[0202] 还描述了，利用人和基因区段对内源小鼠K轻链基因座的人源化，该人 源化偶联人K基因间区域的插入以产生基因座，所述基因座在转录上在最后一个人 V入基因区段与第一个人基因区段之间包含K基因间区域；所述基因座与不存在K基 因间区域的基因座相比，在B细胞群体中显示了更高的表达。该观察结果与这样的假说相 符：基因间区域一通过不表达转录物直接地，或间接地一抑制内源A轻链基因座的使用。 在这样的假说下，包括所述基因间区域将导致内源A轻链基因座的使用减少，从而使得小 鼠限制性选择，但利用修饰的至K)基因座来产生抗体。
[0203]在不同的实施方案中，利用人A轻链序列对小鼠Ck基因上游的小鼠K轻链序 列的替换还在转录方向上包括，置于最3'端的VA基因区段的3'非翻译区与第一个人J入 基因区段的5'端之间的人k轻链基因间区域。或者，这样的基因间区域可通过在内源入 轻链基因座中产生缺失而从替换的内源k轻链基因座（在小鼠Ck基因的上游）省略。同 样地，在该实施方案下，小鼠从包含人A轻链序列的内源K轻链基因座产生抗体。
[0204] 工程化小鼠以表达人VX结构域的方法
[0205] 描述了产生遗传修饰的小鼠的各种方法，所述遗传修饰的小鼠产生包含具有融合 至内源CJ例如Ck或CA)区的人结构域的轻链的抗体。描述了遗传修饰，在不同的 实施方案中，所述遗传修饰包括一个或两个内源轻链基因座的缺失。例如，为了从内源抗体 库消除小鼠A轻链，可进行第一VA-JA-CA基因簇的缺失和利用人VA-JA基因区段完 全或部分地替换第二基因簇的VA-JA基因区段。还提供了遗传修饰的小鼠的胚胎、细胞， 以及用于产生所述小鼠、小鼠胚胎和细胞的靶向构建体。
[0206] -个内源VX-JX-CX基因簇的缺失和另一个内源VX-JX-CX基因簇的 V入-JA基因区段的替换，在不同的实施方案中，对动物的天然抗体恒定区的缔合和功能具 有相对最小的破坏，因为内源CA基因保持完整并从而保持正常的功能性和与内源重链恒 定区缔合的能力。因此，在此类实施方案中，取决于用于装配包含2条重链和2条轻链的功 能性抗体分子的功能性轻链恒定区，修饰不影响其它内源重链恒定区。此外，在不同实施方 案中，修饰不影响包括内源重链和轻链（例如连接至小鼠CA区的hVA结构域）的功能性 膜结合的抗体分子的装配。因为至少一个功能性CA基因保留在内源基因座上，所以包括 利用人基因区段对内源VA-JX-CX基因簇的VA-JX基因区段的替换的动物应 当能够产生正常A轻链，所述轻链能够在免疫应答中通过存在于动物的表达的抗体库中 的人VA-JA基因区段结合抗原。
[0207] 在图2中提供了缺失的内源小鼠V入-J入-C入基因簇的示意性说明（未按比例）。 如所说明的，小鼠A轻链基因座被组织成2个基因簇，所述两个基因簇都包含能够重组以 形成功能性小鼠入轻链的功能性基因区段。内源小鼠V入1-J入3-C入3-J入1-C入1基因簇 被具有侧翼连接重组位点的新霉素盒的靶向构建体（靶向载体1)缺失。另一个内源基因 簇（V入2-VX3-J入2-C入2-J入4-C入4)被具有侧翼连接有重组位点的潮霉素-胸苷激酶盒 的靶向构建体（靶向载体2)部分缺失。在该第二靶向事件中，CA2-JA4-CA4内源基因 区段得到保留。使用与第一靶向构建体（靶向载体1)不同的重组位点构建第二靶向构建 体（靶向载体2)，从而允许在已实现成功靶向后选择性缺失选择盒。所得的双靶向基因座 在功能上被沉默，因为不能产生内源A轻链。该修饰的基因座可用于插入人和基 因区段以产生包含人和基因区段的内源小鼠A基因座，由此在修饰的基因座上重 组后，动物产生包含连接至内源小鼠CA基因区段的重排的人和基因区段的入轻 链。
[0208] 在不同的实施方案中，遗传修饰小鼠以使得内源A基因区段不具有功能，这导致 在其抗体库中只显示K轻链的小鼠，从而产生可用于评估A轻链在免疫应答中的作用以 及可用于产生包含Vk结构域但不包含VA结构域的抗体库的小鼠。
[0209] 表达已在内源小鼠入轻链基因座上重组的连接至小鼠CA基因的hV入的遗传修 饰的小鼠可由本领域已知的任何方法产生。图4A中提供了，利用人VA和基因区段对 内源小鼠VA2-VA3-JA2基因区段的替换的示意性说明（未按比例）。如所说明的，内源 小鼠A轻链基因座（已使其无功能）被包括侧翼连接有重组位点的新霉素盒的靶向构建 体（12/1-A靶向载体）替换。VA2-VA3-JA2基因区段被包含含有12个hVA基因区段 和单个hjA基因区段的人A序列的基因组片段置换。
[0210] 因此，该第一方法在内源A轻链基因座上放置了与单个hJA基因区段连续的一 个或多个hVA基因区段（图4A)。
[0211] 可通过使用类似的技术来实现对修饰的内源A轻链基因座的进一步修饰（以插 入更多的hVA基因区段）。例如，在图5A中提供了，用于逐步插入额外的人hVA基因区段 的两个另外的靶向构建体（+16-A和+12-X靶向载体）的示意性说明。如所说明的，使用 由先前插入的人A轻链序列提供的同源性，在连续的步骤中将包含特定人hVA基因区段 的另外的基因组片段插入修饰的内源A轻链基因座。通过依次与每一个说明的靶向构建 体重组，将28个另外的hVA基因区段插入修饰的内源A轻链基因座。这产生了嵌合基因 座，所述基因座产生包含连接至小鼠CA基因的人基因区段的A轻链蛋白质。
[0212] 在小鼠入基因座上插入人入轻链基因区段的上述方法保持位于CA2-JA4-C入4 基因区段下游的增强子（命名为Enh2. 4、Enh和Enh3. 1，图4A和图5A)。该方法在内源小 鼠入轻链基因座上导致单个修饰的等位基因（图7A)。
[0213] 提供了用于产生表达包含有效地连接至小鼠CA基因区段的hV入和基因区 段的轻链的小鼠的组合物和方法，包括用于产生从内源小鼠A轻链基因座表达此类基因 的小鼠的组合物和方法。所述方法包括，选择性地使一个内源小鼠VA-JA-cA基因簇丧 失功能（例如，通过靶向缺失），并在内源小鼠入轻链基因座上使用hv入和基因区段， 以在小鼠中表达hVX结构域。
[0214] 或者，在第二方法中，可将人A轻链基因区段置于内源K轻链基因座上。在不同 的实施方案中，遗传修饰包括内源K轻链基因座的缺失。例如，为了从内源抗体库消除小 鼠K轻链，可进行小鼠VK和JK基因区段的缺失。还提供了遗传修饰的小鼠胚胎、细胞， 以及用于产生所述小鼠、小鼠胚胎和细胞的靶向构建体。
[0215] 由于上述原因，小鼠Vk和Jk基因区段的缺失使用相对最小的破坏。在图3中 提供了，缺失的小鼠VK和JK基因区段的示意性说明（未按比例）。通过位于两个精确定 位的靶向载体（各自使用位点特异性重组位点）之间的小鼠序列的重组酶介导的缺失，来 缺失内源小鼠VK和JK基因区段。将第一靶向载体（JK靶向载体）用于第一靶向事件 以缺失小鼠JK基因区段。将第二靶向载体（VK靶向载体）用于第二随后的靶向事件，以 缺失位于最远端的小鼠VK基因区段的5'端的序列。两个靶向载体都包含位点特异性重 组位点，从而允许在实现成功靶向后选择性缺失两个选择盒和所有其间的小鼠K轻链序 列。所得的经缺失的基因座在功能上被沉默，因为不能产生内源K轻链。该修饰的基因座 可用于插入hVX和基因区段以产生包含hVX和基因区段的内源小鼠K基因座， 从而在修饰的基因座上重组后，动物产生包含有效地连接至内源小鼠CK基因区段的重排 的hVA和基因区段的A轻链。可将不同的包含人A轻链序列的靶向载体与该缺失 的小鼠K基因座结合使用，以产生包含与小鼠CK区有效连接的人A基因区段的杂交轻 链基因座。
[0216] 因此，第二方法将一个或多个人VA基因区段置于小鼠K轻链基因座上，与单个 人基因区段连续（12/1-k靶向载体，图4B)。
[0217] 在不同的实施方案中，可改进该方法以添加基因区段和/或调控序列，从而优化 小鼠抗体库内来自小鼠K基因座的人A轻链序列的使用。
[0218] 在第三方法中，将一个或多个hV入基因区段置于小鼠k轻链基因座上，与4个 hj入基因序列连续（12/4-k靶向载体，图4B)。
[0219] 在第三方法中，将一个或多个hV入基因区段置于小鼠k轻链基因座上，与人k 基因间序列和单个hJA基因序列连续（12(k)1-k靶向载体，图4B)。
[0220] 在第四方法中，将一个或多个hV入基因区段置于小鼠k轻链基因座上，与人k 基因间序列和4个hJA基因序列连续（12(04-k靶向载体，图4B)。
[0221] 在小鼠k基因座上插入人A轻链基因区段的所有上述方法维持在Ck基因上游 的K内含增强子元件（命名为EKi，图4B和图5B)和在CK基因下游的3'K增强子（命 名为Ek3'，图4B和图5B)。所述方法在内源小鼠k轻链基因座上导致4个分开的修饰的 等位基因（图7B)。
[0222] 在不同的实施方案中，遗传修饰的小鼠包括内源小鼠A轻链基因座的敲除。在一 个实施方案中，通过缺失横跨VA2至JA2的区域和横跨VA1至CA1的区域的策略来敲 除A轻链基因座（图2)。减小或消除内源A轻链基因座表达内源A结构域的能力的任 何策略适合于与本公开内容中的实施方案一起使用。
[0223] 来自遗传修饰的小鼠的A结构域抗体
[0224] 在小鼠k或A轻链基因座上包含人A序列的小鼠将表达包含融合至小鼠CJCk 或CA)区的hVA区的轻链。将此类小鼠有利地培育成这样的小鼠，所述小鼠（a)包含在 功能上被沉默的轻链基因座（例如，内源小鼠k或A轻链基因座的敲除）；(b)包含含有 有效地连接至内源小鼠CA基因的hV和hj基因区段的内源小鼠A轻链基因座；（c)包含 含有有效地连接至内源小鼠Ck基因的hVK和hjK基因区段的内源小鼠K轻链基因座； 和，（d)这样的小鼠，其中一个K等位基因包含hVK和hjK;另一个K等位基因包含hv入 和hjA;-个A等位基因包含hvA和hjA并且一个A等位基因被沉默或敲除，或两个 入等位基因都包含hvx和hjx;和，两个重链等位基因各自包含hVH、hDdPhJH。
[0225] 通过将编码hV入结构域的核酸克隆入具有编码人CA的基因的表达构建体，来将 包含在CK或CA的背景中表达的hVA结构域的抗体用于产生完全人抗体。将所得的表 达构建体转染入适当的宿主细胞，以表达显示融合至hex的完全hvx结构域的抗体。 实施例
[0226] 下列实施例被提供用以描述如何产生和使用本发明的方法和组合物，并且无意限 制本发明人所认定的本发明的范围。除非另外指出，否则温度以摄氏度表示，并且压力为大 气压或接近大气压。
[0227] 实施例I
[0228] 小鼠免疫球蛋白轻链基因座的缺失
[0229] 使用VELOCIGENE?技术（参见，例如，美国专利6, 586, 251和Valenzuela 等人(2003)High-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwith high-resolutionexpressionanalysis,NatureBiotech. 21 (6) :652_659)产生各种革巴向 构建体来修饰小鼠基因组细菌人工染色体（BAC)文库，以使小鼠k和A轻链基因座失活。
[0230] 小鼠X轻链基因座的缺失。通过同源重组修饰来自小鼠BAC克隆 1^23-1351^15(11^壮(^11)的0嫩，以通过￥入-11入-(：入基因簇的靶向缺失来使内源小鼠入 轻链基因座失活（图2)。
[0231] 简而言之，使用靶向载体在单个靶向事件中缺失包含VA1-JA3-CA3-JA1-C入1 基因区段的整个近端簇，所述靶向载体包含侧翼连接有loxP位点的新霉素盒，具有包含 V入1基因区段5'端的序列的5'小鼠同源臂和包含CX1基因区段3'端的序列的3'小鼠 同源臂（图2,靶向载体1)。
[0232] 制备第二靶向构建体以精确地缺失包含VX2-JX2-CX2-JX4-CX4的远端内源 小鼠A基因簇，除了靶向构建体包含含有VA2基因区段5'端的序列的5'小鼠同源臂和含 有内源CX2基因区段5'端的序列的3'小鼠同源臂外（图2,靶向载体2)。因此，第二靶向 构建体精确地缺失VA2-JA2,同时在内源小鼠入基因座上留下完整的CA2-JA4-C入4。 通过本领域已知的核型分析和筛选方法（例如，Taqman? )确认包含灭活的内源入基 因座（如上文中描述的）的ES细胞。随后从修饰的ES细胞分离DNA，将其经历利用CRE重组酶的处理，从而介导包含新霉素标记基因的近端靶向盒的缺失，仅在缺失点留下单个 loxP位点（图2,下图）。
[0233] 小鼠k轻链基因座的缺失。使用类似的上述方法产生几个靶向构建体，以通过同 源重组修饰来自小鼠BAC克隆RP23-302gl2和RP23-254m04 (Invitrogen)的DNA，从而在两 步法中使小鼠k轻链基因座失活（图3)。
[0234] 简而言之，使用靶向载体在单个靶向事件中缺失内源小鼠k轻链基因座的Jk基 因区段（1-5)，所述靶向载体包含潮霉素-胸苷激酶（hyg-TK)盒，且在hyg-TK盒的3'端含 有单个loxP位点（图3，Jk靶向载体）。用于产生该靶向载体的同源臂包含在内源小鼠 JK基因区段的5'和3'端的小鼠基因组序列。在第二靶向事件中，制备第二靶向载体以 缺失最远端的内源小鼠Vk基因区段的上游（5'）的小鼠基因组序列的部分（图3，Vk靶 向载体）。该靶向载体包含反向l〇x511位点、loxP位点和新霉素盒。用于产生该靶向载体 的同源臂包含在最远端的小鼠Vk基因区段上游的小鼠基因组序列。依次（即，JK然后 Vk)将靶向载体用于靶向ES细胞中的DNA。通过本领域已知的核型分析和筛选方法（例 如，Taqman?)确认具有双革巴向的染色体（即，被两个革巴向载体革巴向的单个内源小鼠k基因 座）的ES。随后从修饰的ES细胞分离DNA，将其经历利用Cre重组酶的处理，从而介导内 源小鼠Vk基因区段和两个选择盒的缺失，同时以彼此相反的方向留下两个并置的l〇x位 点（图 3,下图；SEQIDN0:1)。
[0235] 因此，产生了两个包含完整增强子和恒定区的修饰的内源轻链基因座（k和入）， 用于以精确地方式使用下述靶向载体逐步插入未重排的人A种系基因区段。
[0236] 实施例II
[0237] 用人X轻链微小-基因座（Mini-Locus)对小鼠轻链基因座的替换
[0238] 工程化多个靶向载体以将人A基因区段逐步插入内源小鼠K和A轻链基因座 (使用类似的上述方法）。对内源轻链基因座进行多个独立的初始修饰，每一个修饰产生包 含有效地连接至小鼠轻链恒定基因和增强子的hVA和基因区段的嵌合轻链基因座。
[0239] 包含12个人VX和1个人基因区段的人X微小-基因座。使用称为 RPll-729g4的BAC克隆（Invitrogen)，对一系列初始靶向载体进行工程化以包含来自A簇 的前12个连续的人VA基因区段和hjA1基因区段或4个hjA基因区段。图4A和4B分 别显示了被构建用于产生人A轻链基因区段在小鼠A和K轻链基因座上的初始插入的 靶向载体。
[0240] 对于第一组初始靶向载体，工程化来自729g4BAC克隆的包含12个hVX基因区段 和hJA1基因区段的124, 125bpDNA片段，以在hJA1基因区段的996bp下游（3'）包含 Pl-Scel位点，用于连接3'小鼠同源臂。不同的两组同源臂用于连接至该人片段；一组同 源臂包含来自135kl5BAC克隆的内源小鼠X序列（图4A)，另一组包含分别来自小鼠BAC 克隆RP23-302gl2和RP23-254m04的小鼠Vk和Jk基因区段的5'和3'端的内源k序 列（图4B)。
[0241]对于12/1-入靶向载体（图4A)，在实施例1中描述的修饰的小鼠入基因座的包 含小鼠C入2-J入4-C入4和增强子2. 4的27, 847bpDNA片段的5'末端上进行Pl-Scel位 点的工程化。通过将约28kb小鼠片段连接至约124kb人A片段而将其用作3'同源臂，这 产生了从5'至3'包含hJAl基因区段、在hJAl基因区段3'端的996bp的人入序列、 在小鼠CX2基因5'端的1229bp的小鼠X序列、小鼠CX2基因和约28kb小鼠片段的剩 余部分的3'连接。人VA3-12基因区段的上游（5'）是在5'小鼠同源臂的起点之前的另 外1456bp的人入序列，所述5'小鼠同源臂包含相应于内源小鼠入基因座5'端的序列的 23,792bp的小鼠基因组DNA。在5'同源臂与人A序列的起点之间的是侧翼连接有Frt位 点的新霉素盒。
[0242] 因此，12/1-X靶向载体从5'至3'包括，5'同源臂（包含内源X基因座5'端的 约24kb的小鼠入基因组序列）、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约123kb的人基因组 入序列（包含前12个连续的hV入基因区段和hJAl基因区段）、PI_SceI位点和3'同源 臂（包含约28kb的小鼠基因组序列，包括内源CA2-JA4-CA4基因区段、小鼠增强子2. 4 序列和增强子2. 4下游（3'）的另外的小鼠基因组序列）（图4A)。
[0243] 以类似的方式，12/1-k靶向载体（图4B)使用相同的约124人A片段，除了使用 包含小鼠k序列的小鼠同源臂，以便可通过同源重组实现对内源K基因座的靶向外。因 此，12/1-k靶向载体从5'至3'包括，5'同源臂（包含内源k基因座5'端的约23kb的 小鼠基因组序列）、I_CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约124kb的人基因组入 序列（包含前12个连续的hVA基因区段和hjA1基因区段）、Pl-Scel位点和3'同源臂 (包含约28kb的小鼠基因组序列，包括内源小鼠Ck基因、EKi和Ek3'以及Ek3'下游 (3'）的另外的小鼠基因组序列）（图4B，12/1-k靶向载体）。
[0244] 与这两个初始靶向载体之一的同源重组产生了修饰的小鼠轻链基因座（K或 入），其包含有效地连接至内源小鼠轻链恒定基因和增强子（cK或cA2以及EKi/EK3' 或Enh2. 4/Enh3. 1)基因的12个hV入基因区段和hJAl基因区段，所述基因座在重组后 导致嵌合A轻链的形成。
[0245] 具有12个人VA和4个人基因区段的人A微小基因座。在将多样性添加至 嵌合A轻链基因座的另一个方法中，将第三初始靶向载体工程化，以将来自A簇的前12个 连续的人VA基因区段和hJA1、2、3和7基因区段插入小鼠k轻链基因座（图4B，12/4-k 革巴向载体）。通过从头DNA合成（IntegratedDNATechnologies)产生包含hjX1、J入2、 J入3和JA7基因区段的DNA区段，其包含每一个JA基因区段和来自每一个JA基因区段 的紧邻5'和3'区域的约100bp的人基因组序列。将Pl-Scel位点工程化至该约lkbDNA 片段的3'末端，并且连接至氯霉素盒。从相对于人BAC克隆729g4的hJAl基因区段在 5'和3'位置上的人入序列PCR扩增同源臂。在修饰的729g4BAC克隆上进行利用该中间 靶向载体的同源重组，所述修饰的729g4BAC克隆先前已利用侧翼连接有Frt位点的新霉素 盒靶向人VA3-12基因区段的上游（5'），其还在5'Frt位点的5'端包含I-CeuI位点。双 靶向的729g4BAC克隆从5'至3'包含I-CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约 123kb的片段（包含前12个hV入基因区段）、约lkb的片段（包含人1、2、3和7基因 区段）、PI-SceI位点和氯霉素盒。用I-CeuI和Pl-Scel-起降解该中间靶向载体，随后将 其连接入修饰的小鼠BAC克隆（上文中描述的）以产生第三靶向载体。
[0246] 该连接导致用于将人入序列插入内源k轻链基因座的第三靶向载体，所述第三 靶向载体从5'至3'包括，5'小鼠同源臂（包含内源小鼠k基因座5'端的约23kb的基 因组序列）、I-CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约123kb片段（包含前12个 hV入基因区段）、约lkb的片段（包含hJXl、2、3和7基因区段）、PI-SceI位点和3'同源 臂（包含约28kb的小鼠基因组序列，包括内源小鼠Ck基因、EKi和Ek3'以及Ek3'下 游（3'）的另外的小鼠基因组序列（图4B，12/4-k靶向载体）。利用该第三靶向载体的同 源重组产生包含有效地连接至内源小鼠Ck基因的12个hVA基因区段和4个hJA基因 区段的修饰的小鼠k轻链基因座，所述基因座在重组后导致嵌合人A/小鼠K轻链的形 成。
[0247] 具有整合的人k轻链序列的人A微小基因座。以类似的方式将两个另外的靶向 载体（与经工程化用于产生人A基因区段至内源K轻链基因座中的初始插入的那些靶向 载体（图4B，12/1-k和12/4-k靶向载体）相似）工程化，以通过使用独特地构建的靶向 载体（包含连续的人A和K基因组序列）逐步地插入人A轻链基因区段。此类靶向载 体被构建来包括天然地位于人Vk4-1与Jk1基因区段之间的约23kb人k基因组序列。 将该人k基因组序列特别地置于这两个另外的靶向载体中的人VA与人基因区段之 间（图 4B，12(k)1-k和 12(k)4-k靶向载体）。
[0248] 使用上述修饰的RPll_729g4BAC克隆产生包含人k基因组序列的两个靶向载体 (图6)。利用侧翼连接有Notl和AsiSI限制位点的壮观霉素选择盒靶向该修饰的BAC克 隆（图6,左上）。利用壮观霉素盒的同源重组导致双靶向的729g4BAC克隆，所述克隆从 5'至3'包括，I-CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约123kb片段（包含前12 个hVA基因区段）、位于hVA3-1基因区段的九聚物序列下游（3'）约200bp的Notl位点、 壮观霉素盒和AsiSI位点。将包含人k序列的单独的人BAC克隆（CTD-2366jl2)以独立 的两次靶向在hVK4-1与hjK1基因区段之间的位置上的工程化限制位点，以允许随后克 隆约23kb的片段，用于与双靶向的修饰的729g4BAC克隆中包含的hVX基因区段连接（图 6,上右）。
[0249] 简而言之，2366jl2BAC克隆在大小上为约132kb并且包含hVK基因区段1-6、 1-5、2-4、7-3、5-2、4-1、在￥1^基因区段下游的人1^基因组序列、}^1^基因区段1-5、11(^ 和约20kb的人k基因座的另外的基因组序列。首先用靶向载体靶向该克隆，所述靶向载体 包含侧翼连接有Frt位点的潮霉素盒和在3'Frt位点下游（3'）的Notl位点。用于该靶向 载体的同源臂包含BAC克隆内的Vk基因区段的5'和3'端的人基因组序列，从而在用该靶 向载体进行同源重组后，Vk基因区段被缺失并且Notl位点被工程化在hVK4-1基因区段 下游约133bp(图6,上右）。利用两个靶向载体在3'末端独立地靶向该修饰的2366jl2BAC 克隆以用氯霉素盒使hjK基因区段缺失，所述靶向载体还包含hJAl基因区段、Pl-Scel 位点和AsiSI位点或包含4个hJA基因区段的人入基因组片段（同上）、Pl-Scel位点 和AsiSI位点（图6,右上）。这两个相似的靶向载体的同源臂包含hjK基因区段的5'和 3'端的序列。利用此类第二靶向载体和修饰的2366jl2BAC克隆的同源重组产生双靶向的 2366jl2克隆，其从5'至3'包括5'Frt位点、潮霉素盒、3'Frt位点、Notl位点、人k基因 座的22,800bp基因组片段（包含Vk4-1与Jk1基因区段之间的基因间区域）、hJX1基因 区段或含有hjX1、JX2、JX3和JX7的人X基因组片段、Pl-Scel位点和氯霉素盒（图 6,右上）。使用双靶向的729g4和2366jl2克隆通过两个连接步骤获得用于产生两个另外 的修饰的两个最终的靶向载体。
[0250] 利用Notl和AsiSI降解双靶向的729g4和2366jl2克隆，从而分别产生包含新 霉素盒和hVA基因区段的一个片段，和包含人K基因座的约23kb基因组片段（包含在 Vk4-1与Jk1基因区段之间的基因间区域）、hJA1基因区段或包含hJA1、JA2、JA3和 J入7基因区段的基因组片段、Pl-Scel位点和氯霉素盒的另一个片段。这些片段的连接产 生两个独特的BAC克隆，其从5'至3'分别包含hV入基因区段、Vk4-1与JkI基因区段 之间的人k基因组序列、hJX1基因区段或包含hJX1、JX2、JX3和JX7基因区段的基 因组片段、Pl-Scel位和氯霉素盒（图6,下方）。随后用I-CeuI和Pl-Scel降解这些新的 BAC克隆以释放独特的片段（包含上游新霉素盒和连续的人A及K序列），将其连接入修 饰的小鼠BAC克隆302gl2,所述克隆从5'至3'包含内源k基因座5'端的小鼠基因组序 列、I-CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、hVX基因区段（3-12至3-1)、VX3-1 下游约200bp的Notl位点、在人Vk4-1与Jk1基因区段之间天然发现的约23kb的人k 序列、hJX1基因区段或包含hJX1、JX2、JX3和JX7基因区段的基因组片段、小鼠Eki、 小鼠Ck基因和Ek3'（图4, 12hV入-VkJk-hj入1和12hV入-VkJk-4hJ入靶向载体）。 利用这两个靶向载体的同源重组产生了两个单独的修饰的小鼠k轻链基因座，所述基因 座包含与内源小鼠CK基因有效连接的12个hVA基因区段、人K基因组序列以及1个或 4个hJA基因区段，所述基因座在重组后导致嵌合人A/小鼠K轻链的形成。
[0251] 实施例III
[0252] 将另外的人VA基因区段工程化至人入轻链微小基因座中
[0253] 使用类似的靶向载体和方法将另外的hVA基因区段独立地添加至实施例2中描 述的每一个初始修饰中（图5A,+16-X祀向载体和图5B,+16-k祀向载体）。
[0254] 16个额外的人VX基因区段的引入。用于构建靶向载体（用于将16个另外的 hVA基因区段添加至实施例2中描述的修饰的轻链基因座）的上游（5'）同源臂包含内源 k或A轻链基因座的5'端的小鼠基因组序列。3'同源臂与所有靶向载体一样，包含与实 施例2中描述的修饰的人A序列的5'末端重叠的人基因组序列。
[0255] 简而言之，工程化两个靶向载体（图5A和5B，+16-X或+16-k靶向载体）以用 于将16个额外的hVA基因区段引入实施例2中描述的修饰的小鼠轻链基因座。工程化包 含来自A簇的21个连续hV入基因区段的来自人BAC克隆RPll-761113(InVitrogen)的约 172kbDNA片段，以具有包含内源k或入轻链基因座的5'端的小鼠基因组序列的5'同源 臂和包含人基因组入序列的3'同源臂。此类靶向构建体中使用的5'小鼠k或入同源 臂与实施例2中描述的5'同源臂相同（图5A和5B)。3'同源臂包括相应于实施例2中描 述的人基因组A序列的约123kb片段的5'末端的等同物的人基因组A序列的53, 057bp 重叠。这两个靶向载体从5'至3'包括，5'小鼠同源臂（包含内源小鼠k轻链基因座的5' 端的约23kb的基因组序列或内源A轻链基因座的5'端的约24kb的小鼠基因组序列）、 5'Frt位点、潮霉素盒、3'Frt位点和包含21个连续hV入基因区段的171，457bp的人基因 组X序列，该人基因组A序列的约53kb与实施例3中描述的人A序列的5'末端重叠， 且用作该靶向构建体的3'同源臂（图5A和5B，+16-A或+16-k靶向载体）。利用此类靶 向载体的同源重组独立地产生修饰的小鼠k和A轻链基因座，其各自包含有效地连接至 内源小鼠恒定基因（Ck或CX2)的28个hVA基因区段和hJAl基因区段，所述基因座在 重组后导致嵌合轻链的形成。
[0256] 还以类似的方式将+16-k靶向载体用于将16个另外的hVX基因区段引入实施 例2中描述的其它初始修饰，所述修饰整合了多个hJA基因区段，且具有和不具有整合的 人K序列（图4B)。利用该靶向载体在包含其它初始修饰的内源小鼠k基因座上进行的 同源重组产生包含与内源小鼠Ck基因有效连接的28个hV入基因区段和hJAl、2、3和7 基因区段（具有和不具有人Vk-JK基因组序列）的小鼠K轻链基因座，所述基因座在重 组后导致嵌合A-K轻链的形成。
[0257] 12个另外的人VA基因区段的引入。使用相似的靶向载体和方法将另外的hV入 基因区段独立地添加至上文描述的每一个修饰中。与包含另外的hVA基因区段的靶向载 体的同源重组所产生的最终的基因座结构示于图7A和7B中。
[0258] 简而言之，工程化靶向载体（图5A和5B，+12-入或12-k靶向载体）以将12个 另外的hV入基因区段引入上述修饰的小鼠k和入轻链基因座。工程化来自人BAC克隆 RPll-22I18(Invitrogen)的包含12个连续的来自B簇的hV入基因区段的93,674bpDNA 片段，以具有5'同源臂（包含内源小鼠k或A轻链基因座的5'端的小鼠基因组序列）和 3'同源臂（包含人基因组A序列）。用于该靶向构建体的5'同源臂与上述用于添加16 个hV入基因区段的5'同源臂相同（图5A和5B)。通过将Pl-Scel位点工程化至来自BAC 克隆RP11-761I13的人入序列的27,468bp基因组片段中包含的人VA3-29P基因区段的 5'端约3431bp来产生3'同源臂。该PI-SceI位点用作连接点，以使用+16-入或+16-K 靶向载体（图5A和5B)将另外的约94kb人入序列的片段连接至约27kb人入序列片段 (其与先前的修饰中的人A序列的5'末端重叠）。这两个靶向载体从5'至3'包括，5'同 源臂（包含内源k轻链基因座的5'端的约23kb的小鼠基因组序列或内源A轻链基因座 的5'端的约24kb的小鼠基因组序列）、5'Frt位点，新霉素盒、3'Frt位点和121，188bp的 包含16个hV入基因区段和Pl-Scel位点的人基因组入序列，所述人基因组入序列的约 27kb与获自16个另外的hVA基因区段的插入的人A序列的5'末端重叠，且用作该靶向 构建体的3'同源臂（图5A和5B，+12-A或12-k靶向载体）。利用此类靶向载体的同源 重组独立地产生修饰的小鼠k和A轻链基因座（其包含有效地连接至内源小鼠恒定基因 (Ck或CX2)的40个hVA基因区段和人JA1)，所述基因座在重组后导致嵌合轻链的形 成（图5A和5B的下方）。
[0259] 还以类似的方式将+12-k靶向载体用于将12个另外的hVX基因区段引入其它 初始修饰，所述初始修饰整合了多个hJA基因区段，且具有和不具有整合的人K序列（图 4B)。利用该靶向载体在包含其它修饰的内源小鼠k基因座上的进行同源重组产生小鼠 k轻链基因座，所述基因座包含有效地连接至内源小鼠Ck基因的40个hVA基因区段和 hj入1、2、3和7基因区段（具有和不具有人Vk-Jk基因组序列），所述基因座在重组后， 导致嵌合A-K轻链的形成。
[0260] 实施例IV
[0261] 具有人A轻链基因区段的靶向的ES细胞的鉴定
[0262] 按照上述实施例制备的靶向的BACDNA被用于对小鼠ES细胞进行电穿孔，以 产生修饰的ES细胞，所述细胞用于产生表达人A轻链基因区段的嵌合小鼠。通过定量 Taqman?测定来鉴定包含未重排的人A轻链基因区段的插入的es细胞。针对人入序 列和相关选择盒的插入（等位基因的获得，G0A)、内源小鼠序列和任何选择盒的丢失（等位 基因的丢失，L0A)以及侧翼小鼠序列的保留（等位基因保留，AR)，设计特异性引物组和探 针。对于人A序列的每一次额外插入，使用另外的引物组和探针来确认另外的人A序列 的存在，且使用先前的引物组和探针来确认先前靶向的人序列的保留。表1显示了用于定 量PCR测定的引物和相关探针。表2显示了用于确认人A轻链基因区段的每一个部分在 ES细胞克隆中的插入的组合。
[0263] 任选地用表达FLP的构建体转染具有人A轻链基因区段的ES细胞，以除去通过 插入包含人V入5-52-V入1-40基因区段的靶向构建体而引入的Frt'ed新霉素盒（图5A和 5B)。新霉素盒可任选地通过与表达FLP重组酶的小鼠交配来除去（例如，US6, 774, 279)。 任选地，新霉素盒被保留在小鼠中。
[0264]表1
[0265]
【权利要求】
1. 一种用于产生小鼠的方法，所述方法包括遗传修饰小鼠以使得所述小鼠包含含有未 重排的人和未重排的人基因区段的内源A (lambda)轻链等位基因，所述小鼠包含 内源小鼠入轻链等位基因的第一 VA-JA-C入基因簇的缺失和利用人VA和基因区 段完全或部分地对所述等位基因的第二基因簇的V A -J A基因区段进行的替换，其中所述 人VA和基因区段有效地连接至小鼠CA恒定区基因。
2. 权利要求1的方法，其中所述小鼠表达包含与小鼠恒定区融合的人A可变序列的免 疫球蛋白轻链。
3. 权利要求1的方法，其中所述小鼠进一步包含含有未重排的AVH，未重排的人D0P 未重排的人JH基因区段的内源重链等位基因。
4. 权利要求1的方法，其中所述内源A (lambda)轻链等位基因包含多个人V A基因区 段。
5. 前述权利要求任一项所述的方法，其中所述内源A (lambda)轻链等位基因包含： (a) 至少12个未重排的人V A基因区段；或 (b) 13至28个未重排的人VA基因区段。
6. 权利要求4的小鼠，其中所述人VA基因区段包括 (a) hVA 3-1、hVA 4-3、hVA 2-8、hVA 3-9、hVA 3-10、hVA 2-11 和 hVA 3-12 ; (b) hV 入 2-14、hV 入 3-16、hV 入 2-18、hV 入 3-19、hV 入 3-21、hV 入 3-22、hV 入 2-23、 hV 入 3-25 和 hVA 3-27。
7. 权利要求1的方法，其中所述内源A轻链等位基因包含一个为hj A 1的未重排的 J入基因区段。
8. 权利要求1的方法，其中所述内源A (lambda)轻链等位基因包含4个未重排的J入 基因区段。
9. 权利要求8的方法，其中所述4个未重排的J入基因区段为】入1，02，^3和 J入7。
10. 权利要求1的方法，其中所述内源入（lambda)轻链等位基因不存在内源VA基因 区段。
11. 权利要求1的方法，其中所述内源小鼠A轻链等位基因包含： (a) 横跨V入3-12至V入3-1的人入轻链基因座的连续序列； (b) 横跨V A 3-29至V A 3-1的人X基因座的连续序列；或 (c) 横跨V入3-29至V入3-1的人入基因座的连续序列和横跨V入5-52至V入1-40的 人X基因座的连续序列。
12. 前述权利要求任一项所述的方法，其中所述内源k (kappa)轻链等位基因被缺失。
13. -种来源于根据权利要求1-12任一项产生的小鼠的细胞。
14. 权利要求13的细胞，其中所述细胞是B细胞。
15. -种分离的小鼠胚胎干（ES)细胞，其包含含有未重排的人VX和未重排的人J入 基因区段的内源A (lambda)轻链等位基因，其中小鼠ES细胞包含内源小鼠A轻链等位基 因的第一 VA-JA-CA基因簇的缺失和利用人和基因区段完全或部分地对所述等 位基因的第二基因簇的基因区段进行的替换，其中所述人和基因区段有 效地连接至小鼠CA恒定区基因。
16. -种小鼠胚胎，其包含、产生自或获得自权利要求15的小鼠ES细胞。
17. 权利要求14的B细胞用于产生杂交瘤的用途。
18. -种来自或获得自根据权利要求1-12任一项所述的方法产生的所述小鼠的杂交 瘤。
19. 根据权利要求1-12任一项的方法产生的小鼠用于产生抗原结合蛋白的用途。
20. 根据权利要求19的用途，其中所述抗原结合蛋白是人蛋白质。
21. 根据权利要求19的用途，其中所述抗原结合蛋白是人抗体。
22. -种使用根据权利要求1-12任一项的方法产生的小鼠产生的抗原结合蛋白。
23. -种杂交瘤，其包含来源于根据权利要求1-12任一项的方法产生的小鼠的重排的 免疫球蛋白轻链基因序列。
24. -种来源于根据权利要求1-12任一项的方法产生的小鼠的抗体。
25. -种在小鼠中产生抗体的方法，包括： (a) 将根据权利要求1-12任一项的方法产生的小鼠暴露于抗原； (b) 允许所述小鼠产生对所述抗原的免疫应答；和 (c) 从（b)的所述小鼠分离特异性识别所述抗原的抗体，或从（b)的所述小鼠分离包含 特异性识别所述抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，或在（b)的所述小鼠中鉴定编码结合所 述抗原的重链和/或轻链可变结构域的核酸序列， 其中所述抗体包含来源于hVA基因区段、hJA基因区段和小鼠CA恒定区基因的轻 链。
26. -种根据权利要求25的方法产生的抗体。
27. -种产生完全人的抗体的方法，包括： (a) 将根据权利要求1-12任一项的方法产生的小鼠暴露于抗原； (b) 允许所述小鼠产生对所述抗原的免疫应答； (c) 鉴定所述小鼠中的包含编码与小鼠C A结构域融合的重排的人V A结构域序列的 DNA的细胞，其中所述细胞还编码包含重排的人VH结构域的关联重链的DNA ;和 (d) 从细胞克隆编码重排的人V A结构域的核酸序列和编码关联重排的人％结构域的 核酸序列；和 (e) 使用编码重排的人V A结构域的克隆的核酸序列和编码关联重排的人％结构域的 克隆的核酸序列产生完全人的抗体。
28. -种根据权利要求27的方法产生的抗体。
【文档编号】C12N5/10GK104342455SQ201410538631
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2011年6月22日 优先权日:2010年6月22日
【发明者】L·麦克唐纳, S·史蒂文斯, C·古雷尔, A·J·莫菲, K·A·霍希亚瓦 申请人:瑞泽恩制药公司