一种利用est微卫星标记鉴别韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫的引物及方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用EST微卫星标记技术鉴别韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫的方法，步骤如下：(1)提取韭菜迟眼蕈蚊基因组DNA；(2)以韭菜迟眼蕈蚊基因组DNA为模板对其进行PCR扩增；(3)对步骤(2)制得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。本发明所述的鉴别方法，为筛选韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊提供了简便稳定的分子标记，为今后的韭菜迟眼蕈蚊的种群动态鉴定、生物学以及控制的研究奠定了基础。
【专利说明】-种利用EST微卫星标记鉴别韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊 幼虫的引物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用EST微卫星标记鉴别韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫的引 物及方法，属于农业生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 亜菜迟眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga Yang et Zhang)属双翅目 Diptera，长角 亚目Nematocera，眼蕈蚊科Sciaridae，迟眼蕈蚊属，幼虫俗称韭蛆，是韭菜的主要害虫。以 幼虫危害韭菜叶鞘、幼芽和鳞茎，引起鳞茎腐烂、叶片枯死，轻者造成倒伏枯黄，重者缺苗断 垄，严重影响韭菜产量和质量。
[0003] 异迟眼蕈蚊（Bradysia difformis)幼虫俗称菌蛆，与迟眼蕈蚊同隶属于迟眼蕈蚊 属。韭蛆与菌蛆传统的区分方法是依据两者的形态特征（石宝才，路虹，宫亚军等，2010.韭 菜迟眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬菜，11 :21-22;张宏瑞，张晓云，沈登荣等，2008.食用菌 异迟眼蕈蚊的生物学特性.中国食用菌，27 (6) :54-56)。
[0004] 韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊在形态上相似，尤其是其幼虫，非专业人士不能区分， 不利于韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊的快速鉴定。精确区分韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊幼虫 是进行有效防控的前提和基础，这对于韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊的综合防控具有重要的 理论意义和指导价值。
[0005] 本发明利用EST微卫星标记鉴别不同物种，因为EST来自转录区，其保守性较高， 在家族和种属间的通用性比来源于非表达序列的标记更高，另外还具有开发简单、快捷、费 用低等特点。EST微卫星标记已经广泛应用于植物、动物、微生物以及昆虫的物种检测与鉴 定、遗传分化鉴定等方面。
[0006] 但利用EST微卫星标记构建区分韭菜迟眼蕈蚊幼虫与异迟眼蕈蚊幼虫的方法目 前还未见报道。主要技术障碍在于，目前尚未有韭菜迟眼蕈蚊幼虫与异迟眼蕈蚊幼虫的转 录组文库，因此无法进行EST微卫星标记的构建工作，且构建能够区分韭菜迟眼蕈蚊幼虫 与异迟眼蕈蚊幼虫的EST微卫星标记具有一定的偶然性。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种利用EST微卫星标记鉴别韭蛆与菌蛆的引 物及方法。
[0008] -种利用EST微卫星标记鉴别韭蛆与菌蛆的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0009] -种鉴别韭蛆与菌蛆的方法，步骤如下：
[0010] ⑴提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
[0011] (2)以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述的一对引物对基因组DNA进行 PCR扩增，制得PCR扩增产物；
[0012] (3)对步骤（2)制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结束后，EB 染色后在紫外凝胶成像仪上成像，当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品有121bp的一条 条带时，则该被检测样品为韭蛆；当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品无条带时，则为菌 蛆。
[0013] 所述步骤⑵中PCR扩增的扩增体系为：
[0014] 基因组 DNA 溶液 2μ 1，20μΜ 引物 0· 26μ l，5U/y I Taq 酶 0· 13μ l，10XTaq Buffer (缓冲液）I. 3 μ 1，IOmM dNTP 0· 26 μ 1，ddH20 补至 13 μ I ;
[0015] 所述步骤（2)中PCR扩增的扩增条件如下：
[0016] 94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，进行35个循 环；72 °C延伸7分钟。
[0017] 上述步骤（1)中提取韭菜迟眼蕈蚊基因组DNA和步骤（3)中琼脂糖凝胶电泳分析 均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第 三版（北京：科学出版社，2002)。
[0018] 有益效果
[0019] 1、本发明所述鉴别韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊的引物能够扩增韭菜迟眼蕈蚊基 因组DNA中的核基因，为鉴定韭菜迟眼蕈蚊与其他蕈蚊提供了简便稳定的分子标记，解决 了区分韭菜迟眼蕈蚊的难题。
[0020] 2、本发明从分子水平探索了韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊EST序列的不同，探索建 立了韭菜迟眼蕈蚊的鉴别技术，为今后韭菜迟眼蕈蚊的种群动态鉴定、生物学以及控制的 研究奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是实施例2中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；
[0022] 其中A、为韭菜迟眼蕈蚊；B、为异迟眼蕈蚊，M :DL2000DNA Marker。
[0023] 图2是实施例3中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；
[0024] 其中A、为韭菜迟眼蕈蚊；B、为异迟眼蕈蚊，M :DL2000DNA Marker。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限 于此。
[0026] 实施例1中所述韭菜迟眼蕈蚊于2012年采集于山东省11地区；
[0027] 实施例2中A、B所述韭菜迟眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊于2012年分别采集于山东省淄 博市沂源地区和山东省潍坊市昌乐地区；
[0028] 实施例3中A、B所述韭菜迟眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊于2012年分别采集于山东省济 宁市地区和山东省临沂市费县地区；
[0029] 上述样品均按照（石宝才，路虹，宫亚军等，2010.韭菜迟眼蕈蚊的识别与防 治.中国蔬菜，11:21-22.;张宏瑞，张晓云，沈登荣等，2008.食用菌异迟眼蕈蚊Bradysia difformis的生物学特性.中国食用菌，27 (6) :54-56.)中记载的方法对上述韭菜迟眼蕈蚊 与异迟眼蕈蚊进行了形态鉴定。
[0030] 实施例所述仪器为尼康SMZ745T体视显微镜，为普通市售产品。
[0031] 实施例1
[0032] 构建了韭菜迟眼蕈蚊转录组文库并测序。
[0033] 首先提取韭菜迟眼蕈蚊幼虫总RNA，将提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳、核酸浓度及 质量检测，判断总RNA浓度。将其中的包含poly (A)的mRNA通过有Oligo (dT)的磁珠进行 富集纯化，反转录出双链cDNA并纯化，利用Klenow添加 poly (A)并连接测序接头，通过琼 脂糖凝胶电泳对目的大小cDNA片段的回收和纯化。利用PCR扩增产物中的cDNA片段，并 对PCR目的产物进行胶回收，纯化并检测合格后的cDNA片段，作为cDNA文库在Illumina HiseqTM 2000上开展测序工作。通过Base calling软件对测序峰图进行读取，最终转化为 序列数据（raw reads)，经过对原始数据的分析筛选，得到韭菜迟眼蕈蚊的转录组文库。
[0034] 利用韭菜迟眼蕈蚊转录组文库中的13839条EST序列。经过序列的前处理和聚 类分析后，共得到1047个unigenes序列。利用软件DNAstar对亜菜迟眼蕈蚊EST序列 进行预处理，去除载体序列和长度小于150bp的序列，然后用软件Cap3 (http://genome. cs. mtu. edu/cap/cap3. html)对EST中长度大于150bp的序列按照默认的参数进行拼接。 利用MlSA(MicroSatallite)软件进行SSR查找，查找标准：单核苷酸重复10次以上，二核 苷酸重复6次以上，三核苷酸重复5次以上，四核苷酸以上的重复3次。获得20对引物。
[0035] 经过对上述引物进行筛选，最终获得一对引物，分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0036] 引物序列如下：
[0037] 正义引物 EST-F :5, -TTAATTCGTTATCGCTGTG-3, ；SEQ ID NO. 1
[0038] 反义引物 EST-R :5, -ATGACTCGTCGCTAGACC-3, ；SEQ ID NO. 2
[0039] 实施例2
[0040] 一种鉴别韭蛆与菌蛆的方法，步骤如下：
[0041] (1)韭菜迟眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊基因组DNA的提取
[0042] 将单头山东省淄博市沂源地区韭蛆和山东省潍坊市昌乐地区菌蛆个体置于 含60 μ 1碱裂解液的0. 2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol · !/1Tris-HCl (pH8. 0)、 20mmol · L-1NaCUlmmol · L-1EDTA(乙二胺四乙酸）、1 % SDS(十二烷基硫酸钠），用封口枪 头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，制得韭菜迟眼 蕈蚊基因组DNA溶液和异迟眼蕈蚊基因组DNA溶液。
[0043] (2)韭菜迟眼蕈蚊基因的PCR扩增
[0044] 分别以步骤（1)制得的韭菜迟眼蕈蚊基因组DNA溶液和异迟眼蕈蚊基因组DNA溶 液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
[0045] PCR扩增体系为：
[0046] 韭菜迟眼蕈蚊基因组DNA溶液：2μ1 ;20μΜ引物：0·26μ1 ;5U/yl Taq酶： 0· 13 μ I ; 10 X Taq Buffer : I. 3 μ I ; IOmM dNTP :0· 26 μ I ;ddH20 补至 13 μ I ;
[0047] 引物序列如下：
[0048] 正义引物 EST-F :5, -TTAATTCGTTATCGCTGTG-3, ；SEQ ID NO. I
[0049] 反义引物 EST-R :5, -ATGACTCGTCGCTAGACC-3, ；SEQ ID NO. 2
[0050] PCR扩增条件如下：94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸 30秒，进行35个循环；72 °C延伸7分钟。
[0051] (3)用质量百分比为2.0%的琼脂糖凝胶电泳对步骤⑵制得的PCR扩增产物进 行电泳检测，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像。结果显示，韭菜迟眼蕈蚊在成像胶片上 均有有一条片段长度121bp左右的条带；异迟眼蕈蚊在成像胶片上均无长度121bp左右的 条带，结果如图1所示。
[0052] 实施例3
[0053] -种鉴别韭蛆与菌蛆的方法，步骤如下：
[0054] (1)将单头个体样品分别置于含60 μ 1碱裂解液的0. 2ml的离心管中，碱裂解液 为：50mmol · L 1Tris-HCl (ρΗ8· 0)、20mmol · L 1NaCUmmol · L 1EDTA(乙二胺四乙酸）、1 % SDS，（十二烷基硫酸钠）用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65°C水浴15min，然后在 95°C水浴IOmin后，得基因组DNA溶液；
[0055] (2)以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的EST序列进行PCR扩 增，制得PCR扩增产物；
[0056] PCR扩增体系为：
[0057] 基因组 DNA 溶液 2μ 1，20μΜ 引物 0· 26μ l，5U/y ITaq 酶 0· 13μ l，10XTaq Buffer I. 3 μ 1，IOmM dNTP 0· 26 μ 1，ddH20 补至 13 μ I ;
[0058] 引物序列如下：
[0059] 正义引物 EST-F :5, -TTAATTCGTTATCGCTGTG-3, ；SEQ ID NO. I
[0060] 反义引物 EST-R :5, -ATGACTCGTCGCTAGACC-3, ；SEQ ID NO. 2
[0061] PCR扩增条件如下：94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸 30秒，进行35个循环；72 °C延伸7分钟；
[0062] (3)用质量百分比为2.0%的琼脂糖凝胶电泳对步骤（2)制得的PCR扩增产物进 行电泳检测，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像；当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品 有121bp的一条条带时，则该被检测样品为韭蛆；当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品无 条带时，则为菌蛆，结果如图2所示，该检测结果与按照（石宝才，路虹，宫亚军等，2010.韭 菜迟眼蕈蚊的识别与防治.中国蔬菜，11:21-22.;张宏瑞，张晓云，沈登荣等，2008.食用菌 异迟眼蕈蚊Bradysia difformis的生物学特性.中国食用菌,27(6):54-56.)中记载的方 法对上述韭菜迟眼蕈蚊与异迟眼蕈蚊进行形态鉴定的结果一致。
【权利要求】
1. 一种利用EST微卫星标记鉴别韭蛆与菌蛆的引物，其特征在于，所述引物为一对，分 别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
2. -种鉴别韭蛆与菌蛆的方法，其特征在于，步骤如下： (1) 提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液； (2) 以步骤⑴制得的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的一对引物对基因组 DNA进行PCR扩增，制得PCR扩增产物； (3) 对步骤⑵制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结束后，EB染色后 在紫外凝胶成像仪上成像，当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品有121bp的一条条带时， 则该被检测样品为韭蛆；当PCR扩增产物电泳图谱显示被测样品无条带时，则为菌蛆。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵中PCR扩增的扩增体系为： 基因组0嫩溶液2以1，2(^]\1弓|物0.264 1，5"4 1丁&9酶0.134 1，10\丁&9 Buffer(缓冲液）1. 3μ 1，10mM dNTP 0· 26μ 1，ddH20 补至 13μ 1。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵中PCR扩增的扩增条件如下： 94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，进行35个循环； 72 °C延伸7分钟。
【文档编号】C12N15/11GK104263840SQ201410538459
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】褚栋, 杨峰山, 郭雅男, 王磊, 台术蕾, 张存环 申请人:青岛农业大学