TALEs双识别检测方法及其应用的制作方法
【专利摘要】TALEs双识别检测方法，步骤如下：步骤一：TALEs原核蛋白表达质粒的构建；步骤二：原核表达TALEs蛋白；步骤三：TALEs蛋白包被在微孔板上步骤，加入DNA样品，DNA被包被在微孔板上的TALEs蛋白包捕获；步骤四：用标记有碱性磷酸酶的TALEs蛋白识别被捕获的DNA，加入碱性磷酸酶的底物，产生化学发光信号，并判读信号。本发明利用TALEs蛋白特异性识别DNA序列的特性，然后通过化学发光放大信号，灵敏度比较高，可以用于快速诊断。本发明与传统检测手段有很大的不同，没有中间的PCR扩展步骤，检测灵敏度比较高，假阳性率比较低。该方法不仅可以用于科研的基因突变检测等，也可以用做临床诊断。
【专利说明】TALEs双识别检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种TALEs双识别检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] TALE (Transcription Activator Like Effectors)是一类 DNA 结合蛋白。它 的DNA结合结构域是由可变数量的重复单元组成，天然TALEs主要由位于N端的转运信号 (translocation signal)、位于C端的核定位信号（nuclear localization signals, NLS) 和转录激活结构域（transcriptional activation domain, AD)以及位于中间的DNA结合 结构域三部分组成。DNA结合结构域由包含33~35 (通常为34)个氨基酸残基的重复单元 串联而成，介导DNA特异识别与结合。每个重复单元序列高度保守，主要区别在于第12和 第13位的重复可变双残基（repeat variant di-residue, RVD)。研究发现每个重复单元 的RVD决定了其所识别的核苷酸，且其识别遵循一个简单法则：NI=A，HD=C，NG=T，NN=G or A。TALEs理论上可以识别任何DNA序列。
[0003] 目前还没有用TALES蛋白用于基因的诊断，本发明TALES双识别检测技术，用它做 突变检测。该方法不仅可以用于科研的检测，也可以用于临床诊断。
【发明内容】
[0004] 解决的技术问题： 本发明的目的在于克服现有技术的不足而开发的一种TALEs双识别检测方法，该方法 可检测出不同的基因，点突变等，可用于分子诊断、基因表达的研究，本发明检测灵敏度比 较高，假阳性率比较低。
[0005] 技术方案： 本发明利用TALEs识别DNA的特性，表达特异识别DNA序列的TALEs蛋白，然后把识别 不同DNA序列的蛋白做包被在微孔板上。再然后加入DNA样品与包被在微孔板上的TALEs 蛋白结合，接着再加入偶联有碱性磷酸酶的TALEs蛋白，该蛋白特异识别DNA序列，最后加 入碱性磷酸酶的底物，化学发光检测。从而检测出不同的基因，点突变等。
[0006] TALEs双识别检测方法，步骤如下： 步骤一 =TALEs原核蛋白表达质粒的构建：用NdeI和BamHI切pET-16b载体，然后把 TALEs序列克隆到pET-16b载体的NdeI和BamH位点，得pET-16b-TALEs原核表达载体； 步骤二：原核表达TALEs蛋白：将步骤一制备的pET-16b-TALEs原核表达载体转化到 大肠杆菌BL21中，IPTG诱导，收集细菌并裂解细胞，离心取上清液，进行Ni柱亲和层析，待 目的蛋白与Ni柱结合之后，用漂洗液洗涤，后用洗脱缓冲液冲洗，将洗脱组分中的高盐缓 冲液置换成PBS溶液，最后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的TALEs蛋白。
[0007] 步骤三：TALEs蛋白定向高密度包被在微孔板上。加入提取的DNA样品，DNA被 包被在微孔板上的TALEs蛋白包捕获。
[0008] 步骤四：用偶联有碱性磷酸酶的TALEs蛋白识别被捕获的DNA，加入碱性磷酸酶的 底物，产生化学发光信号，并判读信号。
[0009] 所述的TALEs双识别检测方法在基因诊断中的应用。
[0010] 有益效果 本发明打破基因芯片的核酸结合核酸，蛋白芯片中蛋白识别蛋白的特性，以蛋白特异 性识别DNA，稳定，而且灵敏度比较高，可以用于快速诊断。与现有技术相比，本发明的优点 是可以高通量检测不同的基因和多个突变位点，该方法不仅可以用于科研的检测，也可以 用做临床诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为用化学发光法检测的信号结果图，结果如图1所示，TALES检测EGFR基因 T790M位点的检测结果。
【具体实施方式】
[0012] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员 将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明 具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0013] 实施例1 1、材料：pET-16b购于Novagen、大肠杆菌BL21购于Takara,标记有碱性磷酸酶的 TALEs蛋白由北京博奥森生物技术有限公司标记。
[0014] 2、方法 步骤一 =TALEs原核蛋白表达质粒的构建：用NdeI和BamHI切PET-16b载体，然后把 TALEs序列克隆到pET-16b载体的NdeI和BamH位点，得pET-16b-TALEs原核表达载体； 步骤二：原核表达TALEs蛋白：将步骤一制备的pET-16b-TALEs原核表达载体转化到 大肠杆菌BL21，IPTG诱导，收集细菌并裂解细胞（50mM NaH2P04，pH 8. 0,300mM NaCl，10mM 咪唑)，离心取上清液，进行Ni柱亲和层析，待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液（50mM NaH2PO 4, pH 8. 0,300mM NaCI，20mM 咪唑）洗涤，之后用洗脱缓冲液（50mM NaH2PO4, pH8.0， 300mM NaCI，250mM咪唑）冲洗，将洗脱组分中的高盐缓冲液（50mM NaH2PO4, pH8.0,300mM NaCI，250mM咪唑）置换成PBS溶液，最后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的TALEs蛋 白； 步骤三=TALEs蛋白定向包被在微孔板上，加入DNA样品，DNA被包被在微孔板上的 TALEs蛋白包捕获； 步骤四：用标记有碱性磷酸酶的TALEs蛋白识别被捕获的DNA，加入碱性磷酸酶的底 物，产生化学发光信号，并判读信号。
[0015] 实施例2 检测人类表皮生长因子受体（EGFR)基因20号外显子的T790M的突变 1.选择识别野生型 1790 序列的 TALEs 探针：TALEs-T790(CGACATCACGCAGCTC)(SEQ ID NO. 1)，识别 790M 的序列的 TALEs 探针：TALEs-790M (CGACATCATGCAGCTC) (SEQ ID NO. 2)， 识别阴性对照序列的TALEs探针：TALEs-control(CGACATCTCGTAGCTC)(SEQIDN(λ3)并构 建原核表达的重组质粒 pET-16b-TALEs-T790 (CGACATCACGCAGCTC)，pET-16b-TALEs-790M E(CGACATCATGCAGCTC)和 pET-16b-TALEs-control (CGACATCTCGTAGCTC)。这三个载体转化 大肠杆菌E. coli BL21:转化菌在5ml氨苄抗性的培养基中培养过夜，次日转移入500ml 相同的培养基中培养，经IPTG16°C过夜诱导，收集所得到的TALEs-790M，TALEs-790M和 TALEs-control蛋白菌体，经过高压破碎后离心获得可溶性的蛋白，进行Ni柱亲和层析。待 目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，5%(v/v)甘油， 60mM 咪唑，ρΗ8·0 )洗涤，之后用洗脱缓冲液（20mM Tris-HCl，500mM NaCl，5% (v/v)甘 油，500mM咪唑，pH8.0 )洗脱掉蛋白。利用ro-10脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置 换成含有20% (体积百分比）甘油的PBS溶液，之后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化 的 TALEs-T790, TALES-790M 和 TALEs-control 蛋白。
[0016] 2. TALES-T790包被在微孔板上。用标记有亲和素的TALES-T790蛋白和带有链霉 素的9孔板结合，TALES-T790蛋白就包被在微孔板上。
[0017] 3.加入提取好的DNA样品进行杂交捕获，去掉非特异结合的DNA。然后把偶联有碱 性磷酸酶的TALES-790M蛋白加入到ICl，IC2孔中，把偶联有碱性磷酸酶的TALEs-control 蛋白加入到其他孔中，最后加入碱性磷酸酶的底物，产生化学发光信号，并判读信号。
[0018] 表1序列
【权利要求】
1. TALEs双识别检测方法，其特征在于，步骤如下： 步骤一 ：TALEs原核蛋白表达质粒的构建：用Ndel和BamHI切pET-16b载体，然后把 TALEs序列克隆到pET-16b载体的Ndel和BamH位点，得pET-16b-TALEs原核表达载体； 步骤二：原核表达TALEs蛋白：将步骤一制备的pET-16b-TALEs原核表达载体转化到 大肠杆菌BL21中，IPTG诱导，收集细菌并裂解细胞，离心取上清液，进行Ni柱亲和层析，待 目的蛋白与Ni柱结合之后，用漂洗液洗涤，后用洗脱缓冲液冲洗，将洗脱组分中的高盐缓 冲液置换成PBS溶液，最后进行SDS-PAGE的检测，所得即为纯化的TALEs蛋白； 步骤三：将TALEs蛋白定向包被在微孔板上，加入DNA样品，DNA被包被在微孔板上的 TALEs蛋白包捕获； 步骤四：用标记有碱性磷酸酶的TALEs蛋白识别被捕获的DNA，加入碱性磷酸酶的底 物，产生化学发光信号，并判读信号。
2. 权利要求1所述的TALEs双识别检测方法在基因诊断中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104498594SQ201410726245
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】李云英 申请人:李云英