一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用的制作方法

一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种唐古特白刺 NtCIPK9 基因及其表达蛋白和应用，所述 NtCIPK9 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明根据唐古特白刺的抗逆特性，利用唐古特白刺的叶片组织，在已有的部分转录组数据的基础上，同源克隆了唐古特白刺抗逆相关的 CIPK 基因全长，依据拟南芥中的同源基因而命名为 NtCIPK9 。通过 NtCIPK9 基因纯合拟南芥植株的耐盐性分析，证明了唐古特白刺 NtCIPK9 基因在植物耐盐方面的功能，为植物抗逆基因库增加资源。
【专利说明】—种唐古特白刺及其表达蛋白和应用

【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及一种唐古特白刺#(677--因及其表达蛋白和应用。

【背景技术】
[0002]唐古特白刺(Nitrariatangutorum)属于蔡藜科(ZygophyIIaceae)白刺属(Iiiraria)，强旱生落叶灌木，为中国特有白刺种类，主要分布于我国西北部地区。唐古特白刺抗旱、耐盐碱、防风沙、耐贫瘠，可改善盐碱质土壤，提高土壤肥力，防风固沙，维持绿洲，保护生态平衡。其浆果状核果富含维生素C、黄酮、蛋白质、以及19种氨基酸和21种微量元素，具有食用价值。此外，其果实还具有健脾胃，降血脂，降血糖以及抗氧化等药用价值。唐古特白刺作为一种生态和经济植物逐渐受到关注。目前，对唐古特白刺的研究主要集中在抗旱耐盐生理生化性质，果实营养成分分析以及育种等方面，为唐古特白刺的分子机理研究提供大量的数据支持，为抗性基因及其它功能基因的运用奠定基础。
[0003]CIPKs1.CZ?Z-1nteracting protein kinase), Ca2+信号途径中与上游⑶对寺异性相互作用的蛋白激酶，这类蛋白在N端含有保守的SNF激酶结构域和C端的NAF结构域。在模式植物拟南芥中有26个￠77?类同源异型盒基因，水稻中有30个￠77?类同源异型盒基因，杨树中有27个￠77?类同源异型基因。另外，到目前为止，还没有在植物以外的物种中发现类似基因，因此￠7/?基因是植物所特有的Ca2+信号通路中的Ser/Thr类磷酸蛋白激酶基因。众多研究表明，植物所特有的￠7/?类基因在植物耐盐，耐低钾，抗寒和抗旱等抗逆过程中发挥重要作用。
[0004]在拟南芥的研究中发现因是植物响应低钾环境的一个关键调控基因。在拟南芥突变体apk9-m直株与野生型相比，其生长明显受到低钾环境的抑制。￠77--因启动子的GUS染色和荧光实时定量PCR分析表明，￠77--因在拟南芥的根茎叶中均有表达。根部的表达主要是在根部的成熟区，包括根毛，在根尖和伸长区并无CIP纖因的表达。此外，在拟南芥的花瓣，萼片和荚果中也能检测到￠7/--因的表达。分子生物学研究证明了 CIPK9与CSL5共同作用，调节植物体内钾离子平衡。


【发明内容】

[0005]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种唐古特白刺
因。本发明的另一目的是提供唐古特白刺因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供唐古特白刺#(￠7/--因在植物耐盐育种中的应用。
[0006]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种唐古特白刺因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]上述的唐古特白刺因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]上述的唐古特白刺因在植物耐盐育种中的应用。
[0009]含有唐古特白刺NtCIP纖因的载体。
[0010]含有唐古特白刺因的宿主细胞。
[0011]有益效果:与现有技术相比，本发明根据唐古特白刺的抗逆特性，利用唐古特白刺的叶片组织，在已有的部分转录组数据的基础上，同源克隆了唐古特白刺抗逆相关的CIPK基因全长，依据拟南芥中的同源基因而命名为在正常培养环境中，唐古特白刺
因过表达的拟南芥T3代纯合植株的生长发育与野生型无明显差异。在盐胁迫处理过程中，转财￠7/--因纯合株的耐盐性大于野生型拟南芥。通过#(67/--因纯合拟南芥植株的耐盐性分析，证明了唐古特白刺#(￠7/--因在植物耐盐方面的功能，为植物抗逆基因库增加资源，这对于提高植物的耐盐性研究具有重要意义。

【专利附图】

【附图说明】
[0012]图1是唐古特白刺总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；
图2是因片段克隆，5’ RACE，3’ RACE以及因全长克隆的PCR结果;
图3是因的表达载体图；
图4是Tl代拟南芥植株筛选结果；
图5是转基因拟南芥种子子叶萌发率统计图；
图6是拟南芥种子在含盐培养基上萌发后两周的生长状态图；
图7是转基因拟南芥盐处理10天后生长表型图；
图8是转基因拟南芥盐处理10天后叶片及侧根数量统计结果图；
图9是转基因拟南芥盐处理10天后主根长度统计结果图；
图10是转基因拟南芥盐处理10天后植株整体干重统计结果图；
图11是盐溶液处理转基因拟南芥表型图；
图12是200mM盐水处理转基因拟南芥4天后的拟南芥表型图。

【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0014]实施例1
以唐古特白刺的叶片为材料，提取总RNA，并反转成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与PMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。确定为目的序列后，依据该序列设计RACE引物，PCR获取5’和3’序列，测序分析后，拼接得到全长序列。依据全长序列设计引物，PCR获得全长片段，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，再次测序和分析，确定为全长片段后，挑取阳性克隆进行质粒抽提，加入酶切位点后与载体PBI121同时双酶切，在T4连接酶的作用下连接后，转入农杆菌EHA105和GV3101中，待拟南芥适龄后，通过花器官浸泡转化法进行转化，获取Tl代和T2代种子，筛选到纯合T3代后，进行盐处理，表型观察和耐盐性分析。具体如下:
(I)总RNA的提取
以唐古特白刺的叶片为材料，按照NORGEN试剂盒B1tek)的操作步骤进行RNA的提取，所使用的试剂和耗材均处理使其无RNA酶。唐古特白刺叶片总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带清晰；测定总RNA的吸光度，OD26tZOD28tl值为2.01，OD 260/OD23tl为1.98，可见RNA质量较好。
[0015]RNA提取的具体过程为:加入800 μ LLysis Solut1n磨样。匀浆后将裂解液转移至新管中。混勻2min使其彻底裂解，12000rpm离心2min,上清移至新管中。加入等体积的70%乙醇，涡旋混匀。将混合液移至柱子中(下接2ml收集管)，离心lmin，倒掉滤液，放回收集管。i)PA 400 μ L Wash Solut1n，离心lmin，弃滤液，放回收集管。加入DNAI工作液，12000rpm离心 lmin,将滤液吸回柱子上，25-3CTC静置 15min。加入 400 μ L Wash Solut1n,12000rpm 离心 lmin,弃滤液。第三次加入 400 μ L Wash Solut1n, 12000rpm 离心 lmin,弃滤液。将柱子放回收集管，12000rpm离心2min，弃收集管。将柱子放入1.7ml管子中加入50 μ LElut1n Solut1n。200~2000rpm 离心 2min, 12000rpm 离心 lmin,体积不足 50 μ L,再用 14000rpm 离心 lmin。
[0016](2)cDNA 的获得
以所提RNA为模板，反转录获得cDNA,所使用的是Invitrogen公司的SuperScript?III First-Strand Synthesis Kit。实验中的RNA使用量为I μ g,具体过程为:配置反应液(I μ L RNA ? 5 μ g), I μ LPrimer (OligodT), I μ L 1mM dNTPmix,DEPC-Treatedffater,up to 10 μ L),短暂低速离心后,65°C 5min,立即置于冰上l~2min。向上一步的管中加入试剂(2yL I OXRT Buffer,4y L 25mM MgCl2,2y L 0.1M DTT, I μ LRNaseOUT (40U/ μ L),I μ LSuperScript III RT)，置于 PCR 仪上，反应程序为 50°C 50min,85°C 5min。将上一步的反应液离心，每管中加入I μ L的RNase H ,37°C 20min。
[0017](3)目的基因的同源克隆
根据唐古特白刺的部分转录组数据，通过NCBI Blast进行保守的特异性序列分析，利用01igo7设计引物，克隆#(677--因片段，然后进行连接转化测序和序列分析，确定为目的基因。克隆引物，PCR体系和PCR程序如下所示。克隆结果如图2-A所示。
[0018]NtCIPK9片段克隆引物为:
CIPK9 forward primer: 5’-GTGATCAAGTCCTGCGTCACAA-3’ ，
CIPK9 reverse primer: 5’-CTACCTCAAACACCTCAGTGGCTAC-3’ 。
[0019]PCR 反应体系(20μ L)为:2μ L 1xPCR BufferU.2μ L Mg2+ (25mM/L)、0.4 μ L10xdNTP、0.1 μ L Tag (5.0U/ul)、lμ L Forward primer (10uM/L)>I μ L Reverse primer(10uM/L)U μ L Template cDNA (lOOng/ul )、13.3 μ L ddH20。
[0020]PCR反应程序为:95°C变性5min，55°C退火30s，72°C延长lmin，35个循环。
[0021](4)目的基因5’端和3’端序列克隆
利用01igo7设计RACE引物，进行￠77--因3’末端和5’末端的克隆，切胶回收获得目的片段，然后与载体PMD19-T连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，测序和序列分析，确定获得因的两个末端序列后，拼接得到因全长序列。RACE引物，PCR反应体系和程序如下所示。克隆结果如图2-B~G所示。
[0022]RACE 引物为:
CIPK9-.V race primer A:5’ -GTGGATGCCGTTTTCAATGACTCGAAGG-3’，
CIPK9-.V race primer B:5’-CCTCGAGAACTTATTTGAGAAGCAGACGGG-3’，
CIPK9-.V race primer C 5’-GAGAAGCAGACGGGTCTTGTGAAGCGAG-3’，
CIPK9\^ race primer A 5’ -CCGCACTTGCTGCGACAGCGCAC-3’， CIPK9-.W race primer B 5’ -TCTGTTCGACCATCTTGTGACGCAGGACTTG-3 ’，
CIPK9\^ race primer C 5’ -CTCCGGTCTCAATCTTGGCGAATTTCACC-3’，
RACE A item 的 PCR 反应体系(20 μ L)为:2 μ L 1^ PCR BufferU.2μ L Mg2+ (25mM/L),0.4μ L 1(Τ dNTP、0.1 μ L Tag (5.0U/ul) U μ LCIPK9:3V 5，race primer A(10uM/L)、I μ LlCT Universal Primer A Mix> IuL Template cDNA (lOOng/ul )、13.3 μ L ddH20。
[0023]RACE A item 的 PCR 反应程序:95°C变性 5min，67°C/69°C退火(3，end/5’ end)30s，72°C延长(3，end/5，end) 40s/35s，35 循环。
[0024]RACE B 和 C item 的 PCR 反应体系(20 μ L)为:2 μ L 1^ PCR BufferU.2 μ L Mg2+(25mM/L),2y L dNTP、0.4 μ LKode、0.6 μ L Universal Primer A Mix、0.6 μ LCIPK9:3，/5’race primer B/C、I μ LDiluent of race A product、12.2 μ L ddH20o
[0025]RACE B 和 C item 的 PCR 反应程序:94 °C 预变性 2min，98 °C 变性 10s，67 °C /66 °C /68 °C /68°C 退火(3，race B /3，raceC/5，raceB/5，raceC) 30s，68 °C 延长(3，end/5，end) 40s/35s, 35 循环。
[0026](5)基因全长获取
根据￠77--因全长序列，利用01igo7设计全长引物，克隆得到全长基因，切胶回收目的条带，与PMD19-T连接后转入大肠杆菌，经过测序分析，确定￠77--因的ORF是完整的。唐古特白刺的￠7/--因全长为1735bp，命名为#(677--具体序列如SEQ IDN0.1所示,所表达的蛋白序列如SEQ ID N0.2所示,包括443个氨基酸的开放阅读框(0RF)。全长基因克隆的引物，PCR反应体系、程序以及克隆结果具体如下:
全长基因克隆引物为:
CIPK9:wl forward primer:5' - GGATCCATGAATAAGGTACCGGGGAC-3’，
CIPK9:wl reverse primer:5' - CCCGGGCGTGATTTCTTTACAGC-3’，
Forward restricted site of BamHI:5' -G Λ GATCC-3',
Reverse restricted site of SmaI:5' -CCC Λ GGG-3',
PCR 反应体系(20 μ L)为:2 μ L 1(TPCR BufferU.2μ L Mg2+ (25mM/L)、0.4 μ LICT dNTP、0.1 μ L Tag (5.0U/ul)、I μ LForward primer (10uM/L)、I μ LReverse primer(10uM/L)U μ L Template cDNA (lOOng/ul )、13.3 μ L ddH20。
[0027]PCR 反应程序:95°C变性 5min，63°C退火 30s，72°C延长 lmin30s，35 循环。
[0028]因片段克隆，5’RACE，3’RACE以及因全长克隆的PCR结果如图2所示，其中，图2-A为从白刺叶片中克隆到的￠77--因片段；B为￠77--因3’ RACEA引物克隆产物；C为￠77--因3’ RACE B引物克隆产物；D为￠77--因3’ RACE C引物克隆产物；E为￠77--因5’RACE A引物克隆产物；F为￠77--因5’RACE B引物克隆产物；G为￠77--因5’ RACE C引物克隆产物；H为￠77--因全长引物克隆产物。
[0029]实施例2基因功能验证
构建35S:67/--表达载体，转入野生型哥伦比亚拟南芥中，观察唐古特白刺NtCIP纖因是否能增强拟南芥的耐盐性，比较转基因拟南芥和野生型拟南芥的表型差异，推测唐古特白刺￠7/--因的功能。
[0030]I)载体的构建
本发明所用大肠杆菌菌株为E.coli JM109 (宝生物工程(大连)有限公司购入);表达载体为 pBI 121 (B1vector C0.，LTD 公司购入)。
[0031]具体过程如下:
1.通过PCR向￠77--因片段上下游分别添加BamHI和SmaI酶切位点，PCR体系及反应条件同全长扩增，引物分别是:
NtCIPK9F+BamH:5’ -CGCGGATCCATGAATAAGGTACCGGGGAC-3’，
NtCIPK9R+Sma1:5’ -TCCCCCGGGACGTGATTTCTTTACAGCTTTTTC-3’，
2.PCR产物测序正确后，在T4连接酶的作用下，可进行载体的构建。使用BamHI和SmaI内切酶进行酶切反应处理空的PBI 121表达载体。
[0032]双酶切反应体系(20μ L)为:2 μ L 1XK buffer,0.5 μ LBamH I,0.5 μ LSmaI,I μ g回收产物、ddH20补足20 μ L。
[0033]37°C水浴，酶切4h。加入1X终止液停止酶切反应，1%琼脂糖凝胶电泳进行分离。用AxyPr印DNA Gel Extract1n Kit (AXYGEN)进行回收并纯化酶切产物，溶于20 μ L的TE缓冲液中。
[0034]3.检测所回收的酶切产物浓度，按连接体系加入各试剂(目的片段分子数:载体分子数=3:1~5:1)，161:过夜连接。254 1^连接反应体系为:2.54 1^ Τ4 DNA ligase buffer(10X )、5 μ L酶切的表达载体、15.5 μ L酶切的PCR产物、2 μ L Τ4 DNA ligase、ddH20补足25 μ Lo
[0035]4.连接产物转化大肠杆菌JM109超感细胞，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜；使用全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，之后用AxyPr印PlasmidMiniprepKit (AXYGEN)提取质粒进行酶切验证。同时测序检测载体构建过程中是否发生突变或者缺失现象。构建表达载体如图3所示。
[0036]2)农杆菌的转化
1.本发明使用的农杆菌菌株为GV3101 ( B1vector C0.，LTD公司购入)。采用的是液氮冻融法将构建好的pBI 121^^677--表达载体转入农杆菌。具体过程为:1)冰浴融化GV3101感受态细胞，加入至少10ng回收纯化的表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴20~30 min ；2)液氮速冻I min，37°C热击3 min，迅速置于冰上l~2min ;3)加入800 μ L无抗生素的LB培养基，28°C，200 rpm复苏3.5h;4) 4000 rpm离心3 min，吸掉培养基；5)混匀剩余菌液，涂抹于添加50 mg.L—1卡纳霉素的固体LB培基上；6) 28°C倒置培养30~48h ；7)PCR检测阳性克隆，4°C保存备用。
[0037]2.待种植的健康状态的拟南芥生长至开花。将PCR检测的阳性克隆，摇菌至0D_0.8时,进行拟南芥花器官浸泡转化。具体过程如下:1)将菌液5000 rpm, 5 min离心，收集菌体，用5%蔗糖溶液悬浮；2)在浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.05%(500 μ L/L)，晃出泡沫；3)将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15~30 sec,期间轻轻晃动,4)将浸过的拟南芥平躺在托盘里，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h ；5)揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水。
[0038]3.收获干燥的种子，将Tl代种子进行筛选，筛选培养基:1/2MS+卡那霉素10mg/L+头孢200mg/L。筛选结果如图4所示。
[0039]4.再移至土里继续培养，收取Tl代拟南芥种子后，将种子继续进行筛选获得T2代植株。然后，收取T2代拟南芥植株后，将种子继续进行筛选，获得纯合筛选出T3代纯合株系O
[0040]3 )转NtCIPKd基i因拟南芥抗盐性试验
1.选择3个株系的纯合转基因拟南芥种子各50粒分别放在含有OmM，10mM和150mMNaCl的1/2MS培养基上萌发，种子春化后放于光照下，5天后统计子叶萌发率，三个过表达纯合转基因株系和野生型拟南芥株系分别命名为0Χ-1，0Χ-2，0Χ-3和WT。三次重复试验同时进行。萌发率统计结果如图5所示。
[0041]统计结果显示，在正常条件下相同时间内(OmM NaCl处理)，转因的三个过表达株系种子的子叶萌发率与野生型拟南芥种子的子叶萌发率无明显差异。在10mM盐处理条件下，过表达株系0Χ-1，0Χ-2和0X-3分别比野生型的子叶萌发率高15.3%，11.3%和14.6%，呈极显著性差异(P〈0.01)。在150mM盐处理条件下，三个过表达株系分别比野生型高139.2%, 60.7%和296.4%，其中0X-3与野生型之间差异极显著(P〈0.01)。从萌发实验结果可知，可以增强拟南芥种子萌发对盐的耐受性。
[0042]种子在含盐培养上萌发生长两周后，观察转基因植株和野生型植株的表型。三次重复试验同时进行。生长表型如图6所示。观察转基因拟南芥和野生型拟南芥的生长状态，可知#(677--正常条件下不会影响植株的生长发育，在10mM和150mM盐处理条件下，可以增强植物对盐的耐受性，表现出比野生型更好的生长状态。
[0043]2.将三个纯合株系拟南芥种子和野生型拟南芥种子正常萌发生长10天后，转移到分别含有OmM (未处理组)和150mM NaCl (处理组)的培养基上，生长10天后，观察其生长状态，并统计生物量。三次重复试验同时进行。试验植株生长表型如图7所示；试验植株生物量统计结果如图8、9和10所示，其中每个数据均来自于6个以上平行试验的平均值。
[0044]盐处理拟南芥幼苗的实验结果显示，不会影响植株的正常生长，在盐处理条件下可以增强幼苗的抗盐能力。由统计数据可知，在正常生长条件下(OmM NaCl处理)，转基因株系OX-1，0X-2和0X-3的叶片数量分别比野生型多27.9%，16.3%和27.9%，呈差异显著性(P〈0.05);在正常生长条件下，转基因株系OX-1，0X-2和0X-3的侧根数量分别野生型多-22.9%, 4.9%和-18.0% ;转基因株系0X_1，0X-2和0X-3的主根长度分别比野生型长-12.8%, 21.5%和20.5%，其中0X-2与野生型之间差异显著(P〈0.05);转基因株系OX-1,0X-2和0X-3的植株整体干重比野生型重23.5%，13.0%和78.3%，其中OX-1与野生型之间差异显著(P〈0.05)。在150mM NaCl处理条件下，转基因株系0X_1，0X-2和0X-3的叶片数量分别比野生型多-4.1%, 4.1%和8.2% ;转基因株系0Χ-1，0Χ-2和0X-3的侧根数量分别野生型多20.5%, 44.1%和38.2%，其中0X-2与野生型之间呈差异显著性(P〈0.05);转基因株系OX-1，0X-2和0X-3的主根长度分别比野生型长61.1%，148%和70.3%，其中0X-2和0X-3与野生型之间呈差异极显著性(P〈0.01);转基因株系OX-1，0X-2和0X-3的植株整体干重比野生型重157.7%，76.3%和48.4%，OX-1和0X-2与野生型之间呈差异极显著性。综上分析可知，在盐环境中，转#(￠7/--因的拟南芥植株与野生型相比，叶片数多，侧根数量多，主根长度长以及植株整体干重高，进一步证明了 #(￠7/--因可以增强拟南芥耐盐性的功倉泛。
[0045]3.拟南芥种子萌发一周后，将转基因株系和野生型拟南芥各20株转移到泥炭土中生长,每盆种一株,两周后,配制200mM的盐水进行浇灌处理，处理周期为4天。三次重复试验同时进行。
[0046]盐水浇灌I天后，野生型拟南芥叶片轻微萎焉，转基因拟南芥为发生明显变化；第2天后，野生型叶片明显萎焉，转基因拟南芥叶片开始卷曲；第3天后，野生型拟南芥叶片出现枯死斑点，转基因拟南芥开始明显萎焉；第4天后，野生型拟南芥枯死，转基因拟南芥明显萎焉；其表型如图11所示。盐水浇灌处理4天后，用清水恢复，并观察后期生长。
[0047]200mM盐水处理4天后的拟南芥表型如图12所示，其中，A为清水恢复盐处理拟南芥I天后的表型图；B、C为清水恢复10后的表型图,可知,转基因拟南芥在清水恢复后,仍正常生长，并开花结果；野生型拟南芥在盐水浇灌处理4天后无法恢复，最终死亡。盐水浇灌试验结果进一步证明了财^/7%功曾强植株耐盐性的功能。
【权利要求】
1.一种唐古特白刺因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述的唐古特白刺因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
3.权利要求1所述的唐古特白刺#(￠7/--因在提高植物耐盐性中的应用。
4.含有权利要求1所述的唐古特白刺因的载体。
5.含有权利要求1所述的唐古特白刺#(￠7/--因的宿主细胞。
【文档编号】C12N9/12GK104498514SQ201510026143
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月20日 优先权日:2015年1月20日
【发明者】成铁龙, 鲁路, 陈金慧, 施季森, 周艳威, 郑晨, 盛宇, 史胜青, 杨秀艳, 李霞 申请人:南京林业大学