用于从浓缩酵素直接接种的方法和相关装置与流程

食品加工工业，特别是奶制品工业中的接种对于生产产品来说至关重要。实际上，最终产品的工业和质量性能水平取决于所用酵素的性质和效率以及它们的添加方法。

从文献WO 200170935和EP688864已知对于乳的接种在活化培养物前获得也称作起子培养物的预培养物以缩减迟滞期。专利申请WO 99/09838描述了用于制备其中起子培养物可呈冷冻形式的新鲜产品的方法。

待接种的液体培养基与冷冻的浓缩酵素的发酵意味着使用它们的制造商对于接种阶段和发酵阶段不得不以分批模式作业。实际上，由于包装的形式和类型通常为袋或罐，因此一定会将微生物直接添加到发酵槽中。

使用浓缩酵素的其它系统需要存在在冷冻酵素的情况下用于酵素的中间解冻或在干燥酵素的情况下用于稀释的附加容器，这增加了污染风险。

这些再活化和/或稀释系统具有需要在接种阶段上游处理浓缩酵素的缺点，由此产生污染风险。

申请人意外地发现可以通过直接接种引入冷冻的浓缩酵素。

或者，可通过直接接种来引入冷冻干燥的浓缩酵素。

这允许在不必中断用于终产品的生产的发酵过程的情况下连续接种。由此使得大幅提高发酵产物的生产速度成为可能。

因此，本发明主题是连续接种食品、特别是奶制品与浓缩酵素的方法。

根据一个一般特征，所述方法包括以下步骤：

-在对含有冷冻的浓缩酵素的容器进行操作的温度控制室如制冷器中将冷冻的浓缩酵素解冻，或将冷冻的干燥酵素再水合。

将所得的浓缩酵素从所述容器连续地注入到待接种的液体流中。

本发明的主题还是用于向待接种的液体连续接种酵素的设备，其中所述酵素来源于冷冻或冷冻干燥的浓缩酵素，所述设备包括用于使包含冷冻的浓缩酵素的容器解冻的温度控制转化室；或转化室-在该转化室中使所述冷冻干燥的酵素在所述容器中再水合；设有支撑工具以及至少一个称量装置的接种室，所述支撑工具用于安装至少两个即用型酵素的容器，所述称量装置能够连续地测定被排空的容器中的剩余体积，所述设备进一步包括连接所述容器与用于连续供给所述待接种的液体的回路的注入回路，所述注入回路包括允许从一个容器转换到另一容器的阀和用于调节液体形式的酵素的流速的工具。

在一个实施方案中，含有冷冻的浓缩酵素的容器在其解冻前在-20℃到-70℃的温度储存。

在另一实施方案中，含有冷冻干燥的浓缩酵素的容器在再水合前在-20℃到室温的温度储存。

所述容器可以是刚性的、可变形的、柔软的。优先地，所述容器是柔软的。

有利地，一旦放置于接种室中，就连续地称量含有即用型浓缩酵素的容器以测定在排空期间所称量的容器中液体酵素的剩余体积。

所述酵素的注入通过与用于连续供给待接种的液体的回路连接的连接件实施。这些连接工具可以是在管线中的待接种的液体每次通过之后可被清洁和灭菌的注入回路的管，或设有暂时连接工具例如通过夹子紧固或卡扣紧固的有点柔性的管道。

表面的微生物污染通过食品转化期间可能的食品污染对健康构成危险。例如，当生物膜(即彼此附着并且附着到表面的微生物的多细胞群体)中出现细菌孢子时，就是这样。实际上，细菌孢子展现出显著的阻抗特征并且污染设备和连接管道的表面。对于工业制造商来说，生物膜的去除在多数情况下需要使用过度的卫生程序以确保转化的食物的良好保存，并且避免食物污染。

因此，可选择地，与用于连续供给待接种液体的回路连接的连接工具是一次性的，以确保完全无菌性和易用性。这些连接工具还可根据所用的酵素而更换。

优选地，解冻后或再水合后的容器放置于压力高于大气压力的接种室中。

因此，在本发明的一个实施方案中，借助于中性无菌气体对含有浓缩酵素的接种室加压以在该室中尽可能维持恒定压力，由此有利于浓缩酵素的流动的精确性。此外，所述容器中的超压限制了受外部空气污染的可能性。通常100g/cm²的超压允许更均匀的计量。

在本发明的一个实施方案中，数个容器呈平行排列放置在接种室中，使得当它们中的一个容器处于被排空的过程中时，至少另一个含有即用型浓缩酵素的容器处于备用状态。

优选地，借助于该过程，将计量量的即用型浓缩酵素连续地引入待接种的液体流中。然后将该接种的液体放置于发酵罐、用于生产发酵产品的罐或发酵装置中，所述发酵罐、用于生产发酵产品的罐或发酵装置直接放置于欲销售的容器中。在奶制品的情况下，例如，发酵单元可为奶制品罐。

这种连续接种具有改进最终产品的质量的规律性的作用。因此，本发明允许直接在待接种的液体的管线中从冷冻或冷冻干燥的浓缩酵素的容器直接使用先前冷冻或冷冻干燥的浓缩酵素而不涉及有风险的中间阶段。任何中间处置阶段实际上都会不可避免地导致偶然污染的风险，这对于用于生产发酵产品的全部后续过程是有害的。此外，刚好在凝乳前直接接种到液体的管线中使得限制成熟区上的任何噬菌体增殖和生物膜产生成为可能。

优选地，用于调节液体形式的酵素的流速的工具放置在用于连续供给待接种的液体的回路上游。这些工具可为泵。

容器中的冷冻的浓缩酵素的解冻时间是可变的，取决于存在于容器中的产品的量。

温度控制室中的冷冻的浓缩酵素的解冻时间为5到30小时，优选约12小时。

为了确保浓缩酵素的均匀融化且不产生将有害于生产过程的后续步骤的正确进程的任何大的热冲击，对转化室中的温度进行调节。

优选地，温度控制室中的空气的温度为0到15℃，优选4℃。

优选地，在解冻期间搅拌冷冻的浓缩酵素以使它们均质化并且避免不完全融化的聚集体。

容器中的冷冻干燥的浓缩酵素的再水合时间是可变的，取决于存在于容器中的产品的量。它通常为30分钟到2小时，优选约1小时。

优选地，在再水合期间搅拌冷冻干燥的浓缩酵素以使它们均质化并且避免不完全再水合的聚集体。

为此目的，在所述设备的一个实施方案中，温度控制转化室可包括用于搅拌所述容器的工具。

一旦放置在接种室中，即用型液体酵素维持在可为2℃到12℃的相对较低的温度或与维持酵素的功能性相容的任何其它温度。这使得有可能尽可能限制细菌代谢的恢复并且保证随时间的推移不变的接种质量。

在所述设备的一个实施方案中，接种室可包括制冷工具和用于维持压力高于大气压力的工具。

所述设备的接种室可有利地包括在排空期间使至少一个容器均质化的工具。

因此，在排空期间浓缩酵素的混合物的均质化使得有可能确保构成酵素的细菌培养物的混合物的均匀性。

优选地，均质化步骤包括混合。

冷冻或冷冻干燥的浓缩酵素可被包装和储存在具有差不多大的容量的包装中，所述容量在200g到几千克的范围。必须在严格的卫生条件下实施转移以避免任何有害于全部后续发酵过程的污染。

所用浓缩酵素由细菌构成，所述细菌用于生产奶酪，例如，软奶酪、熟的压制奶酪、生的压制奶酪、旋制(spun-curd)奶酪和发酵乳，所述发酵乳例如搅拌型或凝固型、调味的或天然的酸奶、饮用酸奶、法式酸奶油(crème)和清爽干酪(fromages frais)，以及还用于生产其它发酵产品，例如，酒。

所用的细菌可以是嗜温性微生物，其最佳生长温度是25℃到35℃。在常用的嗜温性微生物中，可特别提到例如乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳脂明串珠菌(Leuconostoc cremoris)、乳酸乳球菌丁二酮变种(Lactoccus lactis biovar.diacetylactis)、奶酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、坚忍链球菌(Streptococcus durans)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)。

还可使用嗜热性微生物，即，生长温度可为35℃到45℃的生物体。可特别提到例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)或任何其它适当的微生物。

同样，可使用双歧杆菌型的严格厌氧微生物，包括两歧双歧杆菌(Bifidus bifidum)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis))。

还可使用丙酸细菌，例如瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、费氏丙酸杆菌谢氏亚种(Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii)等。

所用的细菌可为酒细菌，例如Oernococcus oeni(酒明串珠菌，Leuconostoc oenos)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)或片球菌(Pedicoccus sp.)。

还可使用酵母科(Saccharomycetaceae)的酵母或霉菌例如青霉菌属(Penicillium)或地霉属(Geotrichum)。

即用型浓缩酵素或浓缩的细菌培养物的接种水平根据所考虑的技术和产品而变化。通常，这一比例是基于待接种的培养基的总重量0.005％到0.025％。

通常，在生产时，使用液氮冷冻酵素，然后在-20℃到-70℃的温度储存酵素。

取决于冷冻的酵素的冷冻温度，冷冻的酵素在使用前可储存一段时间：储存在-20℃的情况下长达1个月、储存在-40℃的情况下长达6个月、以及储存在-45℃的情况下长达12个月。

或者，冷冻干燥的酵素通过冷冻的水从冷冻的培养物中升华而被干燥，所述升华是通过降低周围环境中的压力使水不经液相而直接蒸发成气体来实现的。为了本发明的目的，表述冷冻干燥、冻干和低温干燥具有相同的意义。

冷冻的酵素一般在-20℃储存。在这种情况下，保存期可长达24个月。它还可以在+5℃储存，但在这种情况下，其保存期为约6周。

在阅读本发明实施方案和不同实施方式的以下描述之上，其它的目的、特征和优点将变得明显，所述实施方案和不同实施方式仅以非限制性的示例给出，并且参照附图给出。

-图1示意性地图解说明根据本发明的一种实施方式的方法的各步骤的流程图，

-图2示意性地图解说明根据本发明的第二实施方式的方法的各步骤的流程图，

-图3示意性地图解说明根据本发明的第一实施方案，

-图4示意性地图解说明根据本发明的第二实施方案，

-图5表示在解冻后SSC100培养物的培养基在40℃C的酸化随制冷器中的解冻时间(0h、24h、48h、72h或96h)变化的监测曲线，

-图6表示在解冻后STI06培养物的培养基在37℃C的酸化随制冷器中的解冻时间(0h、24h、48h、72h或96h)变化的监测曲线，

图1中示意性地表示根据本发明的一个实施方案的接种方法的各步骤的流程图。

在接种前，将浓缩的酵素冷冻。然后可将它们掺合并包装在容器中。

为此，在第一步骤E01中，用冷冻的浓缩酵素无菌填充容器。容器可为能够保持由细菌构成的浓缩酵素的差不多大的容量的包装，所述容量在200g到几千克的范围，所述细菌用于生产奶酪、发酵乳和其它发酵产品。

然后，在步骤E02中，仍在保持无菌性的同时将容器的孔密封，以获得填充有浓缩酵素的气密封的容器。

在随后的步骤E03中，这些冷冻的酵素在-20℃到-70℃的温度储存数天到数月的相对较长时间。

有可能利用不同的容器重复步骤E01到E03以获得多个包含相同的冷冻的浓缩酵素的容器。

对于接种来说，在步骤E04中，冷冻的酵素在先前保持冷冻的容器的一个容器中原位解冻。“原位”意指储存在容器中的酵素在不转移的情况下在同一容器中转化成液体浓缩酵素。通过作用于容器，更特别地作用于含于容器中的冷冻酵素的制冷工具实施该解冻步骤。在所呈现的实施方案中，在解冻期间搅拌冷冻的浓缩酵素，以均匀地分布热并且避免不完全融化的聚集体。

在随后的步骤E05中，使已经历解冻的容器与一次性注入回路连接。

在随后的步骤E06中，将与注入回路连接的容器安装在接种室中并且打开所述容器。

然后在步骤E07中排空解冻的容器。在排空期间，用中性无菌气体对接种室加压以尽可能维持其中的恒定压力，且由此有利于浓缩酵素的流动的精确性。解冻的液体酵素的温度还保持在2℃到12℃，以尽可能限制细菌代谢的恢复并且保证随时间的推移不变的接种质量。

在被排空的同时，在步骤E08中定期称量所述容器，以测定残留于容器中的酵素的量。

接下来，在步骤E09中，将前一步骤中测量的重量与对应于空的或几乎空的容器的重量的阈值进行比较。另外，取决于容器的重量并且因此取决于残留于该容器中的酵素的量，经由环路BCL1通过继续步骤E07中的容器排空操作来继续该操作，或在步骤E10中用满的解冻的容器交换几乎空的容器。在排空先前容器期间或在所述先前容器的排空开始前，可能已起始满的容器的解冻，例如在所述先前容器解冻开始之后使用另一解冻室起始满的容器的解冻。

通过环路BCL2来实施排空容器、称量和任选地根据剩余酵素的体积更换容器的这些步骤。

接种室中平行排列的数个容器和步骤E10交换待排空的容器使得有可能获得连续接种过程，其中将计量量的解冻的浓缩酵素连续地引入待接种的液体流中，其中然后可将所述接种的液体引入发酵罐、用于生产发酵产品的罐或用于发酵的装置中，所述发酵罐、用于生产发酵产品的罐或用于发酵的装置直接位于欲销售的容器中。

这种连续接种导致改进最终产品的质量的规律性。

图2中示意性地表示根据本发明的第二实施方案的接种方法的各步骤的流程图。

在接种前，冷冻干燥浓缩的酵素。然后可将它们掺合并包装在容器中。

为此，在第一步骤E010中，用冷冻干燥的浓缩酵素无菌填充容器。容器可为能够维持由细菌构成的浓缩酵素的差不多大的容量的包装，所述容量在200g到几千克的范围，所述细菌用于生产奶酪、发酵乳和其它发酵产品。

然后，在步骤E020中，仍在维持无菌性的同时将容器的孔密封，以获得填充有冷冻干燥的浓缩酵素的气密封的容器。

在随后的E030中，这些酵素在-20℃的温度储存数天到24个月的相对较长时间。

有可能利用不同的容器重复步骤E010到E030以获得多个包含相同的冷冻干燥的浓缩酵素的容器。

对于接种来说，在步骤E040中，使冷冻干燥的酵素在先前贮存的容器中原位再水合。“原位”意指储存在容器中的酵素在同一容器中转化成液体浓缩酵素。在这种情况下，在容器本身中实施再水合步骤，而不从另一容器转移酵素。

在优选的实施方案中，含有酵素的容器包括形成双隔室容器的包装，包含冷冻干燥的酵素的第一隔室通过易碎膜与包含无菌液体的第二隔室分开，其中一旦两个室之间的易碎膜破裂，使酵素再水合。

在所呈现的实施方案中，在再水合期间搅拌浓缩酵素，以避免不完全溶解的聚集体。

在随后的步骤E050中，将已经历再水合的容器与一次性注入回路连接。

步骤E060到E100与图1的接种过程的步骤相同。

图3中示意性地表示根据本发明的第一实施方案的接种设备1。设备1包括解冻室2，所述解冻室2包括根据图1中所图解说明的方法的步骤E04能够解冻冷冻的浓缩酵素的容器Cfc的制冷器。解冻室2包括用于在解冻期间搅拌酵素的工具，所述工具未表示于图中，用于将酵素均质化。

设备1还包括接种室3。该图中所图解说明的接种室包括两个各自能够支撑解冻的浓缩酵素的容器Cfc1和Cfc2的支撑工具4，例如垂直连接装置或用于扣住所述容器的装置，包含一组用于使所述容器保持在适当位置的板和/或钩。某些类型的浓缩酵素一旦被解冻有可能在接种室3中储存几小时以及长达24小时，但优选4小时到8小时，而对细菌代谢的恢复或对构成浓缩酵素的细菌的活性没有特别影响。

此外，设备1的接种室3包括用于对容器进行称量的工具5以推断排空期间剩余酵素的体积(步骤E07到E09)。接种室3还包括用于使位于容器中的酵素均质化的均质化工具6。作为非限制性示例，可使用多个板，每板施加随通过时间变化的不同压力。可根据需要连续地或间歇地实施均质化。

另外，接种室3可包括未表示于图2中的空调工具。因此，在整个接种持续时间内可在2℃到12℃的温度冷却接种室3。

接种室3可包括多个用于支撑解冻的浓缩酵素的容器Cfc的工具，所述Cfc容器通过注入回路7与用于连续供给待接种的液体的回路10连接。在图2中所图解说明的实施方案中，注入回路7包括通过第一回路部分12与第一容器Cfc1连接，通过第二回路部分13与第二容器Cfc2连接并且通过第三回路部分14与供给回路10连接的阀8。阀8由此使得有可能更换容器Cfc1或Cfc2而不中断注入过程。

注入回路7还包括安装在第三回路部分14上从而在阀8的下游的泵9。泵9用于调节在接种室3中的适当位置的容器Cfc1或Cfc2的输入液体浓缩酵素的流速。所用的调节泵(例如泵9)可根据被接种的培养基的主回路的流速成比例；通常在奶品工业中，对于2-10000l/小时的设备来说，泵流速在0.1l/小时到4l/小时的范围，对于15000l/小时到30000l/小时的设备来说，高达0.75l/小时到12l/小时的范围。

注入回路7还可包括连接工具15，所述连接件位于接种室3中的容器Cfc1和Cfc2的水平处以及位于回路部分14与供给回路10之间的接合处的水平处。

这些连接工具15使得有可能更容易地对注入回路7进行灭菌和清洁。在另一实施方案中，这些连接工具使得有可能在例如改变接种到用于供给待接种的液体的管10的酵素的组成期间更换注入回路7的部分12、13和14以用其它无菌部分替换它们。

接种室3还可包括未表示于图中的用于检查接种室3内部的压力的工具。

设备1还包括与用于供给待接种的液体的回路10连接的发酵单元11。该液体的接种借助于供给回路10的管上的分接头实施，使得有可能连接注入回路7的第三回路部分14。

在这种情况下，发酵单元11以发酵罐的形式再现。当然，还有可能设想，发酵单元11是直接位于欲销售的容器(例如奶制品罐)中的用于生产发酵产品的罐或用于发酵的装置。

被解冻酵素的定量是发酵单元接种过程的必需部分。

图4中示意性地表示根据本发明的第二实施方案的接种设备1。

设备1包括转化室2，所述转化室2包括含有根据图2中所图解说明的方法的步骤E040再水合的浓缩酵素的容器Cfd。转化室2包括用于在再水合期间搅拌酵素的工具，所述工具未表示于图中，用于使酵素均质化。

设备1还包括接种室3。该图中所图解说明的接种室包括四个能够支撑再水合的浓缩酵素的容器Cfd1和Cfd2的支撑工具4，例如垂直连接装置或用于扣住所述容器的装置，包括一组用于使所述容器保持在适当位置的板和/或钩。某些类型的浓缩酵素一旦再水合有可能在接种室3中储存几小时以及长达24小时，但优选4小时到8小时，而对细菌代谢的恢复或对构成浓缩酵素的细菌的活性没有特别影响。

与图3中的部件相同的部件分配有相同的附图标记。

无论本发明的实施方案怎样，接种设备均使得有可能从接种到发酵单元的浓缩酵素获得连续且精确的少量浓缩酵素的在线流。因此，本发明允许直接在待接种的液体的管线中从浓缩酵素的容器直接使用浓缩酵素，而不涉及有风险的中间阶段。任何中间处置阶段实际上都会不可避免地导致偶然污染的风险，这对用于生产发酵产品的全部后续过程是有害的。此外，刚好在凝乳前直接接种到液体的管线中使得有可能限制任何可能的噬菌体增殖。

实施例1：监测使用制冷器装置解冻后培养基的酸化

将酵素SSC-100(具有缓慢酸化的嗜热链球菌)和STI06(具有快速酸化的嗜热链球菌)包装在5升的无菌袋中，即2.5kg储存在-40℃或-20℃温度的冷冻颗粒形式的酵素。

将小袋放置在制冷器中。

使先前储存在-40℃的酵素经冷藏12小时以实现完全融化。

在整个解冻过程中将小袋放置在搅拌器上以确保浓缩酵素的均匀融化。

对在99℃加热30min的以9.5％固体含量从脱脂乳粉复原的乳实施培养基酸化的测试。对于成熟温度为40℃的SSC-100，接种剂量为0.01％；对于成熟温度为37℃的STI06，接种剂量为0.01％。

每种测试菌株的酸化活性的监测结果在下文给出，为被接种的培养基的pH随时间而变化的变化曲线，所述测试菌株先前已在制冷器装置中解冻(图5和6)。

具体地说，图5表示在制冷器中解冻后随制冷器中的时间而变化的SCC-100培养物的培养基的酸化的监测曲线，图6表示在制冷器中解冻后随制冷器中的时间而变化的STI06培养物的培养基的酸化的监测曲线。

在每个图中，标记为C1的第一曲线对应于针对没有预先解冻的酵素的培养物的对照，并且曲线C2到C5表示分别在24小时、48小时、72小时或96小时的解冻时间期间的解冻后获得的曲线。

对于多种被测试菌株的酸化监测允许推断出酵素在制冷器中的解冻时间对酸化活性性能水平没有显著影响。

因此，证实有可能使多种类型的冷冻浓缩细菌培养物在2℃到12℃温度解冻几小时，而对细菌代谢的恢复以及对所考虑的酵素的活性、特别是酸化活性没有特别影响。